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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201511015513.0 (22)申请日 2015.12.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105532458 A (43)申请公布日 2016.05.04 (73)专利权人 云南奕华农业生物有限公司 地址 677300 云南省临沧市双江县勐勐镇 忙品小学 (72)发明人 李永华 李聪颖 (74)专利代理机构 云南派特律师事务所 53110 代理人 张怡 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) 审查员 陈仕高 (54)发明名称 西南远。
2、志的组织培养方法 (57)摘要 本发明涉及植物组织培养领域， 主要涉及的 是西南远志的组织培养方法。 本发明所述的西南 远志的组织培养方法由以下步骤组成： 一、 外植 体的选择； 二、 外植体的消毒； 三、 初始诱导培养； 四、 原球茎增殖培养； 五、 原球茎分化培养； 六、 壮 苗和生根培养。 本发明用少量的种子作为外植 体， 快速大量的培育出西南远志种苗。 采用无汞 消毒法进行灭菌处理， 即保证了外植体无菌污 染， 提高其培养成活率， 又可以避免汞污染； 在培 养基中加入维生素C、 核黄素为抗氧化剂， 减轻了 外植体的褐化和玻璃化， 提高了外植体的成活 率。 本发明操作简单， 成本低廉， 。
3、成活率高、 生根 率高。 权利要求书1页 说明书3页 CN 105532458 B 2017.09.29 CN 105532458 B 1.一种西南远志的组织培养方法， 其特征在于由以下步骤组成： 一、 外植体的选择： 选择健壮的野生西南远志， 用其种子作为外植体； 二、 外植体的消毒： 先用自来水冲洗外植体812min， 然后采用无汞消毒法用6075 的乙醇溶液消毒3060秒， 用无菌水冲洗35遍， 按重量比例1:22.5将高锰酸钾和甲醛 溶液放入玻璃干燥器的底层， 随即把外植体放入玻璃干燥器隔层瓷板上， 盖好盖子熏蒸消 毒12小时， 再用浓度为36的次氯酸钠消毒1015min， 消毒完成后。
4、， 再用无菌水冲洗4 6遍； 三、 初始诱导培养： 把外植体接种于下列经改良的无菌诱导培养基中， 所述的改良的无 菌诱导培养基为： 在每升KC培养基中加入KT 1.01.5mg、 NAA 0.40.8mg、 VB 2 520mg、 活性炭11.5g、 重量百分比浓度为1015的马铃薯汁100150g， 在温度2528、 光照 强度100015001x、 光照时间为1012个小时的条件下， 培养5565天， 形成原球茎； 四、 原球茎增殖培养： 将上述的生长良好的原球茎转接入下列增殖培养基中， 所述的增 殖培养基为： 在每升KC培养基中加入NAA 1.52.0mg、 KT 0.50.8mg、 V。
5、C 1030mg、 VB 2 5 20mg、 重量百分比浓度为1015的马铃薯汁100150g、 蔗糖30g、 活性炭35g、 琼脂6 8g,在pH值为57.0条件下培养， 培养周期： 5565天， 培养温度： 2528， 光照时间:10 24小时/天， 光照强度100015001x； 五、 原球茎分化培养： 将经过步骤四增殖培养的原球茎转入下列分化培养基中， 所述的 分化培养基为： 在每升KC培养基中加入NAA 0.81.0mg、 KT 0.10.5mg、 VC 1030mg、 VB 2 520mg、 活性炭35g、 重量百分比浓度为1015的香蕉汁100150g、 琼脂68g， 在温 度2。
6、528、 光照强度100015001x、 光照时间1012小时条件下培养5565天， 得到分化 苗； 六、 壮苗和生根培养： 将分化苗转入下列生根壮苗培养基中， 所述的生根壮苗培养基 为： 在每升1/2KC培养基中加入NAA 0.81.0mg、 VC 1030mg、 VB 2 520mg、 活性炭35g、 重量百分比浓度为1015的香蕉汁100150g、 琼脂68g， 在温度25-28、 光照时间10 12小时、 光照强度100015001x条件下培养5565天， 得到生根苗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105532458 B 2 西南远志的组织培养方法 技术领域 0001 本。
