一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510470544.9 (22)申请日 2015.08.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104982241 A (43)申请公布日 2015.10.21 (73)专利权人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 王永模 刘标 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 42102 代理人 张惠玲 (51)Int.Cl. A01G 7/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102948399。

2、 A,2013.03.06,全文. 贾乾涛等. 转Bt基因水稻安全性评价研究 进展 . 湖北农业科学 .2005,第103-107页. 张莉. 转crylAb/c基因水稻外源蛋白环境 残留及其对水生生物的影响研究 . 中国优秀硕 士学位论文全文数据库 （电子期刊） .2014,第 25-70页. 刘立军等. 转基因抗虫水稻的安全性及其 防范策略 . 生物技术通报 .2009,第36-39页. 赖凤香. 转基因抗虫水稻生态安全性评 价 . 中国优秀硕士学位论文全文数据库 （电子 期刊） .2011,第6-57页. 审查员 吴锦娣 (54)发明名称 一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性 的方法 (。

3、57)摘要 本发明提供一种评价转基因抗虫水稻水生 环境安全性的方法， 包括如下步骤： 转基因稻田 和非转基因稻田布置和管理； 稻田水层和淤泥中 外源蛋白的测定， 包括样本预处理和外源蛋白的 抽提和测定； 稻田水层中浮游生物的分离， 包括 水样采集、 沉淀分离浮游生物； 稻田水层中浮游 生物种类和丰度的测定， 包括活体鉴定和数量计 数； 转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性 评价， 利用分析软件对浮游生物种类、 数量、 发生 时期进行统计分析， 得出多样性指数、 均匀性指 数等参数， 并和常规稻田进行比较， 从而对转基 因抗虫水稻水生环境安全性进行评价。 本发明对 于系统评估转基因抗虫水稻的水。

4、生环境安全性 具有实际的应用价值。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 104982241 B 2017.10.24 CN 104982241 B 1.一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 包括如下过程： （1） 转基因稻田和非转基因稻田布置和管理； （2） 稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定； （3） 稻田水层中浮游生物的分离； （4） 稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定； （5） 转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价； 以上所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步骤： 1） 选择地势平整、 水源方便的田块3至5块， 田块面积400-600m2， 长宽。

5、比范围2 1至1 1， 田周边及水源无生活污水污染； 2） 将步骤1） 中的田块划分成小区， 田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠； 为防止暴雨漫 灌， 田块周边建立良好排水沟； 3） 在步骤2） 中的上游小区种植转基因抗虫水稻， 下游小区种植非转基因水稻， 中间两 块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉， 两侧的两块小区直接用水源中的水灌溉； 4） 从移栽至成熟期， 不施用化学农药， 人工除草， 中期不晒田。 2.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 所 述田块划分成小区的具体方案为： 靠近水源的上游小区并列设置两块转基因小区， 位于转 基因小区下游的下游小。

6、区并列设置4块非转基因小区； 所述两块转基因小区的上游与水源 之间分别设立连通沟渠、 下游分别与中间的两块非转基因小区通过沟渠连通； 所述非转基 因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通； 所述4块非转基因小区分别设置排水沟 渠。 3.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 所 述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定， 包括样本的预处理和外源蛋白的抽提与通过酶联免 疫吸附法测定， 具体包括如下步骤： 1） 水样采集及预处理： 水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 用10ml离 心管进行田间水样采集， 各小区分别取5管， 取上层清水， 拿回室内， 将每份。

7、样品转到新的 10ml离心管中， 然后进行冷冻， 冷冻后封上封口膜， 用针头在膜上扎孔， 然后放入冷冻干燥 机进行浓缩至干； 将干燥后的样品放入4低温保存， 24小时内待测； 2） 淤泥样品采集及预处理： 土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 各拔5 蔸水稻取根围淤泥， 装入50ml离心管， 带回室内放入-20冰箱冷冻， 然后放入冷冻干燥机 进行浓缩至干， 将干燥后的淤泥碾碎， 过80目筛除去根毛， 准确称取每份样品0.5g， 转入到 1.5ml离心管中， 放入4低温保存， 24小时内待测； 3） 外源蛋白抽提缓冲液配制： 取250ml锥形瓶分别加入： 100 mM Na2CO3， 。

