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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610351137.0 (22)申请日 2016.05.25 (71)申请人 唐朝晖 地址 430030 湖北省武汉市硚口区， 宝丰路 23号， 时代天骄小区,5栋1806房 (72)发明人 唐朝晖 余彦 唐庭轩 (51)Int.Cl. A61K 31/7016(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (54)发明名称 -乳糖在制备治疗脓毒症的药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于治疗脓毒症的方法。 具体为， 本发明的多个方面涉及将-乳糖用于 制。
2、备治疗脓毒症的药物中的应用。 -乳糖是一 种双糖， 是乳糖的一种端基异构体。 研究表明皮 下注射-乳糖溶液能显著提高脓毒症模型小鼠 的28天生存率； 能显著改善脓毒症后炎症因子瀑 布样释放及免疫细胞大量凋亡导致的免疫紊乱， 能减轻脓毒症诱发的肝损伤。 -乳糖是一种 中 华人民共和国药典 收录的药用辅料， 作为矫味 剂或填充剂被广泛使用； 其价格低， 理化特性及 毒性清楚， 易溶于水， 可静脉注射， 副作用轻微。 在目前脓毒症患者发病率高， 死亡率高， 且缺乏 有效治疗药物的现状下， -乳糖用于制备治疗 脓毒症的药物有着巨大的应用价值及前景。 权利要求书1页 说明书9页 附图7页 CN 1065。
3、81014 A 2017.04.26 CN 106581014 A 1. -乳糖在制备治疗脓毒症的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述 -乳糖化合物的通式为， -乳糖分子 式： C12H22O11。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 制备治疗各种原因引起的脓毒症的药物中 的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 制备治疗各种由感染引起的脓毒症的药物 中的应用。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 使用 -乳糖制备的药物是通过不同的溶剂 将 -乳糖稀释， 制备为注射剂或溶液剂给药。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 稀。
4、释 -乳糖的溶剂包括但不仅限于： 电解 质溶液、 葡萄糖溶液、 果糖溶液。 7.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 使用 -乳糖制备的药物是通过不同的溶剂 将 -乳糖以不同浓度稀释， 制备为注射剂或溶液剂给药。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， -乳糖稀释浓度包括但不仅限于： 从1%至 50%的稀释浓度。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106581014 A 2 -乳糖在制备治疗脓毒症的药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医学技术领域， 涉及将 -乳糖用于制备治疗脓毒症的药物中的应 用。 0002 背景技术 0003 脓毒症是由严重创伤、 烧伤、 休克。
5、、 感染等危重症诱发的一种全身炎症反应综合 征， 是临床危重症患者最常见死因之一。 近年来， 脓毒症发病率不断攀升， 其已成为一个重 要的公共健康问题1。 据美国统计， 每1000位住院患者中就有3人发生脓毒症， 同时这一数字 以每年2-8%的速度上升2。 据不完全统计， 我国每年新发生脓毒症超过300万例3。 尽管采取了 抗感染、 液体复苏及相关脏器功能支持等多种综合治疗措施， 但至今仍无脓毒症的特效疗 法， 其总体病死率仍居高不下。 来自美国的研究统计了551家医院的87166例脓毒症患者， 结 果显示脓毒症病死率近年有所下降， 但仍然高达30%。 美国每年因脓毒症死亡的患者约占美 国总死。
