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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201080011075.X (22)申请日 2010.01.07 10-2009-0002078 2009.01.09 KR A61K 48/00(2006.01) A61K 31/7105(2006.01) A61P 17/06(2006.01) A61K 9/06(2006.01) (73)专利权人 首尔大学校产学协力团 地址 韩国首尔 (72)发明人 吴章熙 郑智溶 李东勋 李世罗 金妍庚 伸贞恩 李炫京 郑振镐 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 李丙林 张英 US 2005003171。
2、0 A1,2005.02.10, 全文 . NOSAKA,M,ET AL.ABBERANT EXPRESSION OF HISTO-BLOOD GROUP A TYPE 3 ANTIGENS IN VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS IN INFLAMMATORY SITES.IN JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY & CYTOCHEMISTRY .2008, 第三卷 ( 第 56 期 ), 全 文 . MIZUKAWA,Y.ET AL.FUCOSYLTRANSFERASE VII POSITIVIE, SKIN-HOMING T CELLS IN THE 。
3、BLOOD AND SKIN LESIONS OF ATOPIC DERMATITIS PATIENTS.IN EXPERIMANTAL DEREMATOLOGY .2007, 第 17 卷 ( 第 3 期 ), 全文 . (54) 发明名称 利用 ABH 抗原改善炎症性疾病的组合物 (57) 摘要 本发明涉及一种用于改善炎症性疾病的组合 物， 更具体地涉及一种能够改善炎症反应和诸如 皮肤的上皮组织的屏障功能， 以提高抗老化性和 皮肤弹性并防止或治疗老化的用于改善炎症性疾 病的组合物。本发明使得可以通过调节 ABH 抗原 的表达和活性来控制炎症反应， 因此， 本发明的组 合物可以用作治疗剂的发。
4、展标记， 该治疗剂被设 计用于缓解、 或治疗或辅助治疗由人体组织中、 尤 其是 ABH 抗原表达的皮肤中的炎症反应所导致的 疾病， 并且该组合物可以用于开发外用制剂以及 化妆品， 包含设计用于诸如通过调节角化细胞分 化以及皮肤屏障功能来恢复皮肤的正常功能和 润湿、 改善皱纹、 美白及弹性恢复的目的的外用制 剂。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2011.09.08 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2010/000103 2010.01.07 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2010/079978 KO 2010.07.15 (51)Int.Cl. 。
5、(56)对比文件 审查员 朱琳 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书13页 序列表2页 附图7页 CN 102355910 B 2016.02.10 CN 102355910 B 1/1 页 2 1.一种组合物在制备用于改善选自由牛皮癣、 遗传过敏性皮炎、 鱼鳞癣、 天疱疮、 痤疮、 皮肤老化和皱纹所构成的组中的炎症性皮肤病的药物中的应用， 所述组合物包括 ABH 抗原 或作为活性成分提高 ABH 抗原的表达的物质， 其中所述提高 ABH 抗原的表达的物质选自由以下所构成的组 ： 选自由 ABO、 FUT1 和 FUT2 构成的组中的基因、 或包含所述。
