技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及熊果酸新用途及含有熊果酸的组合物及其用途。
背景技术
金黄色葡萄球菌是人体皮肤和鼻腔的常见定植菌，同时也是引起临床感染的常见致病菌，既可引起局部化脓性感染，如痈、疖、毛囊炎、甲沟炎和外科切口等局部脓性感染，也可引起肺炎、骨髓炎、脑膜炎、化脓性关节炎、心内膜炎及脓毒症、败血症等全身性感染。
细菌生物膜也称生物被膜，是细菌粘附在组织或医学材料表面，通过释放多糖和蛋白形成含水基质包绕菌体而构成的具有立体结构的细胞群落，是细菌为了适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的存在形式。现今，临床上很多慢性感染与细菌生物膜有很大关联。生物膜将整个菌体包裹，导致抗生素难以接触菌体，不能直接杀灭菌体，极大影响抗生素的治疗效果。临床上常常使用抗生素-抗生素联合作用，对细菌进行杀灭，但达不到预想的效果。
熊果酸，在自然界分布很广，可来源于金银花、乌梅、山楂、山茱萸、刺玫果等天然植物中，有研究表明熊果酸具有镇静、抗炎抗菌、抗糖尿病、抗癌等多种药理活性。目前，已有报道指出熊果酸与抗生素联用能够取得很好的杀菌效果。如中国专利申请CN101543499A一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用，其涉及将熊果酸与青霉素联用在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用，该发明指出，熊果酸与青霉素联用在体外对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，最低抑菌浓度为1.3μg/disc。但是，该发明对熊果酸的研究仅在其体外抗菌活性方面，并未涉及其是否能够在体外抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜形成。
另外，目前由于抗生素用量过大导致的人体神经、骨髓、肝脏、肾脏等脏器产生较大不良反应的事件越来越多。如庆大霉素过量使用容易导致肾毒性反应，经动物实验证明，庆大霉素可引起少数近端肾小管损伤，肾小球滤过功能障碍以及肾小球超微结构异常和功能降压。另外，由头孢拉定引起的人体严重不良反应的事件也越来越多，在国家药品不良反应检测中心发布的《药物不良反应信息通报》中指出，因头孢拉定引起的严重不良反应事件为15.0％，其中，有关血尿的不良反应事件占97.63％。因此，如何在保持抗生素的有效性的同时控制抗生素的用量成为目前亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种熊果酸的新用途及有熊果酸的组合物及其用途，以解决以上缺陷。
本发明目的之一在于提供一种含有熊果酸的组合物在制备用于抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜生长药物中的用途。
进一步地，所述组合物包括熊果酸和抗生素，所述组合物中熊果酸的含量为1.83～10.05μg/ml。
进一步地，所述抗生素选自左氧氟沙星、罗红霉素、头孢拉定、庆大霉素和阿莫西林中的一种。
进一步地，所述抗生素选自左氧氟沙星，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述左氧氟沙星的含量为0.03μg/ml～0.12μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述左氧氟沙星的含量为0.12μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml，所述左氧氟沙星的含量为0.12μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为7.76μg/ml，所述左氧氟沙星的含量为0.12μg/ml.。
进一步地，所述抗生素选自罗红霉素，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述罗红霉素的含量为0.15μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述罗红霉素的含量为0.15μg/ml。
进一步地，所述抗生素选自头孢拉定，所述组合物中熊果酸的含量为3.65μg/ml～10.05μg/ml，所述头孢拉定的含量为0.3μg/ml～1.2μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述头孢拉定的含量为0.3μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为7.76μg/ml，所述头孢拉定的含量为0.6μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述头孢拉定的含量为0.6μg/ml。
进一步地，所述抗生素选自庆大霉素，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.03μg/ml～0.125μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.06μg/ml～0.123μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.123μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为7.76μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.123μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为10.05μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.061μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为7.76μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.061μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml，所述庆大霉素的含量为0.123μg/ml。