6、亡人数的 ， 已超过了前列腺癌、 乳腺癌和HIV致死人数的总和2。 中国的大宗临床 研究显示， 中国脓毒症患者较西方国家更为常见， 且死亡率更高。 随着中国人口的老龄化、 抗生素的滥用、 耐药菌增多等多种因素， 中国的脓毒症患者目前处于爆发性增长期。 除高发 病率及高死亡率外， 脓毒症的治疗费用也非常高， 例如， 在美国每年用于脓毒症治疗的的医 疗费用高达170亿美元； 而在中国， 脓毒患者人均治疗费用约为10万余元。 故， 脓毒症成为人 类健康的巨大威胁以及社会经济发展的沉重负担2-3。 0004 面对脓毒症威胁， 各国都开展了广泛而深入的研究工作， 希望能找到有效的治疗 及干预方法。 目前。
7、， 脓毒症的治疗已成为现代临床危重症医学研究持续关注的焦点。 由于脓 毒症发病机制极其复杂， 涉及局部和全身性反应的复杂免疫病理过程， 而目前尚未完全掌 握脓毒症的病变机制， 除了抗感染及支持治疗外， 目前对其治疗尚无突破性进展4。 若希望 开发有效的脓毒症治疗方法， 最核心的工作是加强对其复杂病变机制研究， 这是当前脓毒 症救治中的最紧迫任务。 一、 免疫紊乱在脓毒症病变机制中居核心环节 虽然脓毒症的病变机制仍不完全明晰， 但经多年研究目前主流观点均认同免疫紊乱在 脓毒症的病变机制中居核心环节4。 脓毒症患者由于创伤、 感染等因素迅猛激活了体内免疫 炎症应答机制， 致脓毒症早期出现促炎症因子。
8、 “瀑布” 样释放， 诱发全身炎症反应综合症 （SIRS） ； 随后或同时激活机体抗炎机制， 致使抗炎因子 “泛滥” 分泌， 诱发机体出现代偿性抗 炎反应综合症 （CARS） 。 SIRS/CARS的剧烈冲击干扰了免疫系统稳态;随着脓毒症的进展,诱 发机体出现严重的固有免疫和获得性免疫紊乱， 导致免疫抑制， 具体表现为： 免疫细胞大量 凋亡， 迟发性过敏反应消失， 对条件致病菌的易感性增加， 最终诱发循环、 呼吸、 肝脏等多器 官功能损害而致患者死亡。 已有大量的基础及临床研究提示： 脓毒症患者生存率与其机体 免疫稳态的恢复密切相关， 并认为针对性的免疫调理是脓毒症取得治疗突破的重要途径4。 。
9、说 明 书 1/9 页 3 CN 106581014 A 3 0005 二、 脓毒症免疫治疗的困境 正是基于脓毒症后免疫紊乱的认识， 研究者针对脓毒症患者免疫反应过程中的不同靶 点， 进行了大量有关免疫调节的基础和临床研究， 例如， 使用TNF、 IL-1单抗以拮抗脓毒症后 炎症因子瀑布样释放； 再如， 使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 干扰素 （IFN- )、 白介素-7( IL-7)或白介素-15( IL-15)等以改善脓毒症晚期的免疫抑制状况5。 以上 方法虽在动物模型上取得了一定成效， 但不幸的是所有的相关三期临床研究均以失败告 终。 实验数据均未提示这些处理在实际临。
10、床应用中对改善脓毒症患者的预后有帮助， 有些 处理甚至会加重患者病情。 究其原因， 主要是由于不同患者其脓毒症诱因不同， 导致患者在 不同的病变阶段， 机体处于不同的免疫状态， 甚至在相同的病变阶段， 不同的患者也可能处 于迥异的免疫状态。 故而， 脓毒症后的机体免疫紊乱极度复杂多样。 随着基因组和蛋白组学 研究的深入， 发现众多的细胞因子/蛋白参与了脓毒症后免疫紊乱， 其特点为， 网络化、 交互 式、 时效性、 及非线性模式。 这提示， 单一的阻断性或促进性的免疫调节治疗效果太过局限， 无法根本上扭转脓毒症后复杂的机体免疫紊乱状况。 应从总体入手， 希望能全面的改善脓 毒症患者的免疫紊乱以达。
11、到治疗的目的。 要实现该目标， 我们需要进一步加深对脓毒症病 理生理的研究与认识， 需要一些新的治疗靶点及方向5。 0006 三、 Tim-3信号在NKT细胞高表达与脓毒症后免疫紊乱密切相关 我们的近期研究工作不仅揭示NKT 细胞在脓毒症后免疫紊乱中居于核心地位， 还深入 研究了NKT细胞参与脓毒症后免疫紊乱调控的内在机制。 我们发现: Tim-3信号在NKT细胞 的高表达与脓毒症后免疫紊乱密切相关中。 0007 Tim-3是一种表达于多种免疫细胞表面的新型细胞跨膜蛋白9-10。 Tim-3的配体为 Galectin-9 （Gal-9） 11。 Gal-9与不同免疫细胞表面的Tim-3结合， 。