6、基因的载体。 2.根据权利要求 1 所述的应用， 其中， ABH 抗原或所述提高 ABH 抗原的表达的物质以所 述组合物总重量的 0.001-10wt的浓度包含在所述组合物中。 3.根据权利要求1或权利要求2所述的应用， 其中， 所述组合物以药用组合物或化妆用 组合物的形式制备。 4.根据权利要求 3 所述的应用， 其中， 将所述组合物配制为用于皮肤的外用制剂。 5.根据权利要求 3 所述的应用， 其中， 所述化妆用组合物选自由敷剂型、 洗剂、 油膏、 凝 胶、 霜剂、 贴片和喷雾剂所构成的组中。 6.根据权利要求 3 所述的应用， 其中， 所述药用组合物为用于口服给予或肠胃外给予 的形式， 。
7、其选自由固体、 半固体和液体制剂所构成的组中。 7.根据权利要求 1 所述的应用， 其中， 所述 ABH 抗原选自由 A 型抗原、 B 型抗原、 AB 型 抗原和 H 型抗原所构成的组中， 在所述 A 型抗原中， N- 乙酰半乳糖胺结合在岩藻糖 - 半乳 糖末端上， 在所述 B 型抗原中， 半乳糖结合在岩藻糖 - 半乳糖末端上， 在所述 AB 型抗原中， N- 乙酰半乳糖胺和半乳糖二者均结合在岩藻糖 - 半乳糖末端上， 以及在所述 H 型抗原中， N- 乙酰半乳糖胺和半乳糖二者均不结合在岩藻糖 - 半乳糖末端上。 8.根据权利要求 1 或权利要求 7 所述的应用， 其中， 所述 ABH 抗原选。
8、自由岩藻糖、 半乳 糖、 葡萄糖、 N- 乙酰半乳糖胺、 N- 乙酰葡糖胺、 FG、 FGG 以及 FGGN 所构成的组中， 所述 FG 是 岩藻糖和半乳糖以 1:1 比率的混合物， 所述 FGG 是岩藻糖和半乳糖以 1:2 比率的混合物， 而 所述 FGGN 是岩藻糖、 半乳糖和 N- 乙酰半乳糖胺以 1:1:1 比率的混合物。 权 利 要 求 书 CN 102355910 B 2 1/13 页 3 利用 ABH 抗原改善炎症性疾病的组合物 技术领域 0001 本发明涉及一种用于改善炎症性疾病的组合物， 更具体地涉及一种用于改善炎症 性疾病以改善炎症反应和皮肤的屏障功能， 从而提高抗老化性和。
9、皮肤弹性并防止或治疗老 化的组合物。 背景技术 0002 ABH 抗原是决定 ABO 血型的抗原。ABO 血型由具有特殊结构的糖基化末端中的 ABO 基因活性差异决定。ABH 抗原主要在红细胞的表面上表达， 因此， 当输入不同类型的血 液时， 它是导致排斥的主要原因。同样已知的是， 除红细胞外， ABH 抗原在不同的组织内表 达， 包括血管、 唾腺、 汗腺、 小肠、 大肠、 和胰腺。在正常的皮肤组织中， 这种抗原主要出现 在颗粒层 (granular layer) 内 ( 其中， 角化细胞的分化进程最快 ) 以及颗粒层前的细胞 中， 而在棘层和基底层中则很难观察到 ABH 抗原 (Ravn e。
10、t al.， APMIS 108 ： 1-28(2000) ； Lloyd， Glycoconjugate J 17 ： 531-541(2000) ； Greenwell， Glycoconjugate J 14 ： 159-173(1997) ； Dabelsteen et al.， J Invest dermatol 82 ： 13-17(1984)。 0003 ABH抗原根据蛋白质或脂质的糖基化末端结构确定。 当N-乙酰半乳糖胺结合在岩 藻糖-半乳糖末端时， 确定该抗原为抗原A(A型)。 当半乳糖结合时， 确定该抗原为抗原B(B 型 )。当 N- 乙酰半乳糖胺和半乳糖全部结合时， 确定。
11、该抗原为 AB 型。当 N- 乙酰半乳糖胺 和半乳糖均没有结合时， 确定该抗原为抗原 O(O 型 )( 参见图 1)。因此， 组织学表达通过岩 藻糖基转移酶 1 或 2(FUT1 或 FUT2) 的表达调节， 后者调节共有的 (common) 岩藻糖 - 半乳 糖末端的合成。 0004 人们在解释使用不同血型输血产生的排斥反应以及披露 ABH 抗原和各种疾病的 发生之间的相互关系上已经做出了很多努力。 然而， 迄今为止， 这些努力都没有成功， 因此， 仍然需要对 ABH 抗原自身的功能进行研究。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一种用于改善炎症性疾病的组合物， 包括 ABH 抗原或作。
12、 为活性成分能够调节 ABH 抗原表达的物质。 0006 为了实现上述目的， 本发明提供了一种用于改善炎症性疾病的组合物， 包括 ABH 抗原或作为活性成分能够调节 ABH 抗原表达的物质。在本发明中， 炎症性疾病包括但不总 局限于， 诸如炎症性皮肤病和胃、 食道、 小肠、 尿道、 结膜炎症的疾病。本发明的组合物优选 为但不总局限于， 药用组合物或化妆用组合物形式。 0007 在本说明书中， 术语 “ABH 抗原” 不仅表示 ABH 抗原本身， 还表示 ABH 抗原类似物 以及 ABH 抗原 /ABH 抗原类似物的结合物。术语 “ABH 抗原类似物” 可以是具有糖基化结构 (该结构对ABH抗原。