进一步地，所述抗生素选自阿莫西林，所述组合物中熊果酸的含量为3.65μg/ml～10.05μg/ml，所述阿莫西林的含量为0.015μg/ml～0.06μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml，所述阿莫西林的含量为0.06μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为3.65μg/ml，所述阿莫西林的含量为0.03μg/ml。
进一步地，所述组合物中熊果酸的含量为5.93μg/ml，所述阿莫西林的含量为0.06μg/ml。
进一步地，所述组合物为口服制剂或外用制剂。
进一步地，所述口服制剂包括片剂、胶囊、散剂、滴丸、丸剂、颗粒剂、混悬剂、喷雾剂、栓剂或酏剂；所述外用制剂包括霜剂或膏剂。
本发明的另一发明目的在于提供一种抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜生长的组合物，所述组合物包括熊果酸和抗生素。
进一步地，所述抗生素选自左氧氟沙星、罗红霉素、头孢拉定、庆大霉素和阿莫西林中的一种。
除外，本发明还提供了上述的组合物在制备抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜生长药物中的用途。
本发明提供的熊果酸的分子式为：C30H48O3，CAS号为：77-52-1。
目前对熊果酸的研究仅在其体外抗菌活性方面，并未涉及其是否能够在体外抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜形成。发明人意外发现，熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜的形成有抑制和防止作用，试验证明，浓度为1.83～10.05μg/ml的熊果酸在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的形成有抑制作用，其可使金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力降低8～32.8％。对生物膜被膜形态结构观察得出，加入熊果酸，生物膜形成量有明显减少，且结构疏松，其中以浓度为10.05μg/ml时，抑制效果最强，可使生物膜形成能力降低32.8％。虽然发明人无意中发现熊果酸能显著抑制生物膜的形成，但其抑制生物膜的机理不明，有待进一步研究。
另一方面，发明人尝试将熊果酸分别与左氧氟沙星、罗红霉素、头孢拉定、庆大霉素和阿莫西林联用，考察其对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。结果显示，熊果酸分别与左氧氟沙星、罗红霉素、头孢拉定、庆大霉素和阿莫西林联用均能提高熊果酸对金黄色生物膜形成的抑制作用，如熊果酸分别与头孢拉定、左氧氟沙星和罗红霉素联用时，能使金黄色葡萄球菌的生物膜的抑制率最高达到90％，优于熊果酸单独用药效果。另外，熊果酸的存在还能明显降低各抗生素的用量，如熊果酸分别与左氧氟沙星、罗红霉素、头孢拉定和阿莫西林联用均能使各抗生素的有效用量降低到原有效用量的1/2～1/8；熊果酸与庆大霉素定联用能使其有效用量降低到原有效用量的1/8～1/32。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本发明提供了熊果酸在制备抑制或防止金黄色葡萄球菌生物膜生长药物中的用途，为治疗金黄色葡萄球菌感染患者提供了一种新的治疗药物，并对临床医药的发展起到了明显的推动作用。
2)本发明还提供了一种高效低毒药物，其包括熊果酸和抗生素，该药物不仅能提高熊果酸对抑制生物膜形成的抑制作用，并能明显降低抗生素的有效用量，从而降低不良反应的产生。
附图说明
图1是不同浓度的熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜的生成量的抑制影响；
图2是不同浓度的熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜形态结构的影响。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、熊果酸与左氧氟沙星干混悬剂的制备
熊果酸 1005μg 左氧氟沙星 12μg β环糊精 10g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 25ml
a)取熊果酸、左氧氟沙星、β环糊精和羧甲基纤维素钠分别过80目筛后混匀，得混合粉料；
b)将混合粉料加入甘油制软材，过30目筛后80℃烘干，过30目筛整粒，包装，得干混悬剂。
服用时，加入100ml水，摇匀，即得液体悬浮剂。
实施例2、熊果酸与罗红霉素干混悬剂的制备
熊果酸 1005μg 罗红霉素 15μg β环糊精 12g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 23ml
制备方法如实施例1。
实施例3、熊果酸与头孢拉定干混悬剂的制备
熊果酸 1005μg 头孢拉定 15μg β环糊精 16g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 20ml
制备方法如实施例1。
实施例4、熊果酸与头孢拉定干混悬剂的制备
熊果酸 776μg 头孢拉定 60μg β环糊精 6g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 15ml
制备方法如实施例1。
实施例5、熊果酸与庆大霉素干混悬剂的制备
