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具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位及其制备方法和应用.pdf

  • 上传人：狗**
  • 文档编号：6799906
  • 上传时间：2019-09-08
  • 格式：PDF
  • 页数：10
  • 大小：692.62KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201710039382.2

    		 申请日：

    20170118
    公开号：

    CN106552088A

    		 公开日：

    20170405
    当前法律状态：

    		有效性：

    审查中
    法律详情：

    IPC分类号：

    A61K36/804,A61P3/10,A61P13/12

    		 主分类号：

    A61K36/804,A61P3/10,A61P13/12
    申请人：

    南京中医药大学
    发明人：

    宿树兰,段金廒,蔡红蝶,朱悦,郭盛,郭建明,钱大玮
    地址：

    210036 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号
    优先权：

    CN201710039382A
    专利代理机构：

    南京经纬专利商标代理有限公司

    		 代理人：

    杨海军
    PDF完整版下载： PDF下载
    内容摘要

    本发明公开了一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位及其制备方法，它由丹参总酚酸类10～20份、总丹参酮类20～30份、桑叶总生物碱15～25份、桑叶总黄酮类10～20份、地黄叶总苷20～30份制成。本发明提供的制备方法包括原料预处理、水提醇沉、乙醇提取、阳离子交换树脂纯化、大孔树脂纯化、浓缩、干燥等步骤。本发明提供的药组合物有效部位具有明显的降血糖、降血脂、抗氧化、改善血液循环等综合调节效应，有效部位组合间可发挥协同增效的作用，起到显著的保护肾损伤和防治糖尿病肾病的作用。

    权利要求书

    1.一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，其特征在于，它由丹参、桑叶和地黄叶为原料制备得到。 2.根据权利要求1所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，其特征在于，它包括丹参总酚酸类、总丹参酮类、桑叶总生物碱、桑叶总黄酮和地黄叶总苷。 3.根据权利要求2所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，其特征在于，它包括丹参总酚酸类10～20份、总丹参酮类20～30份、桑叶总生物碱15～25份、桑叶总黄酮类10～20份和地黄叶总苷20～30份。 4.权利要求1～3任一项所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)先取丹参，粉碎成粗颗粒，先采用8～12倍纯水煎煮提取，获得水提取液，浓缩，浓缩液中加入体积浓度95％乙醇至乙醇浓度达60％～80％，过滤沉淀，得乙醇上清液，浓缩，获得丹参总酚酸类有效部位；取水提取后的丹参残渣，采用70％～95％乙醇加热回流提取，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，得醇提物，干燥，得总丹参酮类有效部位；(2)取桑叶，粉碎后用8～10倍纯水回流提取，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，浓缩液中加入95％乙醇至乙醇浓度达50％～80％，静置，过滤取上清液，浓缩后上阳离子交换树脂，先用PH为7～13的氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总生物碱有效部位；取桑叶，粉碎后，用体积浓度50％～80％乙醇回流提取，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩后上大孔树脂，用60％～70％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，冻干得桑叶总黄酮有效部位；(3)取地黄叶粉碎后，用60～90％乙醇回流提取，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩冻干，得地黄叶总苷有效部位。 5.根据权利要求4所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其特征在于，取步骤(1)制备得到的丹参总酚酸类有效部位10～20份、总丹参酮类有效部位20～30份，步骤(2)制备得到的桑叶总生物碱有效部位15～25份、桑叶总黄酮类有效部位10～20份和步骤(3)制备得到的地黄叶总苷有效部位20～30份混合制成。 6.根据权利要求5所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其特征在于，中药组合物有效部位中丹参总酚酸百分含量为4％～8％；丹参酮类成分百分含量为4％～6％；桑叶总生物碱百分含量为3％～5％；桑叶总黄酮百分含量为6％～8％；地黄叶总苷百分含量为5％～10％。 7.根据权利要求1至3任一项所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位在制备肾损伤保护作用及治疗糖尿病肾病、肾小管上皮细胞纤维化的药物中应用。 8.一种药物制剂，其特征在于，将具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位和药学上可接受的载体制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液制剂。