13、具有反应性)的物质， 或者是具有类似结构的物质以复制或抑制ABH抗 原的生理功能 ； 或是包括固定在特定载体分子上的此种类似物的另外结合物的物质。 例如， ABH 抗原类似物为其中诸如单糖或氨基酸的一种或多种化合物另外结合在 ABH 抗原上的物 说 明 书 CN 102355910 B 3 2/13 页 4 质， 其功能与原始的ABH抗原相似。 ABH抗原例如有单糖， 如岩藻糖、 半乳糖、 葡萄糖、 N-乙酰 半乳糖胺以及 N- 乙酰葡糖胺 ； 以及单糖类的混合物 ( 例如， FG( 岩藻糖半乳糖 1 1， H- 抗原 )、 FGG( 岩藻糖半乳糖 1 2， B- 抗原 ) 或 FGGN( 岩。
14、藻糖半乳糖 N- 乙酰半 乳糖胺 1 1 1， A- 抗原 )， 但不总局限于此。在 FG、 FGG 或 FGGN 中， 构成混合物的每 种单糖的比例可以与上述比例不同。 0008 在本说明书中，“调节 ABH 抗原的表达的物质” 表示能够上调或下调 ABH 抗原的表 达的每种物质。能够上调 ABH 抗原表达的物质包括， 任何种类的能够通过提高 ABH 抗原生 物合成中每个阶段的糖基酶的表达或活性从而增加 ABH 抗原的生物合成的物质， 例如 ABO、 FUT1、 和 FUT2， 或者任何通过促进 ABH 抗原结合蛋白、 脂类和糖类的表达从而增加 ABH 抗原 的生物合成的物质。增加 ABH 。
15、抗原的生物合成的物质例如有编码 ABH 抗原合成中每个阶段 的糖基酶的基因， 包括 ABO、 FUT1、 和 FUT2， 或具有 ( 承载， harboring) 该基因的载体。一旦 该基因或载体应用在皮肤上， 会上调 ABH 抗原的表达， 引起皮肤分化的正常化， 意味着免疫 反应加强、 且免疫系统得以平衡， 而皮肤的屏障功能也被加强， 使得皮肤更加健康。该载体 可以通过本领域技术人员熟知的那些方法构建， 或直接在市场上购买。根据本发明的一个 优选实施方式， 提高 ABH 抗原表达的物质可以是柳树提取物或黄芩 (Scutellaria radix) 提取物 ( 参见图 6B)。 0009 同时。
16、， 能够下调ABH抗原表达的物质包括， 任何种类的能够降低ABH抗原生物合成 中每个阶段的糖基酶的表达或活性的物质， 包括 ABO、 FUTI、 和 FUT2， 或者任何通过抑制 ABH 抗原结合蛋白、 脂类和糖类的的表达以减少 ABH 抗原的生物合成的物质。能够减少 ABH 抗 原的生物合成的物质例如有 siRNA、 shRNA、 或包含 siRNA、 shRNA 的载体或者能够抑制 ABH 抗原合成中每个阶段的糖基酶的表达的反义编码序列。一旦该基因或载体应用到皮肤上， 会下调 ABH 抗原的表达， 且结果导致抑制 Th1 炎症反应， 这意味着减轻过度的炎症反应以 缓解炎症性疾病的症状。该载。
17、体可以通过本领域技术人员熟知的方法构建， 或直接在市场 上购买。根据本发明的一个优选实施方式， 可降低 ABH 抗原的表达的物质可以是刺五加 (Acanthopanax senticosus) 提取物、 大蓟 (Cirsium japonicum) 提取物、 香菇 (Lentinus edodes)提取物、 人参(ginseng)提取物、 紫松果菊(Echinacea purpurea)提取物(参见图 6A)。. 0010 本发明的组合物优选以组合物的总重量计 0.001-10wt的浓度包括 ABH 抗原或 能够调节 ABH 抗原的表达的物质。如果该物质的含量低于 0.001wt， 炎症性疾病。
18、的改善 效果不够好。另一方面， 如果该物质的含量高于 10wt， 那么与其他成分的混溶性以及制 剂稳定性可能会成为问题。因此， ABH 抗原或能够调节 ABH 抗原表达的物质的优选含量为 0.01-5wt。 0011 本发明可以适用的炎症性疾病例如有炎症性皮肤病、 以及其他组织如胃、 食道、 小 肠、 尿道和结膜中的炎症， 但不总是局限于此。这里的皮肤病包括牛皮癣、 遗传过敏性皮炎 ( 异位性皮炎， atpoic dermatitis)、 鱼鳞癣、 天疱疮、 痤疮、 红斑狼疮、 皮肤老化、 皱纹等， 但 不总是局限于此。 事实上， 任何由皮肤上的炎症所导致的疾病都可包含在本发明的标准内。 00。