熊果酸 1005μg 庆大霉素 12.3μg β环糊精 12g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 20ml
制备方法如实施例1。
实施例6、熊果酸与庆大霉素干混悬剂的制备
熊果酸 776μg 庆大霉素 12.3μg β环糊精 8g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 10ml
制备方法如实施例1。
实施例7、熊果酸与庆大霉素干混悬剂的制备
制备方法如实施例1。
实施例8、熊果酸与阿莫西林干混悬剂的制备
熊果酸 593μg 阿莫西林 6μg β环糊精 20g 羧甲基纤维素钠 5g 甘油 20ml
制备方法如实施例1。
试验例一、不同浓度熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响
1.1试验方法
取试管斜面加液体培养基稀释至1×107CFU/ml，取95μl菌液加入96孔板，熊果酸依次稀释至0.087μmol/ml、0.17μmol/ml、0.263μmol/ml、0.35μmol/ml、0.438μmol/ml加5μl至96孔板，使得终体积为100μl，另做DMSO的溶剂对照。放入37℃生化培养箱进行培养14h后取出，无菌0.9％氯化钠冲洗，风干后，加入0.1％结晶紫染色30min，冲洗风干后加入95％乙醇进行脱色15min，于570nm波长测A值，并观察各浓度的熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜形态结构的改变。
1.2结果见表1、图1和图2，由图1(*与空白组相比差异显著(P＜0.05)；**与空白组相比差异极显著(P＜0.01))可知，5个浓度梯度的熊估算对金黄色葡萄球菌生物膜形成均有抑制作用，并且随着熊果酸浓度的增加，生物膜抑制作用越强，当熊果酸浓度为10.05μg/ml时，其能使金黄色葡萄球菌生物膜形成能力降低32.8％。从图2(A阴性对照组，B.0.004μmol/ml，C.0.008μmol/ml，D.0.13μmol/ml，E.0.17μmol/ml，F.0.022μmol/ml)可知，熊果酸能使金黄色葡萄球菌生物膜的形成量明显减少，经不同浓度的熊果酸作用后的生物膜结构疏松，这说明，不同浓度熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜有抑制作用。
表1熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜的影响
熊果酸浓度 0μg/ml 3.65μg/ml 5.93μg/ml 7.76μg/ml 10.05μg/ml 生物膜生成量(％) 100±8.16 81.3±1.62** 76.75±7.12** 70.35±4.72** 67.18±8.61**
与0μg/ml熊果酸相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
试验例二、熊果酸与抗生素联用对金黄色葡萄球菌生物膜的影响
1.材料
1.1药物 熊果酸(上海晶纯生化科技股份有限公司的，分析纯，批号U107243)、头孢拉定(广州白云山医药集团股份有限公司，批号：2160005)、左氧氟沙星(第一三共和制药有限公司，产品批号BP009A1)、阿莫西林(广州白云山医药集团股份有限公司,产品批号：4150095)、庆大霉素(广州白云山天心制药股份有限公司，产品批号：1640401)、罗红霉素胶囊(扬子江药业集团有限公司，批号15112041)、氯化钠(天津百世化工有限公司，分析纯，批号20130322)、营养琼脂(广东环凯微生物科技有限公司，生化纯，批号3103128)、营养肉汤(广东环凯微生物科技有限公司，生化纯，批号3104063)、结晶紫(天津市大茂化学试剂厂，批号20160103)、二甲基亚砜(DMSO，IGMA-ALDDICH，批号WXBB3106V)、水为纯化水。
1.2仪器 紫外可见分光光度计(日本岛津UV-2450型)、手提式压力蒸汽灭菌锅(北京市永光明医疗仪器有限公司GMSX-280)、生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂SPX-150B-Z系列)、洁净工作台(上海苏净实业有限公司型号SW-CJ-1D)、电子天平(常熟市双杰测试仪器厂型号JJ323BC)、电热恒温鼓风干燥箱(上海深信实验仪器有限公司，型号DGG-9203A)、超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司，型号DW-HI388)、酶标仪(上海永创医疗器械有限公司，型号M-600)、倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，型号MIT100)。
1.3菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.a，菌株号:ATCC25923)。
2.方法
2.1菌液制备 将金黄色葡萄球菌接种于MH肉汤培养基，制备单菌落。扩大培养后，用无菌生理盐水洗脱并稀释至2×107CFU/ml，备用。
2.2抗生素供试药液制备 用无菌水将5种抗生素分别配制成7.16mmol/L的溶液，备用。
2.3最小抑菌浓度的测定 采用微孔法测定熊果酸对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。取冻存菌接种于营养琼脂固体培养板，培养24h后，挑取单菌落于固体斜面培养基，生化培养箱37℃培养24h，用营养肉汤洗脱下来，稀释至1×107CFU/ml(OD＝0.05)菌悬液备用。无菌96孔板上，在1～8列各孔中加100μl肉汤。第1列孔中各加入浓度为8.77μmol/ml熊果酸溶液100μl，采用倍比稀释法，依次稀释至第2～8列孔内。然后将配好的菌液依次加入各孔，每孔100μl。第9列孔内加入菌液100μl和培养液100μl，不加药液，作为阴性对照组；各孔的终浓度为2.19μmol/ml、1.09μmol/ml、0.54μmol/ml、0.27μmol/ml、0.13μmol/ml、0.068μmol/ml和0.034μmol/ml、0.017μmol/ml。生化培养箱37℃恒温静置培养24h，取出以肉眼观察，无细菌生长的最低浓度，即药物对受试菌的最低抑菌浓度MIC。各抗生素的最小抑菌浓度参考上述方法。