    说明书

    技术领域

    本发明属中药制药领域，具体涉及一种用于治疗糖尿病肾病的中药有效部位组合物及其制备方法与应用。

    背景技术

    丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，其味苦，性微寒，归心、肝经。具有祛瘀止痛、活血通经、养血安神、凉血消痈、清心除烦等功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，瘕瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。临床上主要用于心脑血管疾病。丹参中主要活性成分为丹参酚酸类及丹参酮类成分。现代药理研究表明，丹参酚酸类及丹参酮类成分具有抗动脉粥样硬化、改善内皮功能、扩张血管、抗氧化、改善血液流变学及血小板功能、改善微循环、降低心肌耗氧量、免疫调节、降血脂、降血糖等多种药理活性，另有研究表明其对肾脏具有良好的保护作用。

    桑叶为桑科(Moraceae)桑属植物桑(Morus alba L.)的叶。其性寒、味甘苦，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效。药用历史悠久，在《本草纲目》记载“桑叶乃手足阳明之药，汁煎代茶，能止消渴”。故，中医常用桑叶来治疗消渴症。现代临床研究表明，桑叶或桑叶为主的处方可有效治疗糖尿病及其并发症，并取得满意效果。化学成分研究表明，桑叶中主要含生物碱类、黄酮类、植物甾醇类、微量元素类、维生素类、氨基酸类等成分。具有显著的降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等多种生理活性，其中以1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)为代表的生物碱类与黄酮类成分具有显著的调节血糖的作用。

    地黄叶为玄参科多年生草本植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的叶。始载于唐代《食疗本草》，地黄叶性微苦，寒，入肝经。可解毒疗疮，治恶疮、手足癣。目前，地黄叶还未收录于《中国药典》，但已被收载于《北京市中药材标准》。化学成分研究表明，地黄叶中含环烯醚萜类及其苷类、苯乙醇及其苷类、萜类及其苷类、黄酮类及其苷类以及挥发油等化学成分，其中属于苯乙醇苷类的毛蕊花糖苷含量远高于地黄根。药理研究表明，地黄叶具有降低血糖、改善肾功能、抗菌、解毒等作用，另有报告显示地黄叶总苷具有滋阴补肾，凉血活血等功效，被用于慢性肾炎轻症等多种肾脏疾病的临床治疗。

    发明内容

    发明目的：本发明的目的在于提供一种丹参、桑叶、地黄叶的有效部位组合物，用于治疗糖尿病肾病。本发明另一个目的是提供该有效部位组合物的制备方法与其应用。

    技术方案：为了实现本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

    一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，它由丹参、桑叶和地黄叶为原料制备得到。

    作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，它包括丹参总酚酸类、总丹参酮类、桑叶总生物碱、桑叶总黄酮和地黄叶总苷。

    作为更加优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，它包括丹参总酚酸类10～20份、总丹参酮类20～30份、桑叶总生物碱15～25份、桑叶总黄酮类10～20份和地黄叶总苷20～30份。

    本发明所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其包括以下步骤：

    (1)先取丹参，粉碎成粗颗粒，先采用8～12倍纯水煎煮提取，获得水提取液，浓缩，浓缩液中加入体积浓度95％乙醇至乙醇浓度达60％～80％，过滤沉淀，得乙醇上清液，浓缩，获得丹参总酚酸类有效部位；

    取水提取后的丹参残渣，采用70％～95％乙醇加热回流提取，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，得醇提物，干燥，得总丹参酮类有效部位；

    (2)取桑叶，粉碎后用8～10倍纯水回流提取，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，浓缩液中加入95％乙醇至乙醇浓度达50％～80％，静置，过滤取上清液，浓缩后上阳离子交换树脂，先用PH为7～13的氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总生物碱有效部位；

    取桑叶，粉碎后，用体积浓度50％～80％乙醇回流提取，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩后上大孔树脂，用60％～70％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，冻干得桑叶总黄酮有效部位；

    (3)取地黄叶粉碎后，用60～90％乙醇回流提取，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩冻干，得地黄叶总苷有效部位。

    作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，取步骤(1)制备得到的丹参总酚酸类有效部位10～20份、总丹参酮类有效部位20～30份，步骤(2)制备得到的桑叶总生物碱有效部位15～25份、桑叶总黄酮类有效部位10～20份和步骤(3)制备得到的地黄叶总苷有效部位20～30份混合制成。