8、100 mM NaCl， 5 mM 乙二胺四乙酸， 10 mM二硫苏糖醇， 50 mM Na4P2O710H2O， 1% (v/v) 聚乙二醇辛基苯基 醚， pH 值为10， 即为抽提缓冲液； 4） 外源蛋白的抽提与测定： 分别将步骤1） 与2） 中的样品加入到外源蛋白抽提缓冲液中 进行抽提， 再用酶联免疫吸附试剂盒进行外源蛋白的测定。 4.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 所 述稻田水层中浮游生物的分离， 包括水样采集、 游生物的沉淀分离， 具体包括如下步骤： 1） 确定调查时间： 调查时间分别选在水稻的分蘖期、 拔节期、 孕穗期、 开花期及乳熟期；。

9、 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 104982241 B 2 2） 水样采集及浮游生物的沉淀分离： 采用5点取样法对所有转基因小区和非转基因小 区分别选取5个点， 每个点用带柄量杯采田水10L， 装入桶后， 先用25目过滤漏勺滤去水稻凋 落物和其它大块杂物， 再用23#生物网过滤， 将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀器， 用水定容至1L， 沉淀4小时； 将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶， 虹吸时， 注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点， 控制流速， 缓缓虹吸， 以防吸出沉淀器底部的颗粒 沉淀物， 再次定容至1L， 制成含浮游生物水样， 待测。 5.根据权利要求1所述。

10、的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 所 述稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定， 具体包括如下步骤： 1） 确定调查的浮游生物种类： 调查种类包括： 原生动物类、 轮虫类、 枝角类、 桡足类、 水 生昆虫类； 2） 原生动物类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 吸出0.1ml注入血细胞计数框中， 盖上盖玻片， 在光学显微镜下进行全片计数， 每份样品计数5片， 取平均值， 然后按浓缩的倍 数换算成1L水中的数量； 3） 轮虫类、 枝角类和桡足类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 用1ml自制的无高刻 度玻璃移液管吸取水样， 并用自制的封口器封口， 在40倍以下体视显微镜下。

11、进行全管计数， 每份样品计数5片， 取平均值， 然后按浓缩的倍数换算成1L水中的数量； 4） 水生昆虫类： 用肉眼直接计数。 6.根据权利要求1所述的评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 其特征在于， 所 述转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价的方法为： 应用统计分析方法比较转基 因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、 浮游生物种类和数量差异， 统计浮游生物多样 性指数、 均匀性指数参数， 并和常规稻田进行比较， 最终根据统计分析结果综合分析转基因 抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 104982241 B 3 一种评价转基因抗虫水稻水生环境。

12、安全性的方法 技术领域 0001 本发明涉及转基因作物生态风险评价技术领域， 具体涉及一种评价转基因抗虫水 稻水生环境安全性的方法。 背景技术 0002 水稻是我国的主要农作物之一， 通过转基因育种方法增强水稻自身的抗性为病虫 害防治提供了高效的解决途径。 目前已经成功地培育出了一批具有高产、 抗病虫以及抗除 草剂等性状的转基因水稻品种， 其中一些转基因水稻品系已经进入了环境释放试验等国家 生物安全评价阶段， 为我国的粮食安全保障提供了技术储备。 然而， 转基因作物的种植可能 会带来一系列的安全问题， 因而引起了全球的广泛关注和争论。 由于水稻在我国的重要性， 环保和农业等部门对转基因水稻安全。

13、性的关注似乎超出任何一个其它转基因作物， 有关转 基因水稻生态风险评价的研究受到了高度重视。 0003 近年来， 就一些转基因抗虫水稻品系的基因漂流、 靶标害虫的抗性风险、 对非靶标 生物和稻田节肢动物群落的影响以及毒蛋白在土壤中的残留等方面已经取得了一些进展， 为转基因水稻的安全性评价积累了一定的经验和技术。 以往的研究多数只限于考查转基因 抗虫水稻对稻田节肢动物的影响， 而很少对稻田淡水生态系统中其它重要的类群水生 原生动物(鱼类的重要饵料)加以关注。 对于转基因水稻的大规模种植是否会对水体原生动 物群落带来不利影响， 有多大的影响， 目前这方面的研究报道和结果积累甚少。 因此， 在评 价。