12、发挥着多种迥异的免疫调 控作用。 近年多篇发表在Science ，Nature Medicine 的文章指出： Tim-3信号通路在机 体免疫炎症调控中居于核心地位12-13。 0008 我们近年来一直在持续研究Tim-3在免疫调控方面的作用， 特别是对其在NKT细胞 的调控中作用的研究取得突破性进展。 我们首次阐明： Tim-3是NKT细胞活化标志， Tim-3+ NKT 细胞处于活化的状态并分泌大量IFN-。 Tim-3信号对NKT细胞功能同时存在正、 负 “双 通道” 的调控。 一方面， Tim-3的配体(Gal-9)与NKT细胞表面表达的Tim-3结合， 迅速诱导NKT 细胞凋亡； 另。
13、一方面， Gal-9与巨噬细胞表面的Tim-3作用后促使其分泌IL-15， 诱导NKT细胞 的增殖， 从而维持NKT细胞的稳态。 我们证实： Tim-3信号桥接固有免疫及获得性免疫系统精 确的调节了NKT细胞的功能及体内平衡， 最终实现对体内免疫稳态的调控14。 0009 在此基础上， 最近， 我们深入观察了Tim-3信号与脓毒症免疫紊乱间的关系。 我们 的研究结果显示： Tim-3在脓毒症患者的CD4+T细胞、 NKT细胞、 NK细胞中急剧高表达， 并与 脓毒症疾病严重度及预后高度相关。 在脓毒症小鼠中， Tim-3表达在CD4+T细胞、 NK细胞、 NKT 细胞显著增高， 且Tim-3+N。
14、KT细胞是脓毒症后IFN-分泌的主要来源。 Tim-3高表达也是NK、 NKT等细胞大量凋亡的主要诱因。 另外， 我们通过在体删除Tim-3 （Tim-3缺陷小鼠） 的功能后 发现， 缺失Tim-3功能可显著改善肝脏损伤及脓毒症小鼠的早期生存率 （28天） 仍无提高。 这些前期研究提示我们： Tim-3信号 说 明 书 2/9 页 4 CN 106581014 A 4 与脓毒症后免疫紊乱密切相关， Tim-3高表达诱发过度炎症反应对机体有害， 但Tim-3的缺 失亦不利于免疫紊乱的纠正。 0010 四、 -乳糖干扰了Tim-3/Galectin-9信号通路的效应 受前述研究启发， 着眼于恢复免。
15、疫稳态， 我们尝试通过阻断Tim-3通路间信号传递来干 预脓毒症后免疫紊乱。 我们使用Tim-3号通路阻断剂， -乳糖 （竞争性抑制Tim-3与其受体 Galectin-9的结合)来干扰Tim-3通路的信号传递， 观察了其在脓毒症中的作用效应。 乳糖 （Lactose） 是一种存在于哺乳动物乳汁中的双糖, 由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形 成,分子式为C12H22O11， 摩尔质量为342.3克。 其有两种端基异构体： -乳糖和 -乳糖。 我们前 期研究提示， -乳糖在Tim-3/Galectin-9信号通路中发挥着特殊的效应。 其在不同类型的 免疫细胞上发挥着迥异的调控作用。 一方面其可特。
16、异性的竞争NKT细胞表面表达的Tim-3结 合位点， 阻断Galectin-9(Tim-3 L)与Tim-3的结合， 从而干扰Tim-3/Galectin-9信号通路 的效应。 例如， -乳糖 （40mmol） 浓度时可几乎完全阻断Galectin-9经Tim-3作用诱导的NKT 细胞的凋亡。 另一方面， 其可与树突状细胞表面的Tim-3结合， 阻断Galectin-9经Tim-3作用 诱导的树突状细胞分泌IL-12， 后者是脓毒症中导致NKT细胞表面Tim-3增高的主要原因。 0011 应用 -乳糖干扰Tim-3/Galectin-9信号通路， 从而干预脓毒症后的免疫紊乱的实 验取得了令人惊。
17、异的结果。 脓毒症小鼠在不同时段经皮下注射-乳糖 （10%， 200ul） 后， 显著 改善了免疫紊乱， 包括减轻了炎症因子的 “瀑布样” 释放， 减少了全身炎症反应， 遏制了免疫 细胞的大量凋亡， 以及显著的减轻肝脏损伤。 特别引人注目的是， -乳糖干预显著降低了脓 毒症小鼠的死亡率， 将脓毒症小鼠的28天平均死亡率从77%降到仅有23%。 这些数据表明， 通 过-乳糖阻断Tim-3信号通路可改善脓毒症免疫紊乱， 最终达到提高了脓毒症疗效的目的。 0012 -乳糖是 中华人民共和国药典 收录的药物， 其常被用作药物的矫味剂或赋形 剂。 -乳糖可从乳清中提取， 易溶于水,味微甜。 其用途主要包。