    作为优选方案，以上所述的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，中药组合物有效部位中丹参总酚酸百分含量为4％～8％；丹参酮类成分百分含量为4％～6％；桑叶总生物碱百分含量为3％～5％；桑叶总黄酮百分含量为6％～8％；地黄叶总苷百分含量为5％～10％。

    作为更加优选方案，中药组合物有效部位中，丹参总酚酸含量≥4.5％；丹参酮类成分含量≥4.34％；桑叶总生物碱含量≥5.91％；桑叶总黄酮含量≥1.61％；地黄叶总苷含量≥5.0％。丹参总酚酸、丹参酮类、桑叶总黄酮和地黄叶总苷含量用高效液相色谱法测定，桑叶总生物碱采用液相色谱与质谱联用仪测定。

    本发明组合物有效部位可与适当的药剂辅料制成各种临床药用制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、缓释控释制剂、口服液等。

    药理实验结果表明，本发明中药组合物有效部位具有显著的防治糖尿病肾病及防治肾小管上皮细胞纤维化的作用。

    将本发明中药组合物有效部位灌胃给予高糖高脂加链脲霉素致糖尿病肾病模型大鼠2周，观察其对空腹血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白、血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白、肾脏系数、尿蛋白等指标的影响，结果发现该中药组合物有效部位具有以下药理作用：糖尿病肾病大鼠空腹血糖明显下降，与模型组相比有显著性差异(p<0.05)。糖尿病肾病大鼠高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白、血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白、肾脏系数、尿蛋白的含量明显下降，与模型组相比有显著性差异(p<0.05)。糖尿病肾病模型组大鼠肾脏肾小管上皮空泡变性明显，官腔内炎细胞浸润明显，肾小球囊腔微扩张，给药组病理状态接近正常组。本发明中药组合物有效部位可在体外显著调节高糖诱导的人肾小管上皮细胞中E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4,TGF-β,TGF-βRI,TGF-βRII,Smad2,Smad3,Smad7蛋白的相对含量，具有很好的防治肾小管上皮细胞纤维化的功效。

    有益效果：本发明提供的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位具有以下优点：

    本发明提供的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位，通过大量实验筛选药物组成，并通过优选方法制备最佳用量配比的得到有效部位，实验结果表明，本发明提供的中药组合物有效部位具有很好的降低糖尿病肾病大鼠空腹血糖功效，并且能显著降低糖尿病肾病大鼠高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白、血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白、肾脏系数和尿蛋白的含量，可以多靶点、多途径发挥治疗糖尿病肾病的功效。并且实验结果表明，本发明也具有很好的防治肾小管上皮细胞纤维化的功效。实验过程中，未见明显毒副作用，安全性好。

    本发明提供的具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，制备工艺设计合理，可操作性强，制备得到的有效部位中，活性成分含量高。

    具体实施方式

    根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

    实施例1

    一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其包括以下步骤：

    (1)丹参总酚酸类有效部位的制备：取丹参药材粉碎成粗颗粒，先采用10倍纯水煎煮提取2次，每次1.5h，过滤或离心，获得水提取液，浓缩至一定体积，加入95％乙醇至乙醇浓度达80％，过滤沉淀，得乙醇上清液，浓缩，获得丹参总酚酸类有效部位；

    (2)总丹参酮类有效部位的制备：取步骤(1)经水提取后的丹参残渣，滤干，再采用95％乙醇加热回流提取2次，每次1.5h，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，醇提物干燥，得总丹参酮类有效部位。

    (3)桑叶总生物碱类有效部位的制备：取桑叶粉碎后用8倍纯水回流提取，提取2次，每次1h～2h，过滤或离心，滤液或上清液，浓缩，加入95％乙醇至乙醇浓度达80％，4℃静置24h，过滤取上清液，浓缩后将浓缩液以一定的流速缓慢加入已装好的阳离子交换树脂柱中，先用纯水冲洗至中性，去除部分杂质，再用0.5mol/L的氨水以1.5ml/min的流速进行洗脱，然后用pH＝7～13的氨水洗脱，收集PH＝7～10.5的洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总生物碱有效部位。