2.4熊果酸与抗生素联用对金黄色生物膜形成的影响根据上述测得的熊果酸与各抗生素的最低抑菌浓度，取不同MIC浓度的熊果酸分别与不同MIC浓度的抗生素按1:1的体积比分别加入孔内，加入90μl菌液，经培养后，结晶紫法染色后，于570nm波长测A值。
2.5试验结果如表2～5所示，结果表明，熊果酸与各抗生素联用，一方面能够明显提高熊果酸的对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用；另一方面可明显降低抗生素的用量，两者联用具有协同增效的作用。
表2熊果酸与左氧氟沙星联用对生物膜形成量的影响
注：与空白组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
由表2可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml与左氧氟沙星0.03μg/ml～0.12μg/ml配伍使用对生物膜形成均有抑制效果，其中以熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml与左氧氟沙星0.12μg/ml配伍效果最明显，对生物膜形成抑制率高达70％以上，特别是当熊果酸10.05μg/ml与左氧氟沙星0.12μg/ml配伍效果最佳，对生物膜形成抑制率高达90％。
表3熊果酸与罗红霉素联用对生物膜形成量的影响
注：与空白组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
由表3可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml与罗红霉素1.44μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸10.05μg/ml与罗红霉素1.44μg/ml配伍效果最佳，对生物膜形成抑制率高达80％。
表4熊果酸与头孢拉定联用对生物膜形成量的影响
注：与空白组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
由表4可知，熊果酸3.65μg/ml～10.05μg/ml与头孢拉定0.3μg/ml～1.2μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸7.76μg/ml～10.05μg/ml与头孢拉定0.6μg/ml配伍效果最佳，对生物膜形成抑制率均高于80％。
表5熊果酸与庆大霉素联用对生物膜形成量的影响
注：与空白组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
由表5可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml与庆大霉素0.031μg/ml～0.123μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸7.76μg/ml与庆大霉素0.123μg/ml配伍效果最佳，对生物膜形成抑制率高达90％。
表6熊果酸与阿莫西林联用对生物膜形成量的影响
注：与空白组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
由表6可知，熊果酸3.65μg/ml～10.05μg/ml与阿莫西林0.015μg/ml～0.060μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸5.93μg/ml与阿莫西林0.06μg/ml配伍效果最佳，对生物膜形成抑制率高达45％。
试验例三、临床应用
1.病例选择选择250例因金黄色葡萄球菌引起的呼吸系感染患者志愿者，男120例，女130例，年龄20～46岁，平均年龄26±1.5岁，随机分成5组，分别是实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例6组、实施例8组。
1.2治疗方法
实施例1组：取本发明实施例1所述混悬剂，加100ml水，摇匀，服用3d，1次/d；
实施例2组：取本发明实施例2所述混悬剂，加100ml水，摇匀，服用3d，1次/d；
实施例3组：取本发明实施例3所述混悬剂，加100ml水，摇匀，服用3d，1次/d；
实施例6组：取本发明实施例6所述混悬剂，加100ml水，摇匀，服用3d，1次/d；
实施例8组：取本发明实施例8所述混悬剂，加100ml水，摇匀，服用3d，1次/d。
1.3疗效评定标准
显效：用药后24～38小时，体温恢复正常，并且不再回升，其他症状好转或消失；
有效：用药后48～72小时，体温恢复正常，其他症状好转；
无效：用药后72小时以上体温仍未恢复正常，其他症状为减轻或减轻后又很快复发者。
2.结果如表7所示。
表7临床疗效结果
组别 例数 显效(率) 有效(率) 无效(率) 总有效率 实施例1组 50 35(70.0％) 12(24％) 3(6％) 94.0％ 实施例2组 50 36(72.0％) 12(24％) 2(4％) 96.0％ 实施例3组 50 36(72.0％) 13(26％) 1(2％) 98.0％ 实施例6组 50 38(76.0％) 12(24％) 0 100.0％ 实施例8组 50 35(70.0％) 13(26％) 2(4％) 96.0％
由上表可知，250例呼吸系感染患者中，90.0％以上的患者服用本发明药物后24～38小时，体温恢复正常，并且不再回升，其他症状好转或消失，其中，以庆大霉素和熊果酸联用效果最佳，总有效率达到100.0％，服用后，各患者均无不良反应产生。这说明，本发明熊果酸与抗生素联用不仅能明显降低抗生素的有效用量，并且能降低不良反应的产生。