18、括,在食品工业中用于制造婴 儿食品、 糖果、 人造牛奶等。 目前没有关于单独使用 -乳糖作为临床药剂治疗疾病的报道， 更无应用 -乳糖治疗脓毒症的报道。 0013 发明内容 0014 本发明的目的是提供 -乳糖用于制备治疗脓毒症的药物中的应用。 0015 本发明为了实现上述目的， 通过经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症小鼠模型， 然 后给予脓毒症小鼠皮下注射不同浓度的 -乳糖溶液 （对照组使用等量的平衡盐溶液） 处理， 观察了在使用 -乳糖处理后， 对脓毒症小鼠的生存率、 免疫紊乱状况及重要脏器功能损害 的影响。 评估了 -乳糖溶液对脓毒症小鼠的治疗效果。 研究结果提示， -乳糖能显著地提高 脓毒。
19、症小鼠的28天生存率， 能有效的抑制脓毒症后早期的炎症因子爆发性释放， 能有效的 改善脓毒症后免疫细胞的凋亡， 能减缓脓毒症后肝脏功能的损害。 因此， 使用 -乳糖可有效 的改善脓毒症， 临床应用前景良好。 0016 与现有技术相比， 本发明具有以下优势： 1. -乳糖是 中华人民共和国药典 收录药物。 该药物目前作为口服药物的赋形剂被广 说 明 书 3/9 页 5 CN 106581014 A 5 泛使用， 其理化特性、 毒性及致畸变特性清楚， 临床转化方便。 0017 2. -乳糖易溶于水， 可静脉注射， 临床使用方便。 -乳糖以原型从肾脏排泄， 副作 用轻微。 0018 3. -乳糖来源。
20、广泛， 制备价格低廉， 如使用将有可能大幅降低脓毒症相关医疗费 用。 0019 4. -乳糖具有广泛的免疫调节作用， 其应有后可同时改善脓毒症后的两大的免疫 病理特征： 炎症因子瀑布样释放及免疫细胞的大量凋亡， 从而整体改善脓毒症后的免疫紊 乱状况。 且 -乳糖本身并不具有直接的抗炎或促炎的作用， 故减少了其使用后导致进一步 免疫紊乱的风险。 0020 5. -乳糖可以减轻脓毒症后重要脏器的功能损害， 例如其使用后可有效改善脓毒 症后肝脏功能的障碍， 减低脓毒症后多脏器功能不全的风险。 0021 附图说明： 图1. 脓毒症模型小鼠制备 图2. -乳糖处理对脓毒症模型小鼠生存率的影响 图3. -。
21、乳糖处理对脓毒症小鼠外周血炎症因子IFN-水平的影响 图4. -乳糖处理对脓毒症小鼠外周血炎症因子IL-6水平的影响 图5. -乳糖处理对脓毒症小鼠外周血炎症因子IL-10水平的影响 图6. -乳糖处理对脓毒症小鼠脾脏中炎症因子IFN- mRNA表达的影响 图7. -乳糖处理对脓毒症小鼠脾脏中炎症因子IL-6 mRNA表达的影响 图8. -乳糖处理对脓毒症小鼠脾脏中炎症因子IL-10 mRNA表达的影响 图9. -乳糖处理对脓毒症后8,24小时小鼠脾脏CD4+T细胞亚群比率的影响 图10. -乳糖处理对脓毒症后8,24小时小鼠脾脏NKT细胞亚群比率的影响 图11. -乳糖处理对脓毒症后8,24。
22、小时小鼠脾脏NK细胞亚群比率的影响 图12. -乳糖处理对脓毒症后24小时小鼠脾脏CD4+T细胞凋亡的影响 图13. -乳糖处理对脓毒症后24小时小鼠脾脏NKT细胞凋亡的影响 图14. -乳糖处理对脓毒症后24小时小鼠脾脏NK细胞凋亡的影响 图15. -乳糖处理显著地改善了脓毒症诱发的肝脏损伤 （生理盐水： CLP后24小时， 生 理盐水组， 200倍。 a-乳糖： CLP后24小时， a-乳糖组， 200倍） 图16. -乳糖处理显著地减低了脓毒症后24小时谷草转氨酶(ALT)的水平 图17. -乳糖处理显著地减低了脓毒症后24小时谷丙转氨酶(AST)的水平 具体实施方式： 本文中公开了本发。
23、明的详细实施方案； 然而， 应当理解所公开的实施方案仅是说明可 以按多种形式体现的本发明。 本文中所给出的与本发明的多个实施方案相关的每个实施例 意在是示意性的并且非限制性的。 本文中附图不必然地按照比例， 可以放大一些特征以显 示特定组分的细节。 此外， 图中所显示的任何量值、 说明等意在是示意性的并且非限制性 的。 故， 本文中公开的特定结构和功能细节不得理解为限制性的， 而仅应理解为指导本领域 相关技术人员以多种方式使用本发明的代表性基础。 如果不脱离本发明的精神和范围， 对 本发明进行修改或等同替换的， 均应涵盖在本发明的权利要求的保护范围之中。 说 明 书 4/9 页 6 CN 10。