14、转基因水稻环境安全的过程中， 有必要补充和加强对水生环境安全影响的部分。 0004 转基因作物对土壤生态系统的影响是近年来关注的一个焦点， 因为土壤是物质和 能量循环的重要场所， 外源蛋白最先进入土壤， 理论上土壤生态系统最可能受到潜在的负 面影响。 2000年， 美国EPA(US Environmental Protection Agency)将转基因作物对土壤生 态系统的影响列为风险评价的重要组成部分， 转基因作物对土壤生态系统的影响是继转基 因作物与近缘物种基因流、 目标害虫抗性问题和对非目标生物影响之后的又一个热点问 题。 一项新研究表明大面积种植转基因玉米可能会对附近水生生态系统造成。

15、影响。 该研究 证明转基因玉米的花粉及其他部分可以流入玉米地周围的沟渠中， 并用试验揭示转基因玉 米的附产物可增加一种被称作石蛾的水生昆虫的死亡率， 降低其增长率。 0005 在我国的许多地方， 稻田和鱼塘往往交织在一起， 而且素有稻田养鱼、 稻鸭共生等 传统生态种植模式， 再加上水稻田的特殊灌溉方式， 即从上游田到下游田的串联灌溉。 如果 转基因水稻存在对水体生态系统存在类似转基因玉米的安全性问题， 则极易波及到下流的 水田和鱼塘生态系统。 因此， 转基因水稻对水田及下游水生生态系统是否有安全性问题更 加值得注意。 0006 中国专利CN104361251A中涉及转基因棉花对生物安全性评价的。

16、方法， 通过架设频 振式杀虫灯诱集棉田昆虫的成虫； 通过肉眼调查整株棉花上的体形较大的节肢动物； 采用 吸虫器吸取棉花全株以及地面范围内的所有体形较小的节肢动物； 利用体式显微镜检验吸 虫器收集回的节肢动物进行分类。 没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。 说 明 书 1/7 页 4 CN 104982241 B 4 0007 中国专利CN104133054A提供了一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方 法， 用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫； 观察大草蛉幼虫生长发育 情况， 从而评价转基因棉花对大草蛉的影响， 该生物测定方法适用广泛， 对利用 “转基因植 物-害虫。

17、-捕食性天敌” 营养关系评价转基因植物中高剂量蛋白对捕食性天敌的影响都能够 进行有效测定。 0008 中国专利CN102986462A涉及一种利用双斑青步甲评价转Bt基因棉花抗虫性的检 测方法。 该方法利用棉田生态系统中的食物链关系、 即双斑青步甲-棉铃虫-棉花， 以捕食者 种群的数量反映转Bt基因棉花对靶标生物-鳞翅目昆虫(棉铃虫)的致死程度。 在多年种植 转Bt棉花棉田和对照棉花棉田内， 利用陷阱法和引诱剂法相结合诱捕双斑青步甲， 比较两 种棉花棉田内的双斑青步甲数量。 没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。 0009 中国专利CN102948399A涉及一种水生生物大型蚤的饲养方法。 。

18、克服了传统大型蚤 毒理实验技术的缺陷， 建立了一套纯稻米饲养大型蚤的方法， 包括： 营养液配置， 米粉溶液 配置， 幼蚤的饲养和收集。 本发明使用纯稻米饲养大型蚤， 克服了常规方法中大型蚤选择性 摄取绿藻等天然食物而不取食或很少取食稻米的缺陷； 且消除了因绿藻营养成分不确定而 易影响实验结果的不利因素， 为评价转基因水稻安全性提供了可靠的实验保障。 此方法只 适用于转基因植物环境安全室内评价。 0010 中国专利CN102169117A涉及一种基于模糊数学和典范对应分析方法来评价转基 因植物种植对土壤微生态影响的技术体系及其应用。 提供了一种综合考虑土壤微生物与物 理化学指标的评价方法， 应用。