19、12 本发明的组合物的剂型不限于但优选为皮肤外用制剂。 皮肤外用制剂的优选实例 为护肤膏 (skin) 型、 洗剂型、 按摩霜型、 营养霜型、 敷剂 (pack) 型、 凝胶型或粘胶型化妆用 组合物 (adhesive type cosmetic composition)。经皮制剂， 如洗剂、 油膏、 凝胶、 霜剂、 贴 说 明 书 CN 102355910 B 4 3/13 页 5 片 (patch)、 或喷雾剂也为优选剂型。无论是怎样的剂型， 用于外用制剂的组合物除基本活 性成分外可包括任何其他成分， 而这些成分可由本领域中的技术人员通过考量该制剂的目 的或剂型而进行选择。 0013 当本。
20、发明的组合物应用于化妆品中时， 该组合物包含按照科学方法的 (scientifically) 皮肤可接受的介质或基质。适合的剂型可例如有溶液、 凝胶、 固体或无 水面团 (dough anhydride)、 通过将油相分散在水相中而制备的乳液、 悬浮液、 微乳液、 微胶 囊、 微粒剂(microgranule)、 离子(脂质体)或非离子囊泡、 霜剂、 护肤膏、 洗剂粉末(lotion powder)、 喷雾剂、 和遮瑕膏 (conceal stick)。此外， 化妆品可以配制为含泡沫或压缩气体 (compressed propellant)的气溶胶组合物。 此外， 通过含有按照科学方法的皮肤可。
21、接受的 介质或基质， 其还可以配制为通常用于皮肤科学领域中的、 局部或全身应用的补充剂 ( 增 补剂、 辅剂， supplement)。 0014 本发明的组合物还可包括， 常用于皮肤科学领域的补充剂， 例如， 脂肪物质、 有机 溶剂、 溶剂 (resolvent)、 浓缩液、 胶凝剂、 软化剂、 抗氧化剂、 悬浮剂、 稳定剂、 发泡剂、 添 味剂 (odorant)、 表面活性剂、 水、 离子或非离子乳化剂、 填充剂、 螯合剂 (sequestering agent)、 螯化剂(chelating agent)、 防腐剂(preserving agent)、 维生素、 阻滞剂、 保湿剂、 精。
22、油、 染料、 色素、 亲水性或疏水性活化剂、 脂质囊泡或其他常用于化妆术中的成分。 上述补 充物的含量可以按照化妆领域通常接受的 ( 量 ) 进行确定。 0015 当本发明的组合物应用到医药中时， 该组合物包含 ABH 抗原或作为活性成分能够 调节 ABH 抗原的表达的物质。本发明的组合物可以通过口服或肠胃外给予， 且以药物剂 型的一般形式使用。也就是说， 通过与常用的稀释剂或赋形剂， 如填充剂、 增量剂 ( 膨胀 剂， extenders)、 粘合剂、 润湿剂、 崩解剂以及表面活性剂等混合， 本发明用于改善炎症性 疾病的组合物可以制备为用于口服给予或肠胃外给予。用于口服给予的固体剂型为片剂、。
23、 药丸、 粉末、 颗粒以及胶囊。这些固体剂型通过混合 ABH 抗原或能够调节 ABH 抗原表达的 物质和一种或多种合适的赋形剂， 如淀粉、 碳酸钙、 蔗糖或乳糖、 明胶等制备。除简单的赋 形剂外， 也可以使用润滑剂， 如硬脂酸镁、 滑石等。用于口服给予的液体剂型为悬浮液、 溶 液、 乳液和糖浆， 除常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外， 上述剂型可以包含各种赋形剂， 如润湿剂、 甜味剂、 芳香剂、 和防腐剂。用于肠胃外给予的剂型为无菌水溶液、 水不溶性赋 形剂、 悬浮液、 乳液、 冻干制剂以及栓剂。除一种或多种活性化合物外， 水不溶性赋形剂和 悬浮液可以包括， 丙二醇、 聚乙二醇、 植物油如橄榄油。
24、、 可注射脂 (injectable ester) 如 油酸乙酯 (ethylolate) 等。除一种或多种活性化合物外， 栓剂可以包含硬脂酸甘油三酯 (witepsol)、 聚乙二醇 (macrogol)、 吐温 61、 可可油脂、 甘油三月桂酸酯 (laurin butter)、 甘油、 明胶等， 但不总是局限于此。 0016 在本发明中， 活性成分可以根据常规方法配制， 且在此时， 可以适当使用常用的补 充剂， 例如表面活性剂、 赋形剂、 着色剂、 调味剂、 防腐剂 (preserving agents)、 稳定剂、 缓 冲剂、 和悬浮剂。 0017 可以根据患者的年龄、 性别和体重、 。