24、6581014 A 6 0022 实施例一； 观察使用 -乳糖处理对脓毒症小鼠的生存率的影响。 0023 脓毒症小鼠模型的制备： 以经典的盲肠结扎穿孔 （CLP） 法制备脓毒症小鼠模型， 详细方法见参考文献15， 具体操 作见附图1。 该模型可模拟人的多重细菌感染导致的脓毒症。 以假手术组为对照。 脓毒症小 鼠72小时死亡率约为70%， 假手术组小鼠72小时死亡率小于5%。 0024 1.2 使用 -乳糖处理对脓毒症小鼠生存率的影响： C57BL/6小鼠， 雄性， 周龄为8周， 体重为2024g。 小鼠盲肠结扎穿孔 （CLP） 法制备脓毒 症小鼠模型， 造模成功后， 所有小鼠随机分为乳糖组、 。
25、蔗糖组 （与乳糖类似， 也是一种双糖） 与对照组， 各组小鼠均为30只。 乳糖组： 脓毒症小鼠于建模后0、 2、 6、 18、 36、 72小时， 经皮下 注射0.9%生理盐水配制的浓度为10%的 -乳糖溶液200ul。 蔗糖组： 脓毒症小鼠于建模后0、 2、 6、 18、 36、 72小时， 经皮下注射0.9%生理盐水配制的浓度为10%的蔗糖溶液200ul。 对照 组： 脓毒症小鼠分别于建模后0、 2、 6、 18、 36、 72小时， 经皮下注射0.9%的生理盐水200ul。 2 组实验动物连续观察28天， 观察期间正常喂养， 详细记录每天各组小鼠的生存死亡情况。 0025 实验结果： 通。
26、常情况下， 脓毒症小鼠72小时死亡率约为60-80%15， 经皮下注射 -乳糖溶液处理后， 显著改善了脓毒症小鼠的早期死亡率， 治疗组小鼠的建模后72小时死亡率为13%， 与之相对 应的对照组脓毒症小鼠的死亡率为63%。 经生存曲线可看出在脓毒症的早期 （72小时） ， 中期 （7天） 及晚期 （28天） ， 治疗组小鼠的死亡率较对照组显著下降 （见附图2） 。 在脓毒症后28天， 对照组小鼠的死亡率高达77%， 而乳糖组小鼠的死亡率仅为23%。 经long-rank 检验证实在 脓毒症的早、 中、 晚期， 2组间小鼠的死亡率存在显著性差异 （p0.05） 和极显著差异 （p 0.01） 。 。
27、脓毒症小鼠经同样为双糖的蔗糖处理后， 蔗糖组小鼠的死亡率与对照组无差异， 这 说明 -乳糖的治疗效果并不是由于给脓毒症小鼠补充了糖类物质 （见附图2） 。 0026 实施例二； 观察了在使用 -乳糖处理后， 对脓毒症小鼠免疫紊乱状况的影响。 0027 脓毒症后炎症因子的瀑布样释放及免疫细胞的大量凋亡导致的免疫细胞亚群比 率及细胞数量的锐减是脓毒症后免疫功能紊乱的两大突出特征。 本部分实验主要观察了使 用 -乳糖处理后， 对脓毒症小鼠免疫紊乱状况的影响。 0028 脓毒症小鼠模型的制备及处理 C57BL/6小鼠， 雄性， 周龄为8周， 体重为20-24g。 小鼠盲肠结扎穿孔 （CLP） 法制备脓。
28、毒症 小鼠模型， 方法同前1.1。 造模成功后， 所有小鼠随机分为治疗组与对照组。 乳糖组： 脓毒症 小鼠于建模后0、 2、 6、 18、 36小时， 经皮下注射0.9%生理盐水配制的浓度为10%的 -乳糖溶 液200ul。 对照组： 脓毒症小鼠分别于建模后0、 2、 6、 18、 36小时， 经皮下注射0.9%的生理盐 水200ul。 分别于脓毒症后8、 24、 48小鼠处死小鼠， 各组小鼠均为6只。 0029 2.2 脓毒症小鼠炎症因子表达的变化 2.2.1 通过酶联免疫吸附法 （ELISA法） 检测了脓毒症后不同时段， 乳糖组与对照组小 鼠的外周血中炎症因子IFN-、 IL-6、 IL-。
29、10蛋白表达。 检测试剂采用美国ebioscience公司 说 明 书 5/9 页 7 CN 106581014 A 7 的小鼠IFN-、 IL-6、 IL-10 ELISA试剂盒完成。 具体检测步骤根据试剂公司提供的操作指 南实施。 0030 2.2.2通过实时定量聚合酶链式反应法 （RT-PCR） 检测了脓毒症后不同时段， 乳糖组与 对照组小鼠的脾脏组织中炎症因子IFN-、 ,TNF- 、 IL-6、 IL-10 mRNA表达。 小鼠的IFN-、 IL-6和IL-10基因引物， 及看家基因GADPH引物由美国Invitrogen公司提供。 逆转录PCR及 定量PCR检测采用美国Applie。