19、该方法可有效评价转基因作物种植对土壤微生态系统带来的 影响。 没有涉及对水生浮游动物安全性评价的内容。 0011 从以上分析可以看出， 对转基因抗虫水稻环境安全评价仅强调了对地上生态系统 的影响， 对土壤生物以及水生生物的影响研究较少。 理论上， 转基因抗虫水稻的毒蛋白可以 通过根系的分泌进入土壤和水体， 也可以通过水稻的碎屑甚至是地上部分的残体进入土 壤， 从而对地下或水生微小生物和小型动物产生影响。 因此， 亟需发明一种适用于对水生生 物安全评价的方法。 发明内容 0012 本发明的目的是提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 通过设计 稻田布置、 水层和淤泥中外源蛋白的测定、 。

20、浮游生物的分离与测定等步骤， 可以系统地评估 转基因抗虫水稻的水生环境安全性。 0013 为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下： 0014 一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 包括如下过程： 0015 (1)转基因稻田和非转基因稻田布置和管理； 0016 (2)稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定； 0017 (3)稻田水层中浮游生物的分离； 0018 (4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定； 0019 (5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价。 0020 根据以上方案， 所述转基因稻田和非转基因稻田布置和管理包括如下步骤： 0021 1)选择地势平整、 水源方便的田块3。

21、至5块(即用于环境安全评价的3至5次重复)， 说 明 书 2/7 页 5 CN 104982241 B 5 田块面积400-600m2， 长宽比范围2 1至1 1， 田周边及水源无生活污水污染； 0022 2)将步骤1)中的田块划分成小区， 田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠； 为防止暴 雨漫灌， 田块周边建立良好排水沟； 0023 3)在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻， 下游小区种植非转基因水稻， 中 间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉， 两侧的两块小区直接用水源中的水灌 溉； 0024 4)从移栽至成熟期， 不施用化学农药， 人工除草， 中期不晒田。 0025 根据以上方案，。

22、 所述田块划分成小区的具体方案为： 靠近水源的上游小区并列设 置两块转基因小区， 位于转基因小区下游的下游小区并列设置4块非轩基因小区； 所述两块 转基因小区的上游与水源之间分别设立连通沟渠、 下游分别与中间的两块非转基因小区通 过沟渠连通； 所述非转基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通； 所述4块非轩基 因小区分别设置排水沟渠。 0026 根据以上方案， 所述稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定， 包括样本的预处理和外 源蛋白的抽提与通过酶联免疫吸附法(ELISA法)测定， 具体包括如下步骤： 0027 1)水样采集及预处理： 水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 用 10ml离。

23、心管进行田间水样采集， 各小区分别取5管， 取上层清水， 拿回室内， 将每份样品转到 新的10ml离心管中， 然后进行冷冻， 冷冻后封上封口膜， 用针头在膜上扎孔， 然后放入冷冻 干燥机进行浓缩至干； 将干燥后的样品放入4低温保存， 24小时内待测； 0028 2)淤泥样品采集及预处理： 土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 各拔5蔸水稻取根围淤泥， 装入50ml离心管， 带回室内放入-20冰箱冷冻， 然后放入冷冻干 燥机进行浓缩至干， 将干燥后的淤泥碾碎， 过80目筛除去根毛， 准确称取每份样品0.5g， 转 入到1.5ml离心管中， 放入4低温保存， 24小时内待测； 0029 。

24、3)外源蛋白抽提缓冲液配制： 100mM Na2CO3， 100mM NaCl， 5mM乙二胺四乙酸， 10mM 二硫苏糖醇， 50mM Na4P2O710H2O， 1(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚， pH值为10， 即为抽提缓 冲液； 0030 4)外源蛋白的抽提与测定： 分别将步骤1)与2)中的样品加入到外源蛋白抽提缓冲 液中进行抽提， 再用酶联免疫吸附试剂(ELISA试剂)盒进行外源蛋白的测定。 0031 根据以上方案， 所述稻田水层中浮游生物的分离， 包括水样采集、 游生物的沉淀分 离， 具体包括如下步骤： 0032 1)确定调查时间： 调查时间分别选在水稻的分蘖期、 拔节期、 孕穗期、。

