胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610886115.4 (22)申请日 2016.10.11 (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省杨凌示范区邰城路3号 (72)发明人 肖书奇 周恩民 李爽 蒲锋星 (74)专利代理机构 洛阳公信知识产权事务所 (普通合伙) 41120 代理人 程茗 (51)Int.Cl. A61K 31/4025(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 1/12(2006.01) (54)发明名称 胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上 。

2、的应用 (57)摘要 本发明涉及胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻 病毒药物上的应用， 属于抗病毒研究技术领域， 所述药物包括胆绿素和医药学上可接受的一种 或多种辅料， 其中胆绿素的抗牛病毒性腹泻病毒 的有效浓度为50-200mol/L。 本发明首先采用 qPCR、 TCID50和Western Blot的方法检测胆绿素 对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中复制的影响， 进一步明确其对病毒吸附和内化的影响， 然后检 测不同浓度的胆绿素处理对MDBK细胞增殖活性 的影响， 明确了胆绿素在抗牛病毒性腹泻病毒上 的作用， 为制备抗牛病毒性腹泻病毒药物提供了 依据。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 。

3、106539789 A 2017.03.29 CN 106539789 A 1.胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用， 其特征在于： 胆绿素浓度梯度依 赖性抑制牛病毒性腹泻病毒mRNA的表达。 2.如权利要求1所述的胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用， 其特征在于： 胆绿素浓度梯度依赖性抑制牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS5B的表达。 3.一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 其特征在于： 以胆绿素作为有效成分， 并结合 辅料配制而成。 4.根据权利要求3所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 其特征在于： 所述药物 制剂为注射剂或口服剂。 5.如权利要求4所述的一种抗牛病毒性腹泻。

4、病毒的药物制剂， 其特征在于： 所述注射剂 是将胆绿素溶于DMSO或生理盐水中配制而成。 6.如权利要求4或5所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 其特征在于： 所述注 射剂为冻干粉针剂。 7.如权利要求4所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 其特征在于： 所述口服剂 是将胆绿素与淀粉、 蔗糖或糊精中的任意一种混合均匀， 得混合物； 加无菌水使混合物的质 量分数为50-70%， 搅拌均匀， 捏合、 粉碎、 过筛制备而成。 8.如权利要求4或7所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 其特征在于： 所述口 服剂为散片剂， 胶囊剂或颗粒剂。 9.胆绿素作为一种牛病毒性腹泻病毒抑制剂， 其特。

5、征在于： 所述抑制剂抑制牛病毒性 腹泻病毒感染MDBK细胞。 10.如权利要求9所述的胆绿素作为一种牛病毒性腹泻病毒抑制剂， 其特征在于： 胆绿 素的有效浓度为50-200 mol/L。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106539789 A 2 胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用 技术领域 0001 本发明属于抗病毒研究技术领域， 具体地涉及胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒 药物上的应用。 背景技术 0002 牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)是黄病毒科瘟病毒属 的代表种， 主要感染牛并引发疾病， 由牛病毒性腹泻病毒引起的牛。

6、病毒性腹泻病以出现多 症状、 持续性感染和免疫抑制为主要特征， 是对全球养牛业造成极大危害的牛的重要病毒 性疫病。 0003 目前对BVDV的防制主要采用疫苗和抗生素。 现在主要的BVDV疫苗有常规疫苗和新 型疫苗。 常规疫苗主要是利用细胞培养物得到BVDV毒株， 进而得到这些毒株的弱毒或灭活 苗， 这些疫苗对抗原相同或差异较小的毒株的保护是有效的， 对抗原差异较大或不同抗原 的BVDV毒株所感染的动物并不能起到有效的保护作用。 随着基因工程技术的发展和应用， BVDV新型疫苗诞生， 包括亚单位疫苗、 DNA疫苗和重组活载体疫苗等， 但由于BVDV在自然条 件下变异性高， 对BVDV的防治造成。