    (4)桑叶总黄酮类有效部位的制备：取桑叶粉碎，用80％乙醇回流提取2次，每次45min，两次提取液过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩至无醇味，将浓缩液以2BV/h的流速加入已装好的大孔树脂柱，采用60％～70％醇以3ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总黄酮类有效部位。

    (5)地黄总苷类有效部位的制备：地黄叶粉碎后，用70％乙醇回流提取2次，每次1h，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩，冻干得地黄叶总苷类有效部位。

    取以上制备得到的丹参总酚酸类有效部位15份、总丹参酮类有效部位25份、桑叶总生物碱有效部位20份、桑叶总黄酮类有效部位15份、地黄叶总苷有效部位25份组合得到。经检测，组合物中丹参总酚酸含量为6.75％；总丹参酮类成分含量为5.42％；桑叶总生物碱含量为7.88％；桑叶总黄酮含量为2.42％；地黄叶总苷含量为6.25％。

    实施例2

    一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其包括以下步骤：

    (1)丹参总酚酸类有效部位的制备：取丹参药材粉碎成粗颗粒，先采用8倍纯水煎煮提取2次，每次1.5h，过滤或离心，获得水提取液，浓缩至一定体积，加入95％乙醇至醇浓度达70％，过滤沉淀，得乙醇上清液，浓缩，获得丹参总酚酸类有效部位；

    (2)总丹参酮类有效部位的制备：取经水提取后的丹参残渣，滤干，再采用80％乙醇加热回流提取，2次，每次1.5h，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，醇提物干燥，得总丹参酮类有效部位。

    (3)桑叶总生物碱类有效部位的制备：取桑叶粉碎后用10倍纯水回流提取，提取2次，每次1.5h，过滤或离心，滤液或上清液，浓缩，加入95％乙醇至醇浓度达60％，4℃静置24h，过滤取上清液，浓缩后将浓缩液以一定的流速缓慢加入已装好的阳离子交换树脂柱中，先用纯水冲洗至中性，去除部分杂质，再用0.5mol/L的氨水以1.5ml/min的流速进行洗脱，用pH＝7～13的氨水洗脱，收集PH＝7～10.5的洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总生物碱有效部位。

    (4)桑叶总黄酮类有效部位的制备：取桑叶粉碎，用60％乙醇回流提取2次，每次45min，两次提取液过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩至无醇味，将浓缩液以2BV/h的流速加入已装好的大孔树脂柱，采用60％乙醇以2ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总黄酮类有效部位。

    (5)地黄总苷类有效部位的制备：地黄叶粉碎后，用80％乙醇回流提取2次，每次2h，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩，冻干得地黄叶总苷类有效部位。

    取以上制备得到的丹参酚酸类有效部位10份、丹参酮类有效部位30份、桑叶生物碱有效部位20份、桑叶黄酮类有效部位10份、地黄叶总苷有效部位30份。经检测，丹参总酚酸含量为4.5％；总丹参酮类成分含量为6.51％；桑叶总生物碱含量为5.88％；桑叶总黄酮含量为1.61％；地黄叶总苷含量为7.5％。

    实施例3

    一种具有治疗糖尿病肾病的中药组合物有效部位的制备方法，其包括以下步骤：

    (1)丹参总酚酸类有效部位的制备：取丹参药材粉碎成粗颗粒，先采用12倍纯水煎煮提取2次，每次1.5h，过滤或离心，获得水提取液，浓缩至一定体积，加入95％乙醇至醇浓度达80％，过滤沉淀，得乙醇上清液，浓缩，获得丹参总酚酸类有效部位。

    (2)总丹参酮类有效部位的制备：取经水提取后的丹参残渣，滤干，再采用70％乙醇加热回流提取，2次，每次2h，过滤或离心，滤液或上清液减压浓缩，醇提物干燥，得总丹参酮类有效部位。

    (3)桑叶总生物碱类有效部位的制备：取桑叶粉碎后用10倍纯水回流提取，提取2次，每次1.5h，过滤或离心，滤液或上清液，浓缩，加入95％乙醇至醇浓度达50％，4℃静置24h，过滤取上清液，浓缩后将浓缩液以一定的流速缓慢加入已装好的阳离子交换树脂柱中，先用纯水冲洗至中性，去除部分杂质，再用0.5mol/L的氨水以1.5ml/min的流速进行洗脱，用pH＝7～13的氨水洗脱，收集PH＝7～10.5的洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总生物碱有效部位。