25、目标疾病或病状、 病情的严重程度、 给予途径 以及开处方者的意见， 决定 ABH 抗原或用作本发明组合物的活性成分的调节 ABH 抗原表达 的物质的剂量。 基于这些因素， 可以由本领域的技术人员决定剂量。 取决于本领域技术人员 的判断， 除注射剂外可以局部应用常用剂型。并且注射剂可以在真皮和皮下脂肪中局部注 说 明 书 CN 102355910 B 5 4/13 页 6 射， 但不总是局限于此。通常， 剂量确定在 0.001mg/kg/ 天 -2,000mg/kg/ 天的范围内。更 优选的剂量为 1g/kg/ 天 -100g/kg/ 天。剂量单位可以包括， 例如， 1、 2、 3 或 4 份单。
26、个 剂量或单个剂量的 1/2、 1/3 或 1/4。单个剂量优选包含在一次应用中给予的有效化合物的 量， 其通常对应于日剂量的全部、 1/2、 1/3 或 1/4。 0018 在本发明的优选实施方式中， 对各种炎症性皮肤病进行了研究， 包括由于不同的 遗传 / 环境因素导致的皮肤异常炎症反应以及其他伴随免疫系统失衡和异常角化细胞分 化的炎症性失调 (inflammatory disorder)， 例如牛皮癣、 遗传过敏性皮炎、 鱼鳞癣以及天 疱疮。结果观察到 ABH 抗原要么在颗粒层上几乎不表达， 要么通过角化细胞的异常分化异 常地表达(参见图4和图5)。 在不同的皮肤病中观察到的这种异常的角。
27、化细胞分化为颗粒 层， 可能是导致皮肤屏障功能问题的主要原因。当用 UV 以诱导炎症最低强度两倍的强度辐 射正常皮肤时， 第三天不再观察到颗粒层中的 ABH 抗原的表达 ( 参见图 3)。 0019 在本发明的另一个优选实施方式中， 用各种天然物质的提取物处理角化细胞。刺 五加、 大蓟、 香菇、 人参以及紫松果菊的提取物降低了血型相关抗原的表达， 而柳树提取物 和黄芩提取物则提高了血型相关抗原的表达(参见图6)。 提高血型相关抗原的表达的物质 可以用于增强免疫性， 同时， 降低血型相关抗原的表达的物质可以用于抑制过度炎症性反 应。同样还研究了， 进行 ABH 抗原或构成 ABH 抗原的单糖类的。
28、给予对血型相关抗原的表达 会造成怎样的影响。结果， 当用 ABH 抗原或构成 ABH 抗原的单糖类进行处理时， 细胞和皮肤 内的血型相关糖类的表达提高 ( 参见图 7-9)。从上述结果确证， ABH 抗原的表达与皮肤上 的角化细胞的分化和炎症紧密相关。 0020 在本发明的另一个优选实施方式中， 对 ABH 抗原的表达进行了人工去除。此时， 观 察到， 通过干扰素 - 介导的 Th1 免疫反应受到抑制 ( 参见图 10-12)。在另一个试验中， ABH抗原的表达受到抑制后， 用TNF-和IL-1进行处理。 在那种情况下， 对照(control) 中的 BD-2 基因的高表达被降低 ( 参见图 。
29、13)。在另一个实例中， 当 ABH 抗原的表达受到抑 制时， 角化细胞的移动速度减慢 ( 参见图 14)。至于遗传过敏性皮炎的发展阶段， 在初始阶 段观察到Th1炎症反应减少， 其原因未被披露， 但推断为细胞因子调节炎症反应的失衡(所 致 )。然后， 在下一个阶段中， 伴随免疫球蛋白 E(IgE) 的上调， Th2 炎症反应迅速扩大， 但 是， 还未清楚地识别出 IgE 的抗原。此时， 可能由不同原因引起的颗粒层中 ABH 抗原表达的 降低， 似乎是初始的 Th1 炎症反应减少的部分原因。因此， 暗示可以通过修正异常 ABH 抗原 的表达， 防止或治疗诸如遗传过敏性皮炎的皮肤病。当正常的皮肤。
30、持续暴露于由各种皮肤 刺激引起的炎症反应时， 皮肤组织持续地暴露于活性氧， 因此， 皮肤组织受到损伤、 起皱且 迅速老化。因此， 可以通过适当地减缓和控制皮肤炎症反应， 减少活性氧， 从而防止皮肤损 伤、 皱纹和皮肤老化。 0021 在各种炎症性皮肤病中， 当 ABH 抗原不足时， 会出现异常炎症反应。结果可能损害 正常的皮肤分化和原始皮肤防御系统。因此， 如果有意从外部提供 ABH 抗原或增加可提高 ABH 抗原表达的物质， 则可以加强正常的免疫反应。也就是说， 如果增加颗粒层中的 ABH 抗 原的表达， 则可以增强皮肤的免疫反应， 因此， 将会对临时或遗传 ABH 抗原表达的减少形成 补充。