25、 开花期及乳 熟期； 0033 2)水样采集及浮游生物的沉淀分离： 采用5点取样法对所有转基因小区和非转基 因小区分别选取5个点， 每个点用带柄量杯采田水10L， 装入桶后， 先用25目过滤漏勺滤去水 稻凋落物和其它大块杂物， 再用23#生物网过滤， 将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀 器， 用水定容至1L， 沉淀4小时； 将沉淀后的水样用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶， 虹吸 时， 注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点， 控制流速， 缓缓虹吸， 以防吸出沉淀器底部的 颗粒沉淀物， 再次定容至1L， 制成含浮游生物水样(转移后的水样清澈透， 浮游生物清晰可 见)， 待测。 0034 根据以。

26、上方案， 所述稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定， 具体包括如下步骤： 说 明 书 3/7 页 6 CN 104982241 B 6 0035 1)确定调查的浮游生物种类： 调查种类包括： 原生动物类、 轮虫类、 枝角类、 桡足 类、 水生昆虫类； 0036 2)原生动物类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 吸出0.1ml注入血细胞计数框 中， 盖上盖玻片， 在光学显微镜下进行全片计数， 每份样品计数5片， 取平均值， 然后按浓缩 的倍数换算成1L水中的数量； 0037 3)轮虫类、 枝角类和桡足类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 用1ml自制的无 高刻度玻璃移液管吸取水样(微小水生动物。

27、定量计数管)， 并用自制的封口器封口， 在40倍 以下体视显微镜下进行全管计数， 每份样品计数5片， 取平均值， 然后按浓缩的倍数换算成 1L水中的数量； 0038 4)水生昆虫类： 用肉眼直接计数。 0039 根据以上方案， 所述转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价的方法为： 应用统计分析方法比较转基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、 浮游生物种类和数 量差异， 统计浮游生物多样性指数、 均匀性指数等参数， 并和常规稻田进行比较， 最终根据 统计分析结果综合分析转基因抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。 0040 大量研究表明转基因外源蛋白可从转基因作物根系和凋落物种释放到环境中， 。

28、水 稻田间需要保持水层， 而测定转基因水稻外源蛋白在水层中的浓度和扩散动态尚存在空 白。 本发明的每个试验单位设计成上游小区和下游小区， 上游种植转基因水稻， 下游种植非 转基因水稻， 下游非转基因水稻分为两类， 一类用源头水直接灌溉， 另一类用流经转基因水 稻小区的水灌溉。 如此设计可即可测定转基因稻田水层和淤泥中的外源蛋白， 也可测定外 源蛋白是否可随灌溉水向下游扩散。 0041 测定植物组织中外源蛋白表达量的通用方法为ELISA法， 该方法特异性好， 灵敏度 高， 测定灵敏度高低关键因素之一抽提缓冲液。 常用的抽提缓冲液配制方法为： 取500ml锥 形瓶分别加入： ddH2O 400ml。

29、， NaCl 4g， Na2HPO4 0.72g， KH2PO40.12g， KCl 0.1g至pH值为7.4， 加ddH2O至500ml， 然后平均分配到两个250ml锥形瓶， 分别加入1.125ml Tween20， 即为抽提 缓冲液。 此种抽提缓冲液适用于从植物组织中提取外源蛋白， 对土壤和水体中外源蛋白的 提取效率低下。 本发明设计的外源蛋白抽提缓冲液100mM Na2CO3， 100mM NaCl， 5mM乙二胺 四乙酸， 10mM二硫苏糖醇， 50mM Na4P2O710H2O， 1(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚， pH值为 10， 提取效率可达60以上。 水样中和淤泥中外源蛋白含量。