7、发明涉及植物组织培养领域， 主要涉及的是西南远志的组织培养方法。 背景技术 0002 西南远志(Polygala crotalarioides Buch.Ham.)， 又名西藏远志， 别名： 娘母良、 丫磨娘， 系远志科远志属植物。 是云南佤族民间的一种珍奇中草药， 生长在 “稀树高草群落” 和灌丛草坡， 为多年生宿根铺散草本， 有增进食欲、 强筋健骨和性功能亢进之功。 长期服用 能使眉须秀长， 有颜容光泽和痣斑消褪之效。“斗牛竞赛” ， 丫磨娘可用作 “发力药” 喂饲斗 牛， 使膂力倍增， 斗志昂扬。 本品性温， 味辛甘苦； 归入心、 肺、 肾、 肝诸经。 具有补肾助阳、 养 心安神、 祛痰。
8、解痉的功效。 主治瘰疬痨伤、 风湿麻木、 顺气化痰、 补心安神、 活血止痛诸症。 临 床应用于肾虚阳萎、 早泄等性功能减退症以及心悸怔忡， 肾虚咳喘， 宫寒带下等证。 药理实 验的结果表明， 西南远志还具有明显的抗疲劳、 抗缺氧作用， 能提高机体的抗应激能力， 增 强体力并使机体适应各种不良刺激的影响。 目前从本属植物中分离得到的主要成分为三萜 皂苷类化合物、 呫吨酮苷类化合物、 寡糖脂类化合物、 生物碱及其他有机成分和无机物。 作 为远志属植物的主要化学成分之一的三萜皂苷类化合物， 根据张平夫李明炬孙学惠的 佤 族草药 “丫磨娘” 强壮作用的药理研究 证明其具有明显促进幼龄雄性小鼠的睾丸发育。
9、和去 势雄性大鼠已萎缩之副性腺器官的生长， 能够显著增强小鼠游泳耐力、 常压耐缺氧以及抗 低温能力。“丫磨娘 能够提高机体的抗应激能力， 并具有雄性激素样作用。 0003 由于药效卓著， 人们争相采挖， 已经造成原产地资源的严重枯竭， 己濒临绝迹。 因 此， 为保护这一珍稀中药品种， 对西南远志进行快速繁殖技术的研究是亟待解决的重要课 题。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种操作简单、 成本低廉、 成活率 高、 生根率高的西南远志的组织培养方法。 0005 本发明所述的西南远志的组织培养方法由以下步骤组成： 0006 一、 外植体的选择： 选择健壮的野生西南远志。
10、， 用其种子作为外植体； 0007 二、 外植体的消毒： 先用自来水冲洗外植体812min， 然后采用无汞消毒法用60 75的乙醇溶液消毒3060秒， 用无菌水冲洗35遍， 按重量比例1:22.5将高锰酸钾和 甲醛溶液放入玻璃干燥器的底层， 随即把外植体放入玻璃干燥器隔层瓷板上， 盖好盖子熏 消毒12小时， 再用浓度为36的次氯酸钠消毒1015min， 消毒完成后， 再用无菌水冲 洗46遍； 0008 三、 初始诱导培养： 把外植体接种于下列经改良的无菌诱导培养基中， 所述的改良 的无菌诱导培养基为： 在每升KC培养基中加入KT1.01.5mg、 NAA0.40.8mg、 VB2520mg、 。
11、活性炭11.5g、 重量百分比浓度为1015的马铃薯汁100150g， 在温度2528、 光照 强度100015001x、 光照时间为1012个小时的条件下， 培养5565天， 形成圆球茎； 说 明 书 1/3 页 3 CN 105532458 B 3 0009 四、 原球茎增殖培养： 将上述的生长良好的圆球茎转接入下列增殖培养基中， 所述 的培养基为： 在每升KC培养基中加入NAA1.52.0mg、 KT0.50.8mg、 VC1030mg、 VB25 20mg、 重量百分比浓度为1015的马铃薯汁100150g、 蔗糖30g、 活性炭35g、 琼脂6 8g,在pH值为57.0条件下培养， 。
12、培养周期： 5565天， 培养温度： 2528， 光照时间:10 24小时/天， 光照强度100015001x； 0010 五、 原球茎分化培养： 将步骤四所述的圆球茎转入下列分化培养基中， 所述的分化 培养基为： 在每升KC培养基中加入NAA0.81.0mg、 KT0.10.5mg、 VC1030mg、 VB25 20mg、 活性炭35g、 重量百分比浓度为1015的香蕉汁100150g、 琼脂68g， 在温度25 28、 光照强度100015001x、 光照时间1012小时条件下培养5565天， 得到分化苗； 0011 六、 壮苗和生根培养： 将分化苗转入下列生根壮苗培养基中， 所述的生根。