31、， 以正常维持皮肤免疫系统， 防止和治疗各种由于失衡的、 异常的皮肤免疫系统引起的 皮肤病， 且因而有助于通过增强皮肤屏障功能而保持皮肤健康。 0022 本发明提供了一种皮肤学有益的物质的筛选方法， 包括通过加速体内或体外的表 说 明 书 CN 102355910 B 6 5/13 页 7 皮角化细胞的分化， 从多种候选物质中选择出能够提高或降低 ABH 抗原表达的物质的步 骤。具体地， 在细胞培养后， 所有的候选物质在同样的条件下等同地处理细胞。通过蛋白免 疫印迹法 (Western blotting) 量化 ABH 抗原， 从而选择符合要求的候选物。此外， 这里可 以使用本领域技术人员熟知。
32、的、 用于选择有价值蛋白的任何常规的筛选方法。 0023 本发明还提供了一种皮肤护理方法， 包括通过上调皮肤颗粒层中的 ABH 抗原以及 通过促进抗菌肽表达及增强皮肤屏障功能从而增强内源免疫反应的方式。 0024 本发明还提供了一种用于缓解皮肤炎症的方法， 包括通过暂时降低 ABH 抗原表达 以抑制 Th1 炎症反应相关因素的表达， 从而缓解由于过度炎症反应引起的皮肤病的症状的 步骤。 0025 本发明还提供了一种用于恢复皮肤免疫功能的方法， 包括通过在免疫性减弱的皮 肤颗粒层中提高正常 ABH 抗原的表达以控制免疫反应达到正常， 从而抑制角化细胞的缺陷 分化以及异常的炎症反应的步骤。 002。
33、6 本发明的组合物具有改善或缓解在包括皮肤的多种组织中具有炎症的炎症性疾 病的症状的效果。 因此， 通过加速抗菌肽的表达以及增强皮肤屏障功能， 有助于保持皮肤健 康， 同时有助于皮肤病造成的受损皮肤的恢复。 此外， 本发明的组合物可以通过持续抑制炎 症反应以防止或改善老化， 同时增强皮肤弹性并防止或改善皮肤皱纹。 因此， 本发明的组合 物可以有效地用于筛选能够改善炎症性皮肤病和老化的有用物质。 附图说明 0027 通过参照附图可以最好地理解本发明的优选实施方式的应用， 其中 ； 0028 图 1 是示出血型糖的化学结构的示意图。 0029 图 2 是示出正常组织中 ABH 抗原表达的一组照片。。
34、 0030 图 3 是示出受辐射的皮肤中的 ABH 抗原 (B 型抗原 ) 下调的一组照片。 0031 图 4 是示出具有多种皮肤病的皮肤组织中 ABH 抗原表达的一组照片。 0032 图 5 是示出具有多种皮肤病的皮肤组织的免疫组织化学染色结果的图表。 0033 图 6 是示出不同天然提取物对 ABH 抗原表达的影响的一组电泳照片。 0034 图 7 是示出 ABH 抗原治疗对血型抗原表达的影响的一组电泳照片。 0035 图8是示出构成ABH抗原的单糖类的给予对血型抗原表达的影响的一组免疫组织 化学染色照片。 0036 图 9 是示出构成 ABH 抗原的单糖类的给予对血型抗原表达的影响的一组。
35、电泳照 片。 0037 图 10 是示出通过去除 ABH 抗原下调 ICAM-1 和 HLA-DR 的一组蛋白免疫印迹图片。 0038 图 11 是示出实时 PCR 结果的图表， 其中确认通过去除 ABH 抗原下调了 IL-8 和 GM-CSF。 0039 图 12 是示出实时 PCR 结果的图表， 其中确认通过去除 ABH 抗原下调了 BD-2。 0040 图 13 是示出去除 ABH 抗原后通过 TNF- 或 IL-1 的处理抑制 BD-2 表达的一组 图片。 0041 图 14 是示出 ABH 抗原表达对细胞迁移速度的影响的一组照片。 说 明 书 CN 102355910 B 7 6/1。
36、3 页 8 具体实施方式 0042 本发明在实践上目前所优选的实施方式是例示性的， 如以下实施例所示出的。 0043 然而， 本领域的技术人员应当理解， 在本发明的精神和范围内， 可以对本发明所披 露的内容进行修改和改进。 0044 实验例 1 ： 不同人体组织内的 ABH 抗原表达的研究 0045 进行活组织检查， 从人体的各个部分获得不同的人体组织。通过使用 ABH 抗原特 异性抗体进行免疫组织化学染色， 以研究各组织中的 ABH 抗原表达。具体地， 将活组织检查 获得的组织用 10的福尔马林固定过夜。然后， 去除福尔马林， 并使组织脱水， 从而制作石 蜡块 (paraffin block。
37、)。将组织块切成厚度为 0.4m 的切片， 放置到载玻片上。将载玻片 放入 58的烘箱中 1 小时使石蜡融化。为了完全清除石蜡， 使用二甲苯处理载玻片 4 次， 每次 5 分钟， 然后将载玻片浸入 100乙醇中两次， 每次 1 分钟， 在 95乙醇中 1 分钟， 在 80乙醇中1分钟， 以及在70乙醇中1分钟， 从而使其逐步再水化。 使用流动的自来水将 载玻片冲洗 5 分钟， 然后使用蒸馏水再将载玻片清洗 5 分钟。将其转移到 pH 6.0TRS(Dao) 中， 并且以 120进行 10 分钟的高压灭菌。利用双重煮沸 (double boiling) 将组织冷却 10 分钟， 然后用蒸馏水清洗。