30、极微， 达不到ELISA试剂盒的检 测下限， 本发明设计的对外源蛋白进行浓缩的方法， 使ELISA试剂盒的检测下限降低到原来 的百分之一。 0042 水田中浮游动物个体小、 种类多， 对环境变化敏感， 是评价转基因抗虫水稻水生环 境安全性的理想指示生物。 水生生物学中对水体浮游动物的取样和定量为较成熟的技术方 法， 但实践表明这些方法不适用于水田浮游动物研究， 原因有二， 第一水田水层浅， 第二水 田水层中颗粒杂质多， 按通用的方法无法对水生动物进行鉴定和定量； 另外， 常规水生生物 学对水生浮游动物定量方法较复杂、 用具和设备的成本高。 本发明根据水田水层的特别设 计了取水体的方法， 通过初。

31、步除去杂质、 沉淀和虹吸等步骤分离水中浮游动物， 再用定制的 移液管在体视显微镜下进行种类鉴定和定量， 方法简便成本低廉。 0043 本发明的有益效果是： 0044 1)本发明的田间设计方法适用于监测转基因抗虫水稻向环境释放的外源蛋白的 说 明 书 4/7 页 7 CN 104982241 B 7 浓度、 监测外源蛋白随水流扩散的范围； 0045 2)本发明对外源蛋白抽提缓冲液进行了改进， 配合样品中外源蛋白的浓缩技术， 可使ELISA试剂盒的检测精度提高100倍； 0046 3)本发明设计了水田中微小浮游动物计数和定量方法， 适用于水田水层浅和颗粒 杂质多的特点， 自制的微小水生动物定量计数。

32、管， 大大简化了微小水生动物定量中的试剂 和用具， 降低了成本。 附图说明 0047 图1是本发明的田块划分示意图。 具体实施方式 0048 下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。 0049 本发明提供一种评价转基因抗虫水稻水生环境安全性的方法， 包括如下过程： 0050 (1)转基因稻田和非转基因稻田布置和管理， 包括如下步骤： 0051 1)选择地势平整、 水源方便的田块5块(用于环境安全的重复评价)， 田块面积400- 600m2， 长宽比范围2 1至1 1， 田周边及水源无生活污水污染； 0052 2)将步骤1)中的田块划分成小区， 田块周围筑不透水田埂及硬化沟渠； 为防止暴。

33、 雨漫灌， 田块周边建立良好排水沟； 所述田块划分成小区的具体方案为： 靠近水源的上游小 区并列设置两块转基因小区， 位于转基因小区下游的下游小区并列设置4块非轩基因小区； 所述两块转基因小区的上游与水源之间分别设立连通沟渠、 下游分别与中间的两块非转基 因小区通过沟渠连通； 所述非转基因小区的外侧两块分别通过沟渠与所述水源连通； 所述4 块非轩基因小区分别设置排水沟渠(见附图1)； 0053 3)在步骤2)中的上游小区种植转基因抗虫水稻， 下游小区种植非转基因水稻， 中 间两块非转基因小区用上游转基因小区的田水灌溉， 两侧的两块小区直接用水源中的水灌 溉； 0054 4)从移栽至成熟期， 不。

34、施用化学农药， 人工除草， 中期不晒田； 0055 (2)稻田水层和淤泥中外源蛋白的测定， 包括样本的预处理和外源蛋白的抽提与 通过ELISA法测定， 具体包括如下步骤： 0056 1)水样采集及预处理： 水样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 用 10ml离心管进行田间水样采集， 各小区分别取5管， 取上层清水， 拿回室内， 将每份样品转到 新的10ml离心管中， 然后进行冷冻， 冷冻后封上封口膜， 用针头在膜上扎孔， 然后放入冷冻 干燥机进行浓缩至干； 将干燥后的样品放入4低温保存， 待测； 0057 2)淤泥样品采集及预处理： 土样采集小区包括所有转基因小区和非转基因小区， 各拔。

35、5蔸水稻取根围淤泥， 装入50ml离心管， 带回室内放入-20冰箱冷冻， 然后放入冷冻干 燥机进行浓缩至干， 将干燥后的淤泥碾碎， 过80目筛除去根毛， 准确称取每份样品0.5g， 转 入到1.5ml离心管中， 放入4低温保存， 待测； 0058 3)外源蛋白抽提缓冲液配制： 100mM Na2CO3， 100mM NaCl， 5mM乙二胺四乙酸， 10mM 二硫苏糖醇， 50mM Na4P2O710H2O， 1(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚， pH值为10； 0059 4)外源蛋白的抽提与测定： 分别将步骤1)与2)中的样品加入到外源蛋白抽提缓冲 说 明 书 5/7 页 8 CN 104982。