13、壮苗培养 基为： 在每升1/2KC培养基中加入NAA0.81.0mg、 VC1030mg、 VB2520mg、 活性炭35g、 重量百分比浓度为1015的香蕉汁100150g、 琼脂68g， 在温度25-28、 光照时间10 12小时、 光照强度100015001x条件下培养5565天， 得到生根苗。 0012 本发明针对现有的技术问题， 提出一种西南远志的组织培养方法， 用少量的种子 作为外植体， 快速大量的培育出西南远志种苗。 采用无汞消毒法对西南远志外植体进行灭 菌处理， 即保证了外植体无菌污染， 提高其培养成活率， 又可以避免汞污染； 在培养基中加 入维生素C(VC)、 核黄素(VB2。
14、)为抗氧化剂， 减轻了外植体的褐化和玻璃化， 提高了外植体的 成活率。 本发明操作简单， 成本低廉， 成活率高、 生根率高。 0013 本发明的组织培养方法能够保持原品种的优良性状， 为良种繁育和产业化生产奠 定基础。 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明作进一步的描述， 实施例只用于对本发明更详细的说 明， 而不用于限制本发明。 0015 实施例1： 0016 外植体的选择： 选择健壮的野生西南远志， 用其种子作为外植体。 外植体的消毒： 先用自来水冲洗外植体10min， 然后采用无汞消毒法用75的乙醇溶液消毒30秒， 用无菌水 冲洗3遍， 按重量比例1:2将高锰酸钾和甲醛溶液直接。
15、放入玻璃干燥器的底层， 随即放入外 植体于玻璃干燥器的隔层瓷板上， 盖好盖子熏消毒2小时。 这一切均可在常温下进行， 对温 度无特殊要求。 这样做可以比较有效除去外植体中的内外生菌。 再用浓度为5的次氯酸钠 消毒15min， 对外植体进行再次消毒。 消毒完成后， 再用无菌水冲洗5遍。 所述的采用无汞消 毒法就是不采用常规的氯化汞消毒方法。 所述的乙醇溶液和次氯酸钠的浓度均为现有技 术， 即体积百分浓度。 0017 初始诱导培养： 把外植体接种于下列经改良的无菌诱导培养基中， 所述的改良的 无菌诱导培养基为： 在每升KC培养基中加入KT1.2mg、 NAA0.6mg、 VB220mg、 活性炭1。
16、.5g、 重量 百分比浓度为12的马铃薯汁120g， 在温度2528、 光照强度100015001x、 光照时间为 1012个小时的条件下， 培养5565天， 形成圆球茎。 0018 原球茎增殖培养： 将上述的生长良好的圆球茎转接入下列增殖培养基中， 所述的 培养基为： 在每升KC培养基中加入NAA1.0mg、 KT0.6mg、 VC20mg、 VB210mg、 重量百分比浓度为 说 明 书 2/3 页 4 CN 105532458 B 4 12的马铃薯汁120g、 蔗糖30g、 活性炭3g、 琼脂8g,在pH值为6.0条件下培养， 培养周期： 55 65天， 培养温度： 2528， 光照时间。
17、:12小时/天， 光照强度100015001x。 0019 原球茎分化培养： 将步骤四所述的圆球茎转入下列分化培养基中， 所述的分化培 养基为： 在每升KC培养基中加入NAA0.8mg、 KT0.5mg、 VC20mg、 VB210mg、 活性炭3g、 重量百分 比浓度为12的香蕉汁120g、 琼脂8g， 在温度2528、 光照强度100015001x、 光照时间 1012小时条件下培养5565天， 得到分化苗。 0020 壮苗和生根培养： 将分化苗转入下列生根壮苗培养基中， 所述的生根壮苗培养基 为： 在每升1/2KC培养基中加入NAA2.0mg、 VC20mg、 VB210mg、 活性炭3g、 重量百分比浓度为 15的香蕉汁150g、 琼脂8g， 在温度25-28、 光照时间1012小时、 光照强度100015001x 条件下培养5565天， 得到生根苗。 0021 即可出瓶炼苗、 移栽， 成活率为93。 0022 上面所述的KC是通用培养基， 其配方为： 0023 KC(Kundson C)培养基配方 0024 0025 所述的1/2KC培养基是指在上述配方中， 大量元素的成分均为1/2。 0026 上面所述的KT是氯吡苯脲(CPPU)， 所述的NAA是萘乙酸， 所述的VB2是核黄素， 所 述的VC是维生素C。 说 明 书 3/3 页 5 CN 105532458 B 5 。