技术领域
本发明属于构树种植技术领域，特别涉及一种构树叶培方法。
背景技术
构树(学名Broussonetia papyrifera)别名褚桃等，为落叶乔木，高10～20m；树皮暗灰色；小枝密生柔毛。树冠张开，卵形至广卵形；树皮平滑，浅灰色或灰褐色，不易裂，全株含乳汁。为强阳性树种，适应性特强，抗逆性强。
构树具有速生、适应性强、分布广、易繁殖、热量高、轮伐期短的特点。其根系浅，侧根分布很广，生长快，萌芽力和分蘖力强，耐修剪。抗污染性强。在中国的温带、热带均有分布，不论平原、丘陵或山地都能生长，其叶是很好的猪饲料，其韧皮纤维是造纸的高级原料，材质洁白，其根和种子均可入药，树液可治皮肤病，经济价值很高；因此得到广泛种植。
目前，构树的繁殖方式有播种育苗、根蘖繁殖、扦插繁殖、埋条繁殖和组织培养。其中，组织培养是通过芽器官培养而获得的组培苗，其遗传性质稳定，能保持母本的优良性状，并且能大批量进行培育，因此其对于大批量培育出性状统一的构树苗具有积极意义。组织培养时，一般采取优良母树上芽比较饱满的枝条，进行无菌操作，对外植体进行消毒处理，处理完毕后切取1.5～2.0㎝长的茎段，接种于培养基上。插入培养基待诱导出芽后，转接到增殖培养基上，待丛生芽长出，切下进行生根培养，然后出瓶移栽。经常给叶片喷水，并每隔3d进行1次叶面施肥。在组织培养的过程中，培养基质原料一般选用外源植物激素、生长素和细胞分裂素类似物。
如公告号为“CN101200704A”的专利公开了“构树的一种组织培养方法”，其是将构树顶部冬芽在冬芽萌发培养基中培养，得到萌发冬芽；再在MS培养基中添加IAA、6-BA和GA得到的培养基，IAA的终浓度为0.1～0.5毫克/升，6-BA的终浓度为0.1～0.5毫克/升，GA的终浓度为0-0.1毫克/升。由于构树培养苗生根能力不强，通过添加IAA、6-BA和GA等促进剂，诱导培养苗生根，该方式在很大程度上提升了培养苗的生根量，但随着促进剂的增加，培养苗的先在茎基部形成愈伤组织，不定根从愈伤中伸出，由于愈伤组织和不定根自身较为柔软，同时基质对不定根的固定作用极低，进而导致不定根易脱落，影响根的质量，另外，由于愈伤组织和不定根在培养过程中，其生长缺方向不确定，虽然促进剂促使培养苗产生了大量的根系，但由于形成愈伤后根的维管束与茎的维管束之间不能直接连接，致使培养苗移栽后，营养物质难以通过培养苗根部的维管束向上传输给茎的维管束，进而使得培养苗的成活率较低。
发明内容
本发明意在提供一种构树叶培方法，以达到叶培的构树培养苗成活率高的目的。
本方案中的一种构树叶培方法，包括以下步骤：
步骤一、配置培养基
萌发培养基：MS+NAA 0.1～0.2mg/L+6-BA 2～3.2mg/L+腐植酸80～110mg/L+碳粉35～40mg/L+椰汁15～18mg/L+蜂蜜4～6mg/L；
增殖培养基：MS+IAA 0.5～1.5mg/L+6-BA 1～2.5mg/L+腐植酸350～380mg/L+GA30.1～0.2mg/L；
壮芽培养基：MS+IAA 0.1～0.2mg/L+6-BA 0.5～1.5mg/L+腐植酸300～350mg/L；
生根培养基：MS+NAA 0.5～1.5mg/L+6-BA 1～2.5mg/L+腐植酸200～320mg/L+GA30.1～0.2mg/L+木质素磺酸盐150～170mg/L；
步骤二、萌发培养：选取构树组培苗叶片，无菌条件下沿叶柄基部剪成0.4～0.7cm见方的小块，保留叶柄，叶片正面向上接种到萌发培养基上进行萌发培养，萌发培养持续60～70天得到萌发苗；
步骤三、增殖培养：选取萌发苗已展叶的叶片，叶片背面朝下接种于增殖培养基上进行增殖培养，萌发苗增殖培养至不定芽高1～1.3cm得到增殖苗；
步骤四、壮芽培养：将增殖苗上的不定芽转接到壮芽培养基上进行壮芽培养20～25天；
步骤五、生根培养：将壮芽培养后的不定芽转接到生根培养基上培养40～50天得到培养苗；
步骤六、日常管理：构树叶培过程中，保持培养室温度为22～26℃，光照时间15～16h/d，光照强度1500～1800lx。
本方案的有益效果：本方案在萌发培养时，选用萌发培养基，萌发培养基中的MS(MS培养基)为构树叶片细胞的分裂和生长提供基础，同时添加NAA(萘乙酸)0.1～0.2mg/L和6-BA(6-苄氨基嘌呤)2～3.2mg/L促进构树叶片细胞的分裂，进而产生愈伤组织。