30、d Biosystems公司的检测试剂盒及7900HT检测系统完成。 具 体检测步骤根据试剂公司提供的操作指南实施。 引物序列如下： 引物序列 2.3脓毒症小鼠免疫细胞的变化 通过流式细胞术 （FACS） 检测了脓毒症后不同时段， 乳糖组与对照组小鼠的脾脏中CD4+ T细胞、 CD8+T细胞及NKT细胞等免疫细胞亚群的变化及细胞凋亡的改变。 免疫细胞表面标记 的采用美国ebioscience公司的抗鼠CD3, CD4, CD8, NK1.1荧光单克隆抗体染色。 细胞凋 亡的检测采用美国ebioscience公司的凋亡检测试剂盒经Annexin V及7-AAD染色。 所有的 流式细胞检测采用美国。
31、BD公司的FACS Calibur流式细胞仪完成。 0031 实验结果 通过10%的 -乳糖溶液200ul处理后， 不同时段的乳糖组脓毒症小鼠的外周血炎症因子 IFN-、 IL-6、 IL-10的浓度均显著下降， 且与同时段的对照组小鼠相比差异有显著性 （见附 图3-5） 。 不同时段的乳糖组脓毒症小鼠脾脏组织中炎症因子IFN-、 IL-6、 IL-10 mRNA表达 亦出现显著下降， 且与同时段的对照组小鼠相比差异有显著性 （见附图6-8） 。 该结果提示脓 毒症后的炎症因子的瀑布样释放的状况得以缓解。 0032 脓毒症后免疫细胞出现大量的凋亡是导致脓毒症后期机体出现免疫抑制的关键。 而经 。
32、10%的 -乳糖溶液200ul处理后， 不同时段的乳糖组脓毒症小鼠的脾脏中的CD4+T细胞、 CD8+ T细胞、 NKT细胞亚群比率及细胞数量减少的趋势得以缓解 （见附图9-11） ， 免疫细胞大量凋 亡的现象得以遏制， 且与同时段的对照组小鼠相比差异有显著性 （见附图12-14） 。 该结果提 示脓毒症后的免疫细胞大量凋亡所诱发的免疫抑制得以改善。 0033 实施例三； 观察使用 -乳糖处理对脓毒症小鼠肝脏功能损害的影响。 0034 脓毒症极易诱发重要脏器功能的障碍， 特别是肝脏功能的障碍， 而肝脏在机体的 说 明 书 6/9 页 8 CN 106581014 A 8 代谢调节、 自主防御、。
33、 细菌清除中居于核心地位。 脓毒症后的肝脏功能障碍是患者预后不良 的重要独立预测因子。 本部分实验主要观察了使用 -乳糖处理对脓毒症小鼠肝脏损害的影 响。 0035 脓毒症小鼠模型的制备及处理 C57BL/6小鼠， 雄性， 周龄为8周， 体重为20-24g。 小鼠盲肠结扎穿孔 （CLP） 法制备脓毒症 小鼠模型， 方法同前1.1。 造模成功后， 所有小鼠随机分为治疗组与对照组。 乳糖组： 脓毒症 小鼠于建模后0、 2、 6、 18、 36小时， 经皮下注射0.9%生理盐水配制的浓度为10%的 -乳糖溶 液200ul。 对照组： 脓毒症小鼠分别于建模后0、 2、 6、 18、 36小时， 经皮下。
34、注射0.9%的生理盐 水200ul。 分别于脓毒症后24小时处死小鼠， 心室穿刺采血及切除肝脏组织。 各组小鼠均为6 只。 0036 3.2 脓毒症小鼠肝脏的病理学改变 切除约1.0cm3的小鼠肝脏组织， 10%甲醛固定48小时， 石蜡包埋组织块， 切片(4m)， 苏 木精-伊红 （HE） 染色。 每份切片于高倍 （200） 显微镜下随机选取20个视野， ColorView光学 系统采集高清图像， 双盲法由2位病理医生独立评估每份肝脏组织的病理学改变。 0037 脓毒症小鼠肝脏的血清酶学改变 将脓毒症后不同时段采集的血清标本冻存于-80 C深低温冰箱。 使用小鼠的谷草转氨 酶(AST)及谷丙转。
35、氨酶(ALT)试剂盒(Sigma-Aldrich公司)检测小鼠外周血清酶学的改变。 具体检测步骤根据试剂公司提供的操作指南实施。 0038 3.4 实验结果 通过高倍光学显微镜观察HE染色的肝脏石蜡切片显示, 脓毒症诱发了严重的肝脏损 伤， 例如， 肝细胞显著地的肿胀、 坏死， 而且肝小叶结构被破坏， 汇管区充血及中性粒细胞的 浸润。 应用 -乳糖显著地改善了脓毒症诱发的肝脏损伤， 肝细胞坏死、 变性及中心粒细胞浸 润显著减少 （见附图15） 。 另外， 与对照组相比， 乳糖组的脓毒症小鼠的谷草转氨酶(AST)及 谷丙转氨酶(ALT)水平也显著下降， 提示应用 -乳糖处理显著地改善了肝功能 （。