38、两次， 每次持续 5 分钟。然后， 使用 PBS 再次清洗组织， 持续 5 分 钟 ； 然后转移到使用 PBS 稀释的 3氧过氧化物 (oxygen peroxide) 溶液中， 持续 10 分钟。 使用 PBS 清洗组织 3 次， 每次持续 10 分钟。使用 PAP 笔画出组织的边线， 然后使用封闭液 (blocking solution)(Seemed) 处理组织， 持续 30 分钟。使用识别 A 型或 B 型抗原的主要 抗体处理组织， 置于 4， 持续 16 小时。使用 PBS 清洗组织 3 次， 每次持续 10 分钟， 然后使 用 HRP( 辣根过氧化物 ) 结合的第二抗体 (Sant。
39、a Cruz) 处理组织， 持续 15 分钟。再次使用 PBS 清洗组织 2 次， 每次持续 10 分钟， 然后使用蒸馏水清洗 2 次， 每次持续 10 分钟。使用 AEC着色剂(Seemed)诱导着色， 然后再次使用流动自来水清洗5分钟， 且随后使用蒸馏水清 洗 5 分钟。使用苏木精 (Dako) 对细胞核染色， 然后使用流动水清洗 10 分钟。除去组织周 围的水分， 然后使用水性封片剂 (aqueous mounting solution)(Dako) 封片。然后， 将组织 放在显微镜下观察， 取得组织的照片。 0046 结果确认， 根据血型 ( 参见图 2)， ABH 抗原不仅在红细胞中。
40、表达， 而且也在很多不 同的组织中表达， 包括胃 (A 型 )、 食道 (A 型 )、 小肠 (B 型 )、 尿道 (A 型 )、 结膜 (A 型 ) 以及 皮肤 (A 型 )。A 血型的人的组织仅被 A 型抗原特异性抗体染色， 而不被 B 型抗原特异性抗 体染色。同样地， B 血型的人的组织仅被 B 型抗原特异性抗体染色。在 AB 血型的人的情况 下， 组织被两种抗体染色， 而 O 血型的人的组织则不被任何一种抗体染色。 0047 实验例 2 ： 通过 UV 辐射下调 ABH 抗原的表达 0048 在正常的组织中， A 血型的人的组织仅被 A 型抗原特异性抗体染色， 其通常发生在 表皮的颗粒。
41、层中 (Dabelsteen et al.， J Invest dermatol82 ： 13-17(1984)。最小红斑量 (MED)， 表示在 UV 照射后， 观察到第一块红斑的强度， 需要单独进行测量。通过 2MED 辐射每 块皮肤， 然后在 UV 辐射后的 0、 28、 48、 和 72 小时进行皮肤活体组织检查。通过与实验例 1 中所述相同的方法进行免疫组织化学染色， 以研究 ABH 抗原的表达。 0049 结果， ABH 抗原通常在 UV 辐射后 24 小时表达。然而， 48-72 小时后， ABH 抗原的表 达逐步降低 ( 图 3)。 0050 实验例 3 ： 在各种皮肤病中下调。
42、 ABH 抗原的表达 说 明 书 CN 102355910 B 8 7/13 页 9 0051 基于ABH抗原的表达在UV辐射达到诱发炎症的强度时减少的事实， 在假定具有异 常 (irregulation) 炎症反应所导致的症状的各种皮肤病中， 对 ABH 抗原的表达进行研究。 为了进行研究， 通过活组织检查从患有牛皮癣 (A 型 )、 遗传过敏性皮炎 (A 型 )、 鱼鳞癣 (A 型 )、 蜂窝组织炎 (A 型 )、 盘状红斑 (discoid lupus)(A 型 )、 痤疮 (B 型 ) 等的患者获取组 织。通过与实验例 1 中所述相同的方式对组织进行免疫组织化学染色， 以研究 ABH 。
43、抗原的 表达。 0052 结果， 在大多数病变组织中， 颗粒层中的 ABH 抗原的表达不足。尽管有个体差异， 在棘层或基底层中的异常 ABH 抗原的表达较为常见 ( 图 4 和图 5)。该结果表明， 在颗粒层 中有不完全分化， 和 / 或在棘层或基底层中有异常分化。 0053 实验例 4 ： 天然提取物对 ABH 抗原表达的影响 0054 研究各种天然提取物对 ABH 抗原表达的影响。为了进行研究， 使用浓度分别为 0.1 (v/v)、 1 (v/v) 以及 2 (v/v) 的未稀释的刺五加、 大蓟、 香菇、 人参、 紫松果菊、 黄 芩、 柳树提取物 ( 购自 Biospectrum) 处理 。