7、很大的困难， 从疫苗的使用来看， 不论是灭活苗、 弱毒菌 还是新型疫苗， 在安全性、 治疗效果等方面都不能对最终控制BVDV起到决定性的作用。 另外 基于对健康安全食品的关注和需求， 动物抗生素的使用已经引起越来越多的消费者的反 对。 因此， 急需寻找一种新的抗病毒药物或制定新型抗病毒策略以有效防控病毒感染。 0004胆绿素的结构式为， 其血红蛋白正常代谢的产物。 属 于胆色素的一种胆汁色素， 为深绿色的色素体， 用于处理机体中的废物。 胆绿素是最强的内 源性抗氧化剂， 特别在消除自由基和抑制脂质过氧化的过程有很强的抗氧化作用， 其抗氧 化能力甚至超过了维生素E和维生素C。 发明内容 0005。

8、 针对目前采用疫苗或抗生素治疗牛病毒性腹泻病不能有效且可持续保护和控制 的现状， 本发明的目的在于研究胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用， 为治疗 和预防由牛病毒性腹泻病毒引起的疾病提供新的思路和途径。 0006 本发明涉及胆绿素在制备抗牛病毒性腹泻病毒药物上的应用， 其特征在于： 胆绿 素浓度梯度依赖性抑制牛病毒性腹泻病毒mRNA的表达， 尤其是非结构蛋白NS5B的表达。 0007 本发明涉及一种抗牛病毒性腹泻病毒的药物制剂， 所述药物制剂以胆绿素作为有 效成分， 并结合辅料配制而成。 0008 作为进一步的优选， 所述抗牛病毒性腹泻病毒药物制剂为注射剂或口服剂。 说 明 书 1/5。

9、 页 3 CN 106539789 A 3 0009 作为进一步的优选， 所述注射剂是将胆绿素溶于DMSO或生理盐水中配制而成。 0010 作为进一步的优选， 所述注射剂为冻干粉针剂。 0011 作为进一步的优选， 所述口服剂是将胆绿素与淀粉、 蔗糖或糊精中的任意一种混 合均匀， 得混合物； 加无菌水使混合物的质量分数为50-70%， 搅拌均匀， 捏合、 粉碎、 过筛制 备而成。 0012 作为进一步的优选， 所述口服剂为散片剂， 胶囊剂或颗粒剂。 0013 本发明亦涉及胆绿素作为一种牛病毒性腹泻病毒抑制剂， 其特征在于： 所述抑制 剂抑制牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞。 0014 作为进一。

10、步的优选， 胆绿素的有效浓度为50-200 mol/L。 0015 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： （1） 本发明以胆绿素为有效成分， 结合相关辅料制备抗牛病毒性腹泻病毒药物， 用于治 疗由牛病毒性腹泻病毒引起的疾病， 该药物不同于抗生素类药物， 不会对机体的免疫系统 造成危害； 亦不同于疫苗类药物， 本发明所述药物可制备成注射制剂或口服剂， 不拘泥于使 用类型， 可满足不同层次的需要； 另外胆绿素的生产工艺成熟， 可以为抗牛病毒性腹泻病毒 药物的制备提供充足的原材料， 可大大节约生产成本。 0016 （2） 本发明通过对细胞内BVDV病毒基因进行相对定量， 发现随着胆绿素浓度的增。

11、 加， 牛病毒性腹泻病毒基因的表达受到抑制， 并且在一定时间内， 胆绿素作用于细胞的时间 越长， 对病毒的抑制效果越明显。 为进一步明确胆绿素对病毒吸附和内化的影响， 对病毒的 拷贝数、 病毒滴度及病毒NS5B蛋白的表达情况进行检测， 发现随着胆绿素浓度的增加， 病毒 拷贝数、 病毒滴度及病毒NS5B蛋白表达逐渐下降。 最后通过检测不同浓度的胆绿素处理对 MDBK细胞增殖活性的影响， 发现10 M200 M的浓度范围内胆绿素不影响MDBK细胞的活性， 但经300 M、 400 M和500 M的胆绿素处理后， MDBK细胞的活力分别降低了43%、 53%和58%。 所 以， 胆绿素抗BVDV感染。