    (4)桑叶总黄酮类有效部位的制备：取桑叶粉碎，用70％乙醇回流提取2次，每次45min，两次提取液过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩至无醇味，将浓缩液以3BV/h的流速加入已装好的大孔树脂柱，采用70％乙醇以3ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冻干得桑叶总黄酮类有效部位。

    (5)地黄总苷类有效部位的制备：地黄叶粉碎后，用60％乙醇回流提取2次，每次1h，过滤或离心，取滤液或上清液，浓缩，冻干得地黄叶总苷类有效部位。

    取以上制备得到的丹参酚酸类有效部位20份、丹参酮类有效部位20份、桑叶生物碱有效部位20份、桑叶黄酮类有效部位20份、地黄叶总苷有效部位20份。经检测，丹参总酚酸含量为9％；总丹参酮类成分含量为4.34％；桑叶总生物碱含量为7.88％；桑叶总黄酮含量为3.22％；地黄叶总苷含量为5％。

    实施例4

    对照组合物1：取实施例1方法制备得到的丹参总酚酸类有效部位15份、总丹参酮类有效部位25份、地黄叶总苷有效部位25份组合得到。

    对照组合物2：丹参总酚酸类有效部位15份、总丹参酮类有效部位25份、桑叶总生物碱有效部位20份、桑叶总黄酮类有效部位15份组合得到。

    对照组合物3：地黄叶总苷有效部位25份、桑叶总生物碱有效部位20份、桑叶总黄酮类有效部位15份组合得到。

    实施例5 降血糖、降血脂以及保护肾损伤实验

    1、取SD大鼠，体重(220±20)g，雄性屏障环境大鼠(SPF级)，适应性饲养5天，实验期间空白组10只大鼠一直喂养常规饲料，其余大鼠一直喂养高糖高脂及0.5％葡萄糖水，3周后，按30mg/kg连续3天腹腔内注射STZ，高糖高脂及葡萄糖水继续喂养4天后，大鼠禁食不禁水，12h后尾静脉取血测定空腹血糖，以血糖值高于13.1mmol/L为造模成功。模型成功率为95.7％。将造模成功的糖尿病大鼠根据空腹血糖水平随机分为8组，每组10只，分别连续15天灌胃黄葵胶囊(0.75g/kg·d)、厄贝沙坦(13.5mg/kg·d)、实施例1样品(0.5g/kg·d)、实施例2样品(0.5g/kg·d)、实施例3样品(0.5g/kg·d)、对照组合物1样品(0.5g/kg·d)、对照组合物2样品(0.5g/kg·d)和对照组合物3样品(0.5g/kg·d)。给药期间，正常组与模型组大鼠灌胃相同剂量的0.5％羧甲基纤维素钠。实验期间动物饲养在室温21～23℃、相对湿度60％、12h光照周期的SPF级屏障环境中。给药完后，将大鼠禁食不禁水置于代谢笼中，收集24h尿液，第24h时称大鼠体质量，随后尾静脉取血测定各组大鼠空腹血糖值，最后腹主动脉取血收集每只大鼠血清，并迅速剥离大鼠左右肾组织称其质量，随后迅速切取左肾部分皮质部位于福尔马林中用于HE染色、Masson染色、PAS染色。用考马斯亮蓝G-250法检测24h尿中蛋白的含量，相应的试剂盒分别测定血清中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白、血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白，并计算肾脏指数(肾脏指数＝(左肾质量+右肾质量)/(大鼠体质量*100))。

    1.对空腹血糖的影响

    通过尾静脉取血测定空白组、模型组、阳性药组及实施例1、2、3中的药物组合物给药组大鼠的空腹血糖，结果发现，阳性药给药组及本发明实施例1、2、3样品给药组大鼠的空腹血糖均明显低于模型组(p<0.01)和对照组合物1、对照组合物2和对照组合物3。结果如表1所示。