36、见附图16- 17） 。 0039 参考文献 : 1.Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medecine. 2003, 348(2):138-150. 2.Esper AM, Martin GS. Extending international sepsis epidemiology: the impact of organ dysfunction. Critical Care.2009,13(1):120. 3.Zhou J, Qian C, Z。
37、hao M, Yu X, Kang Y, Ma X, Ai Y, Xu Y, Liu D, An Y, Wu D, Sun R, Li S, Hu Z, Cao X, Zhou F, Jiang L, Lin J, Mao E, Qin T, He Z, Zhou L, Du B; China Critical Care Clinical Trials Group. Epidemiology and outcome of severe sepsis and septic shock in intensive care units in mainland China. PLoS One. 201。
38、4,16;9(9):e107181. 4.Hotchkiss RS, Opal S. Immunotherapy for sepsis-a new approach against 说 明 书 7/9 页 9 CN 106581014 A 9 an ancient foe. New England Journal of Medecine. 2010,363(1):87-89. 5.Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D.Immunosuppression in sepsis: a novel understanding of the disorder and a n。
39、ew therapeutic approach. Lancet Infect Disease. 2013,13(3):260-8 6.Bendelac A, Savage PB, Teyton L. The biology of NKT cells. Annual Review Immunology.2007,25: 297-336. 7.Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D.Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Review Im。
40、munology. 2013, 13(12):862-74. 8.Y. Kinjo, P. Illarionov, J.L. Vela, B. Pei, E. Girardi, X. Li, Y. Li, M. Imamura, Y. Kaneko, A. Okawara, Y. Miyazaki, A. Gomez-Velasco, P. Rogers, S. Dahesh, S. Uchiyama, A. Khurana, K. Kawahara, H. Yesilkaya, P.W. Andrew, C.H. Wong, K. Kawakami, V. Nizet, G.S. Besra。
41、, M. Tsuji, D.M. Zajonc, M. Kronenberg. Invariant natural killer T cells recognize glycolipids from pathogenic Gram-positive bacteria. Nature Immunology. 2011,12(10):966-974. 9.L. Monney, C.A. Sabatos, J.L. Gaglia, A. Ryu, H. Waldner, T. Chernova, S. Manning, E.A. Greenfield, A.J. Coyle, R.A. Sobel,。