12、作用不是通过直接杀伤BVDV粒子， 而是通过细胞内的生理过程实现 的； 其对BVDV感染的抑制效应发生在病毒复制周期中的穿入和吸附阶段。 附图说明 0017 图1是不同浓度胆绿素处理对BVDV mRNA表达的影响的示意图； 图2是不同浓度胆绿素处理对BVDV 病毒NS5B蛋白表达的影响的示意图； 图3是不同浓度胆绿素处理对BVDV病毒滴度影响的示意图； 图4是不同浓度胆绿素处理对BVDV子代病毒RNA拷贝数的影响的示意图； 图5是胆绿素对BVDV的生长动力学变化的影响的示意图； 图6是胆绿素对MDBK细胞增殖活性的影响的示意图。 具体实施方式 0018 下面通过具体的试验例对本发明作进一步的解。

13、释说明。 0019 试验例1 胆绿素对BVDV感染MDBK细胞的影响 步骤一、 胆绿素处理BVDV感染的MDBK细胞 S1： 用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释对数生长期的MDBK细胞后接种于6孔板， 每孔 2mL； 培养至70%80%汇合度时， 接种用DMEM培养基稀释好的BVDV毒株， 吸附1h； 弃病毒液， 说 明 书 2/5 页 4 CN 106539789 A 4 每孔加1mL PBS洗涤1次， 再分别加入用含3%胎牛血清的DMEM培养基配制的胆绿素浓度为50 M、 100 M和150 M的溶液， 2mL/孔， 置于37、 5% CO2培养箱中继续培养， 24hpi收集细胞及 上。

14、清。 0020 S2： 用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释对数生长期的MDBK细胞后接种于6孔板， 每孔2mL； 培养至70%80%汇合度时， 接种0.05MOI （感染复数） 的BVDV毒株， 吸附1h； 弃病毒 液， 每孔加1mL PBS洗涤1次， 再在每孔中加入2mL用含3%胎牛血清的DMEM培养基配制的胆绿 素浓度为150 M的溶液， 随后置于37、 5% CO2培养箱中继续培养， 分别于6hpi、 12hpi、 24hpi、 36hpi、 48hpi、 60hpi和72hpi收集细胞及上清。 0021 步骤二、 qPCR检测细胞内BVDV基因的相对表达量 分别提取步骤一S1和S2。

15、中制备收集到的细胞总RNA。 提取步骤为： 对于贴壁培养MDBK细 胞， 移除培养液， 用PBS洗涤后加入适量的RNAiso Plus裂解细胞， 参考说明书提取细胞总 RNA， 提取完成后保存于-80备用。 以提取的细胞总RNA为模板， 以表1中根据GeneBank 中 BVDV Oregon C24V 毒株基因序列 （序列号： AF091605.1） 设计的BVDV-q F和BVDV-q R为引 物， 利用反转录试剂盒进行反转录， 将提取的细胞总RNA转录成cDNA， 反应体系与反应条件 参考反转录试剂盒说明书。 对反转录产物 （即cDNA） 进行1:10稀释， 以稀释的cDNA为模板， 以。

16、 表1中根据选定的牛B2M内参基因序列设计的bB2M-q F和bB2M-q R为引物， 使用SYBR GREEN 荧光定量试剂盒进行基因表达量的检测， 反应条件为95， 10 min； 95， 15 s； 60， 60s； 95， 15 s； 反应共40个循环， 在每个循环中60延伸结束时采集一次荧光信号。 其中， 引物 说明如下表1所示。 0022 结果表明： 如图1A所示， 随着胆绿素浓度的增加， 病毒基因表达逐渐降低， 说明胆 绿素呈浓度梯度依赖性抑制BVDV 5 UTR基因mRNA 表达； 如图5A所示， 与未经胆绿素处理的 对照细胞相比， 0.05MOI BVDV感染的细胞中， 病毒。