另外，腐植酸80～110mg/L和碳粉35～40mg/L增加了萌发培养基整体的透气性，减少了叶片因不透气而腐烂的情况，有助于提高叶片的培养成功率；另外腐殖酸和碳粉均具有抑制多酚氧化酶活性的作用，进而减轻叶片细胞氧化的发生率，还可以有效的吸收酚类以及醌类有害物质；同时，由于腐殖酸中含有多种金属，腐殖酸的加入为使得萌发培养基中的金属含量较多，会对构树叶片愈伤组织的产生造成不利影响，通过添加碳粉，碳粉的多孔结构有助于吸附部分金属离子，减缓构树叶片对金属的吸收量，避免其对愈伤组织的生长造成不利影响；同时，碳粉中存储的金属元素在叶片后期生长中提供重要支撑。
其次，腐殖酸和碳粉加入虽然增加了萌发培养基的透气性，但使得萌发培养基物质间的空隙过大，不利于构树叶片的稳定和生长，通过添加椰汁15～18mg/L和蜂蜜4～6mg/L，一方面有助于起到保水保湿的作用，另一方面利用两者较强的络合作用，加强萌发培养基内物质间的联系，有利于愈伤组织的生长。
增殖培养时，增殖培养基在MS培养基的基础上加入IAA(吲哚乙酸)0.5～1.5mg/L、6-BA 1～2.5mg/L和GA3(赤霉素)0.1～0.2mg/L利于萌发叶片的增殖；而加入腐植酸350～380mg/L不仅为培养的增殖提供了营养物质，同时抑制多酚氧化酶的活性，有利于叶片的增殖。
生根培养时，在MS培养基基础上添加NAA 0.5～1.5mg/L、6-BA 1～2.5mg/L、GA30.1～0.2mg/L，促使了不定芽的优质生根，同时通过添加腐植酸200～320mg/L、木质素磺酸盐150～170mg/L为不定根的生长提供更多养分，另外木质素磺酸盐有助于分解腐植酸，使得腐殖酸更加有利于不定芽的吸收；另外在不定芽生根的过程中，会产生较多的氧化的中间物质，而腐殖酸对氧化中间物质具有抑制作用，进而降低了不定芽生根过程中的氧化作用。
本方案通过优化培养基的成分，使得构树叶片的萌发率达到93～96％，炼苗成活率高达95～97％。
进一步，所述萌发培养基为：MS+NAA 0.1～0.15mg/L+6-BA 2～2.5mg/L+腐植酸90～100mg/L+碳粉35～38mg/L+椰汁15～18mg/L+蜂蜜4～6mg/L。
进一步，所述增殖培养基为：MS+IAA 0.5～1mg/L+6-BA 1～2mg/L+腐植酸350～380mg/L+GA3 0.1～0.15mg/L。
进一步，所述壮芽培养基为：MS+IAA 0.1～0.15mg/L+6-BA 0.5～1mg/L+腐植酸300～320mg/L。
进一步，所述生根培养基为：MS+NAA 0.8～1mg/L+6-BA 1.5～2mg/L+腐植酸260～300mg/L+GA3 0.1～0.15mg/L+木质素磺酸盐150～170mg/L。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
采用野生构树为母本：选择较为粗壮的野生构树；在野生构树上选择饱满的野生购树的种子，在无土条件下发芽，待胚芽生长到1.5cm～2cm时切取中段胚芽，长度为0.8cm～1cm；选择健壮色泽白的胚芽；然后将胚芽浸入73％浓度的酒精中，消毒28～32秒，取出后，再投入到0.09％-0.1％浓度的酸性升汞溶液中灭菌15～18min，再使用无菌水冲洗3～5遍得到构树组培苗叶片。
实施例1：
一种构树叶培方法，包括以下步骤：
步骤一、配置培养基
萌发培养基：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L+腐植酸90mg/L+碳粉38mg/L+椰汁16mg/L+蜂蜜6mg/L；
增殖培养基：MS+IAA 1.5mg/L+6-BA 2mg/L+腐植酸360mg/L+GA3 0.15mg/L；
壮芽培养基：MS+IAA 0.15mg/L+6-BA 1mg/L+腐植酸320mg/L；
生根培养基：MS+NAA 0.8mg/L+6-BA 1.5mg/L+腐植酸300mg/L+GA3 0.15mg/L+木质素磺酸盐160mg/L；
步骤二、萌发培养：选取1cm长度的构树组培苗叶片，无菌条件下沿叶柄基部剪成0.6cm见方的小块，保留叶柄，叶片正面向上接种到萌发培养基上进行萌发培养，萌发培养持续65天得到萌发苗；
步骤三、增殖培养：选取萌发苗已展叶的叶片，叶片背面朝下接种于增殖培养基上进行增殖培养，萌发苗增殖培养至其产生不定芽，不定芽高1.3cm得到增殖苗；
步骤四、壮芽培养：将增殖苗上的不定芽转接到壮芽培养基上进行壮芽培养25天；
步骤五、生根培养：将壮芽培养后的不定芽转接到生根培养基上培养45天得到培养苗；