42、 G.J. Freeman, V.K. Kuchroo. Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease. Nature.2002,415(6871): 536- 541. 10.A. Sanchez-Fueyo, J. Tian, D. Picarella, C. Domenig, X.X. Zheng, C.A. Sabatos, N. Manlongat, O. Bender, T. Kamradt, V.K. Kuc。
43、hroo, J.C. Gutierrez- Ramos, A.J. Coyle, T.B. Strom. Tim-3 inhibits T helper type 1-mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunological tolerance. Nature Immunology. 2003, 4(11): 1093-1101. 11.C. Zhu, A.C. Anderson, A. Schubart, H. Xiong, J. Imitola, S.J. Khoury, X.X. Zheng, T.B. Stro。
44、m, V.K. Kuchroo. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity. Nature Immunology. 2005,6(12):1245-1252. 12.A.C. Anderson, D.E. Anderson, L. Bregoli, W.D. Hastings, N. Kassam, C. Lei, R. Chandwaskar, J. Karman, E.W. Su, M. Hirashima, J.N. Bruce, L.P. Kane, V.K. Kuchroo, D。
45、.A. Hafler.Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells. Science.2007,318(5853):1141- 1143. 13.M. Rangachari, C. Zhu, K. Sakuishi, S. Xiao, J. Karman, A. Chen, M. Angin, A. Wakeham, E.A. Greenfield, R.A. Sobel, H. Okada, P.J. McKinnon, T.W. Mak, M.M.。
46、 Addo, A.C. Anderson, V.K. Kuchroo. Bat3 promotes T cell responses and autoimmunity by repressing Tim-3-mediated cell death and exhaustion. Nature Medicine, 2012,18(9):1394-1400. 14.Tang ZH, Liang S, Potter J, Jiang X, Mao HQ, Li Z. Tim-3/galectin-9 说 明 书 8/9 页 10 CN 106581014 A 10 regulate the home。
47、ostasis of hepatic NKT cells in a murine model of nonalcoholic Fatty liver disease. The Journal of Immunology.2013, 190(4): 1788-1796. 15.Rittirsch D, Huber-Lang MS, Flierl MA, & Ward PA (2009) Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat Protoc 4(1):31-36. 说 明 书 9/9 页 11 CN 106581014 A 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/7 页 12 CN 106581014 A 12 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/7 页 13 CN 106581014 A 13 图6 图7 说 明 书 附 图 3/7 页 14 CN 106581014 A 14 图8 图9 说 明 书 附 图 4/7 页 。