44、HaCaT 细胞， 随后培养 48 小时。然后， 进行蛋白 免疫印迹以研究 B 型抗原的表达。作为对照， 使用 - 微管蛋白或 STAT1 蛋白。 0055 结果， 刺五加、 大蓟、 香菇、 人参以及紫松果菊的提取物降低了HaCaT细胞中B型抗 原的表达， 而柳树提取物和黄芩提取物则提高了 B 型抗原的表达 ( 参见图 6)。 0056 实验例 5 ： ABH 抗原对血型抗原表达的影响 0057 使用 A、 B、 和 H 抗原 ( 购自 Dextra Laboratories) 处理含有浓度为 100nM 的 B 抗 原的 HaCaT 细胞， 持续 24 小时， 然后进行蛋白免疫印迹以研究 B。
45、 型抗原的表达。结果， 通过 B 或 H 型抗原提高了 B 型抗原的表达。A 型抗原没有提高 B 型抗原的表达 ( 图 7-10)。使用 浓度为 100nM 或 200nM 的 A 或 B 型抗原处理 HaCaT 细胞 48 小时， A 或 B 型抗原提高了 B 型 抗原的表达 ( 图 7)。上述结果表明， A、 B 以及 H 抗原能够提高 HaCaT 细胞中 B 型抗原的表 达。 0058 实验例 6 ： 构成 ABH 抗原的单糖类的给予对血型抗原的表达的影响 (1) 0059 一般现象是， 与正常人相比， 遗传过敏性皮炎患者的臀部皮肤中的血型抗原表达 减少， 尽管肉眼不能观察其中清楚的病变。
46、。研究了通过构成 ABH 抗原的单糖类的给予是否 能够使降低的表达得以恢复。为此， 将由 100半乳糖、 FGG( 岩藻糖半乳糖 1 2， B 抗 原组合物 ) 以及 FGGN( 岩藻糖半乳糖 N- 乙酰半乳糖胺 1 1 1， A 抗原组合物 ) 组成的糖混合物溶解在由聚二乙醇乙醇水 3.5 1.5 5 组成的混合溶剂中， 浓度 为 0.5 (w/v)。溶解产物紧密地应用于年龄为 30 岁的、 B 型男性过敏性皮肤炎患者 ( 志 愿者 ) 的臀部皮肤， 以及年龄为 24 岁的、 A 型男性过敏性皮肤炎患者 ( 志愿者 )， 持续 48 小 时， 并再重复 ( 一次 )( 总共 96 小时 )。。
47、然后， 进行活组织检查以获得样本组织。通过使用 与实验例 1 所述相同的方法对组织进行免疫组织化学染色， 以研究 ABH 抗原的表达。 0060 结果， 当用形成血型糖的物质处理时， 在 B 型 30 岁男性遗传过敏性皮炎患者 ( 志 愿者 )( 图 8A) 和 A 型 24 岁男性遗传过敏性皮炎患者 ( 志愿者 )( 图 8B) 的细胞和皮肤中， 血型糖的表达提高。 0061 实验例 7 ： 构成 ABH 抗原的单糖类的给予对血型抗原的表达的影响 (2) 0062 使用构成 A、 B、 和 H 抗原的 FGG 和 FGGN 混合物以及 FG( 岩藻糖半乳糖 1 1， H- 抗原组合物 )， 。
48、还有作为构成 A、 B 和 H 抗原的单糖类的葡萄糖、 半乳糖、 岩藻糖、 N- 乙酰 说 明 书 CN 102355910 B 9 8/13 页 10 半乳糖胺和 N- 乙酰葡糖胺， 以不同的浓度 0.1、 1 和 10M， 处理具有 B 型抗原的 HaCaT 细 胞， 持续 24 小时。进行蛋白免疫印迹法以研究 B 型抗原的表达。结果， 在上述每种情况中， B 型抗原的表达均提高 ( 图 9)。 0063 实验例 8 ： 通过去除 ABH 抗原减少 ICAM-1 和 HLA-DR 的表达 0064 通常， 在皮肤的炎症反应中， 干扰素 -(IFNg)， Th1 细胞因子发挥重要作用， 其提。
49、 高了介导 Th1 免疫反应的各种因子的表达。具体地， 当角化细胞作为抗原呈递细胞发挥作 用时， ICAM-1和HLA-DR为最重要的分子(Barker et al.， Lancet 337 ： 211-214(1991)。 在 补充有 5 FBS( 胎牛血清， Hyclone) 的 DMEM( 由 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基， Welgene) 中， 于孵育器中， 培养 HaCaT， 具有 B 抗原的角化细胞系， 直到细胞生长到充满 35mm 培养 皿的 70。然后， 在 Opti-MEM(Invitrogen) 中培养细胞 2 个小时， 然后通过使用 2.5l 的脂质体 (lipofectamine)2000(Invitrogen)， 以 250pmol 的不具有靶基因的阴性对照 RNA(Bioneer) 以及等量的靶向 FUT1 基因的 。