17、感染6hpi时， 细胞中BVDV基因表达量显著 下降， 在病毒感染12hpi时， 病毒基因的表达量降到峰值， 然后逐渐升高， 直到病毒感染 72hpi时， 病毒基因的表达量与未处理的对照细胞没有显著差异。 0023 其中， 所述RNAiso Plus试剂购自Takara， 型号为D9108A ； 反转录试剂盒购自Takara， 型号为RR037A； PCR仪与荧光定量PCR仪购自赛默飞世尔； SYBR GREEN荧光定量试剂盒购自瑞士的Roche公司。 0024 步骤三、 Western Blot 检测胆绿素处理对病毒NS5B蛋白表达的影响 通过Western Blot检测步骤一S1中制备得到。

18、的细胞中病毒蛋白NS5B的表达量变化。 病 说 明 书 3/5 页 5 CN 106539789 A 5 毒NS5B蛋白提取步骤： 将步骤S1制备得到的经不同浓度胆绿素处理的细胞样品分别收集于 1.5 mL的离心管内， 4、 500g离心10min， 弃上清液， 加入1mL PBS溶液重悬， 同样500g离心 10min， 弃去PBS上清溶液， 根据细胞湿重估算细胞总量， 按照1106个细胞加入100 L NP40 裂解液的比例， 加入适量的NP40裂解液， 置于冰上裂解30min； 12000g离心10 min， 除去细胞 碎片， 取上清， 5 L裂解样品+45 L PBS， 使用Pierc。

19、e BCA 蛋白定量分析试剂盒测定总蛋 白浓度， 然后以每个泳道50 g总蛋白， 进行Western blot检测。 0025 制备浓度为12%的SDS-PAGE分离胶及5%的浓缩胶； 按稳压200V进行浓缩胶和分离 胶的电泳； 半干转膜法恒压15V转膜1h； 取出膜后， 用1PBS T洗膜5min后加入封闭液， 室温 缓慢摇动2h （或4过夜） ； 弃去封闭液， 用PBS T洗膜3次， 每次5min； 加入合适比例稀释的一 抗溶液， 室温缓慢摇动2h或者4过夜孵育； 弃去一抗溶液， 用PBS T洗膜3次， 每次5min， 之 后加入合适比例稀释的二抗溶液， 室温缓慢摇动1h； 弃去二抗溶液，。

20、 用PBS T洗膜3次， 每次 5min； ECL显色， 并在发光成像仪上曝光。 0026 结果表明： 如图2所示， 胆绿素以浓度梯度依赖性抑制BVDV 非结构蛋白NS5B的表 达。 0027 其中， 所述Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒购自Thermo Scientific。 0028 步骤四、 药物处理后细胞上清中的病毒滴度 （TCID50） 测定 将步骤一中S1和S2制备得到的细胞上清用DMEM培养基作10倍系列稀释10-1至10-8， 接 种在长满MDBK细胞单层的96孔细胞培养板上， 每个稀释度接种8孔， 每孔100 L， 37吸附1h 后， 弃上清液， 每孔加入100 L含。

21、3%胎牛血清的DMEM培养基维持液， 37、 5% CO2培养箱中静 置培养47d， 每天观察细胞病变， 根据记录结果使用Karber方法计算病毒的TCID50。 0029 结果表明： 如图3所示， 胆绿素呈浓度梯度依赖性的降低MDBK细胞培养上清中BVDV 的病毒滴度； 如图5B所示， 与未经胆绿素处理的对照细胞相比， 0.05MOI BVDV感染的细胞上 清的病毒滴度， 在病毒感染6hpi时， 病毒滴度显著下降， 在病毒感染12hpi时， 病毒滴度降到 峰值， 然后逐渐升高， 直到病毒感染72hpi时， 病毒基因的表达量与未处理的对照细胞没有 显著差异， 与细胞中病毒基因的表达量呈现一致的。

22、趋势。 0030 步骤五、 qPCR检测上清细胞中病毒的拷贝数 分别提取步骤一S1和S2中制备收集到的上清细胞总RNA。 提取步骤为： 收集400 L上清 液于灭菌的1.5mL EP管中， 加400 L RNAiso Plus振荡混匀， 参考说明书提取细胞总RNA， 提 取完成后保存于-80备用。 以提取的细胞总RNA为模板， 以表1中根据GeneBank 中 BVDV Oregon C24V 毒株基因序列 （序列号： AF091605.1） 设计的BVDV-q F和BVDV-q R为引物， 利 用反转录试剂盒进行反转录， 将提取的细胞总RNA转录成cDNA， 反应体系与反应条件参考反 转录试。