36、241 B 8 液中进行抽提， 再用ELISA试剂盒进行外源蛋白的测定； 0060 (3)稻田水层中浮游生物的分离， 包括水样采集、 游生物的沉淀分离， 具体包括如 下步骤： 0061 1)确定调查时间： 调查时间分别选在水稻的分蘖期、 拔节期、 孕穗期、 开花期及乳 熟期； 0062 2)水样采集及浮游生物的沉淀分离： 采用5点取样法对所有转基因小区和非转基 因小区分别选取5个点， 每个点用带柄量杯采田水10L， 装入桶后， 先用25目过滤漏勺滤去水 稻凋落物和其它大块杂物， 再用23#生物网过滤， 将过滤网内的剩余物移入1L浮游生物沉淀 器， 用水定容至1L， 沉淀4小时； 将沉淀后的水样。

37、用虹吸方法将上层清液转至1L容量瓶， 虹吸 时， 注意将虹吸管的一端放在液面稍下一点， 控制流速， 缓缓虹吸， 以防吸出沉淀器底部的 颗粒沉淀物， 再次定容至1L， 制成含浮游生物水样(转移后的水样清澈透， 浮游生物清晰可 见)， 待测； 0063 (4)稻田水层中浮游生物种类和丰度的测定， 具体包括如下步骤： 0064 1)确定调查的浮游生物种类： 调查种类包括： 原生动物类、 轮虫类、 枝角类、 桡足 类、 水生昆虫类； 0065 2)原生动物类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 吸出0.1ml注入血细胞计数框 中， 盖上盖玻片， 在光学显微镜下进行全片计数， 每份样品计数5片， 取平均。

38、值， 然后按浓缩 的倍数换算成1L水中的数量； 0066 3)轮虫类、 枝角类和桡足类的计数： 将含浮游生物水样充分摇匀， 用1ml自制的无 高刻度玻璃移液管吸取水样， 并用自制的封口器封口， 在40倍以下体视显微镜下进行全管 计数， 每份样品计数5片， 取平均值， 然后按浓缩的倍数换算成1L水中的数量； 0067 4)水生昆虫用肉眼直接计数； 0068 (5)转基因抗虫水稻的种植对浮游生物的安全性评价： 应用统计分析方法比较转 基因稻田和非转基稻因田外源蛋白浓度差异、 浮游生物种类和数量差异， 统计浮游生物多 样性指数、 均匀性指数等参数， 并和常规稻田进行比较， 最终根据统计分析结果综合分。

39、析转 基因抗虫水稻的种植对水生生物的安全性。 0069 (6)具体的评价结果： 0070 以转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的2个明恢63水稻为材料， 在常规田间管理模式下评 价了Bt稻对水生浮游动物的安全性。 对Bt和非Bt稻田水层中的轮虫、 枝角和桡足3类浮游动 物进行了2次多样性和丰度调查， 第一次调查显示Bt田中发现21个浮游动物物种， 而在非Bt 田中仅鉴定了4种， 第二次在Bt田中鉴定到24个浮游动物物种， 而非Bt田中鉴定了16种； 在 两次调查中浮游动物丰度在Bt田和非Bt田之间均出现了极显著差异， 非Bt田中的丰度分别 比Bt田中的丰度少95和80。 0071 表1 转基因和非转基因水稻小区浮游动物种类与丰度调查结果 说 明 书 6/7 页 9 CN 104982241 B 9 0072 0073 0074 以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案， 尽管上述实施例对本发明进 行了详细说明， 本领域的相关技术人员应当理解： 可以对本发明进行修改或者同等替换， 但 不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。 说 明 书 7/7 页 10 CN 104982241 B 10 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 11 CN 104982241 B 11 。