步骤六、移栽炼苗：将步骤五获得的培养苗先在培养箱中开盖锻炼3天，然后从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽到温室中5×5厘米的营养钵中。栽培介质为按1∶1:1：0.2体积比混合的黑土、草炭土、蛭石和沙石，装钵前用浓度为0.1％的多菌灵对栽培介质进行消毒，当苗高达到20-30cm时，即可移栽到室外。
步骤六、日常管理：构树叶培、炼苗过程中，保持培养室温度为22～26℃，光照时间15～16h/d，光照强度1500～1800lx，相对湿度为70～80％。
实施例2：
一种构树叶培方法，包括以下步骤：
步骤一、配置培养基
萌发培养基：MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 2mg/L+腐植酸100mg/L+碳粉40mg/L+椰汁18mg/L+蜂蜜4mg/L；
增殖培养基：MS+IAA 1mg/L+6-BA 1.5mg/L+腐植酸380mg/L+GA3 0.2mg/L；
壮芽培养基：MS+IAA 0.1mg/L+6-BA 1.5mg/L+腐植酸350mg/L；
生根培养基：MS+NAA 1mg/L+6-BA 1.8mg/L+腐植酸280mg/L+GA3 0.1mg/L+木质素磺酸盐170mg/L；
步骤二、萌发培养：选取1cm长度的构树组培苗叶片，无菌条件下沿叶柄基部剪成0.4cm见方的小块，保留叶柄，叶片正面向上接种到萌发培养基上进行萌发培养，萌发培养持续60天得到萌发苗；
步骤三、增殖培养：选取萌发苗已展叶的叶片，叶片背面朝下接种于增殖培养基上进行增殖培养，萌发苗增殖培养至不定芽高1cm得到增殖苗；
步骤四、壮芽培养：将增殖苗上的不定芽转接到壮芽培养基上进行壮芽培养25天；
步骤五、生根培养：将壮芽培养后的不定芽转接到生根培养基上培养50天得到培养苗；
步骤六、移栽炼苗：将步骤五获得的培养苗先在培养箱中开盖锻炼4天，然后从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽到温室中5×5厘米的营养钵中。栽培介质为按1∶1:1：0.2体积比混合的黑土、草炭土、蛭石和沙石，装钵前用浓度为0.1％的多菌灵对栽培介质进行消毒，当苗高达到20-30cm时，即可移栽到室外。
步骤六、日常管理：构树叶培、炼苗过程中，保持培养室温度为22～26℃，光照时间15～16h/d，光照强度1500～1800lx，相对湿度为70～80％。
对比例1：对比例1与实施例1的区别仅在于：萌发培养基为：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L。
对比例2：对比例2与实施例1的区别仅在于：萌发培养基为：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L+腐植酸90mg/L。
对比例3：对比例3与实施例1的区别仅在于：萌发培养基为：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L+腐植酸90mg/L+碳粉38mg/L。
对比例4：对比例4与实施例1的区别仅在于：萌发培养基为：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L+腐植酸90mg/L+椰汁16mg/L+蜂蜜6mg/L。
对比例5：对比例5与实施例1的区别仅在于：萌发培养基为：MS+NAA 0.15mg/L+6-BA 2.5mg/L+碳粉38mg/L+椰汁16mg/L+蜂蜜6mg/L。
对比例6：采用公告号为“CN101200704A”专利中公开的实施例1培育。
采用实施例1～2与对比例1～6中的方法培育构树培养苗，萌发培养时均选取100片构树组培苗叶片，最终得到数据如下：
组别 萌发率(％) 增殖系数 生根率(％) 炼苗存活率(％) 实施例1 96 5.3 95 96 实施例2 95 5.2 96 95 对比例1 85 4.3 95 94 对比例2 83 4.2 93 93 对比例3 91 4.3 92 95 对比例4 86 4.6 94 93 对比例5 81 4.4 92 91 对比例6 91 4.5 87 93
从上表中可知，采用本发明中的方法培养构树培养苗，其萌发率和生根率和炼苗存活率均较现有技术高。对比例2～5中萌发率较低的原因在于萌发培养基中原料的改变，特别是腐殖酸和碳粉间的相互作用至关重要。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。