23、剂盒说明书。 对反转录产物 （即cDNA） 进行1:10稀释， 以稀释的cDNA为模板， 以表1中 根据选定的牛B2M内参基因序列设计的bB2M-q F和bB2M-q R为引物， 使用SYBR GREEN荧光 定量试剂盒进行基因表达量的检测， 反应条件为95， 10 min； 95， 15 s； 60， 60s； 95， 15 s； 反应共40个循环， 在每个循环中60延伸结束时采集一次荧光信号。 0031 结果表明： 如图4所示， 上清中BVDV病毒的拷贝数与对应的细胞内BVDV病毒基因和 蛋白的表达量趋势一致； 如图5C所示， 与未经胆绿素处理的对照细胞相比， 0.05MOI BVDV感 。

24、染的细胞上清中的子代病毒的拷贝数， 与细胞中病毒基因的表达量及上清中的病毒滴度呈 现一致的趋势。 说 明 书 4/5 页 6 CN 106539789 A 6 0032 试验例2 胆绿素对MDBK细胞增殖活性的影响 用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释对数生长期的MDBK细胞后接种于96孔板， 每孔100 L， 为防止蒸发， 96孔细胞培养板四周边缘孔填充相同体积的无菌PBS， 置于37、 5%CO2培 养箱中培养24h， 加入试验药物胆绿素。 设置胆绿素不同浓度的处理组 （胆绿素稀释成0 M、 10 M、 25 M、 50 M、 100 M、 150 M、 200 M、 300 M、 40。

25、0 M、 500 M十种不同浓度） 。 参考CCK-8试剂 盒说明书进行MDBK细胞活性检测。 用100 L移液器依次吸弃旧培养基， 加PBS洗涤1次后， 加 入事先准备好的浓度梯度的胆绿素溶液， 每孔100 L， 每个浓度梯度实验孔设有6个重复孔， 对照孔设有4个重复孔。 然后将96孔细胞培养板置于37、 5%CO2培养箱内培养48h。 在超净 工作台内、 避光条件下， 用10 L移液枪向每孔加入10 L CCK-8溶液， 切记不要刮掉、 戳掉细 胞或打出气泡， 在37、 5% CO2培养箱内继续培养至设定的测定OD450的时间点， 并在酶标仪 上读取450nm吸光度值， 最后根据吸光度值统。

26、计分析。 0033 结果表明， 如图6所示， 10 M200 M的胆绿素处理对MDBK细胞的活性均无显著影 响； 与正常细胞相比， 300 M、 400 M和500 M的胆绿素处理后， 则MDBK细胞的活力分别降低了 43%、 53%和58%， 说明10 M200 M的浓度范围内胆绿素不影响MDBK细胞的活性。 0034 其中， CCK-8试剂盒来源碧云天生物技术研究所， 货号为C0038。 0035 综合试验例1和试验例2的结果， 胆绿素在有效量范围内可通过抑制牛病毒性腹泻 病毒mRNA的表达， 尤其是抑制非结构蛋白NS5B的表达来降低牛病毒性腹泻病毒的病毒滴度 和子代病毒的拷贝数， 从而影。

27、响对MDBK细胞的感染， 为胆绿素用于开发抗牛病毒性腹泻病 毒药物奠定了基础和提供了理论条件。 在尽量不影响MDBK细胞活性的前提下又能够抑制 BVDV复制的胆绿素的最佳浓度为50-200 M。 0036 以上内容应理解为说明性的， 阐述了本发明的基本原理和本发明的优点， 而非限 制本发明的保护范围。 本发明的保护范围以权利要求书的内容为准， 对本领域技术人员而 言， 在不背离本发明实质和范围的前提下， 对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属 于本发明的保护范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106539789 A 7 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 106539789 A 8 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 106539789 A 9 。