    表1药物对糖尿病模型大鼠空腹血糖的影响

    2.对糖脂代谢相关生化指标的影响

    通过试剂盒测定空白组、模型组、阳性药组及实施例1、2、3中的药物组合物给药组和对照组合物1至3的大鼠血清中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白的含量，结果发现，阳性药给药组及实施例1、2、3中的药物组合物给药组大鼠血清中高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白的含量均明显低于模型组(p<0.01)和对照组合物1至3。如表2所示。

    表2药物对糖尿病模型大鼠血清中糖脂代谢指标的影响

    3.对肾功能损伤相关指标的影响

    通过试剂盒测定空白组、模型组、阳性药组及实施例1、2、3中的药物组合物和对照组合物1至3给药组大鼠血清中血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白的含量，用考马斯亮蓝G-250法检测24h尿中蛋白的含量，并计算肾脏指数(肾脏指数＝(左肾质量+右肾质量)/(大鼠体质量*100))。结果发现，阳性药给药组及实施例1、2、3中的药物组合物给药组大鼠血清肌酐、尿素氮、大鼠胱抑素C、血β2微球蛋白、24h尿蛋白的含量及肾脏指数值均明显低于模型组(p<0.01)和对照组合物1至3。如表3所示。

    表3药物对糖尿病模型大鼠肾功能相关指标的影响

    4.对肾组织病理状态的影响

    给药结束后，取各组大鼠肾组织进行HE染色、PAS染色、Masson染色，光镜下所见正常组大鼠肾小管及肾小球正常，模型组肾小管上皮空泡变性、肾间质大量炎细胞浸润、肾小球囊腔扩张，阳性药给药组及实施例1、2、3中的样品给药组大鼠肾脏结构接近正常组。

    实施例6 改善肾小管纤维化的功能实验和对高糖环境下人肾小管上皮细胞NADPH oxidase/ROS/ERK及TGF-β/Smad信号通路调控实验

    1.实验细胞

    肾小管上皮细胞株HK-2由南京凯基生物科技发展有限公司提供，细胞培养于内含，细胞培养于内含10％的胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，放置于37℃，5％CO2培养箱中。

    2.药物

    阳性药DPI(NADPH氧化酶抑制剂)，U0126(ERK抑制剂)和siRNA(NOX1，NOX2，NOX4抑制剂)购自Calbiochem Corp.(La Jolla，CA)。

    3.细胞的分组与处理

    用96孔板铺板细胞，用DMEM高糖培养基预处理，37℃、5％CO2中培养6h，使其处于同步化状态。每24h换液。实验分为：空白对照，即不加入干预因素)；高糖处理组；给药组分别为DPI(10μM)、siRNA(10μM)、U0126(10μM)及实施例1、2、3样品(50μM)给药组和对照组1、2、3样品(50μM)。

    4.实验分析利用蛋白质印迹法分析方法测定E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4,TGF-β,TGF-βRI,TGF-βRII,Smad2,Smad3,Smad7的相对含量。

    5.实验结果

    (1)对高糖诱导的HK-2细胞形态的影响

    各组HK-2细胞经干预48h后，生物倒置显微镜分析结果表明，正常组HK-2细胞呈现明显的铺路石状态，模型组细胞出现明显纤维化，阳性药给药组及实施例1、2、3样品给药组细胞与正常组接近。

    (2)对高糖诱导的HK-2细胞E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4蛋白表达量的影响

    Western blotting测定高糖诱导的各组HK-2细胞中E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4蛋白的表达量，以β-actin为内参，实验重复3次。结果如表4所示，阳性药及实施例1、2、3药物组合物给药组细胞中α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4蛋白的相对表达量明显较模型组和对照组1、2和3低，E-cadherin蛋白的相对表达量明显较模型组和对照组1、2和3高。

    表4各组对E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4蛋白表达量的影响

    (3)对高糖诱导的HK-2细胞TGF-β,TGF-βRI,TGF-βRII,Smad2,Smad3,Smad7蛋白表达量的影响

    Western blotting测定高糖诱导的各组HK-2细胞中TGF-β,TGF-βRI,TGF-βRII,Smad2,Smad3,Smad7蛋白的表达量，以GADPH为内参，实验重复3次。结果如表5所示，实施例1、2、3药物组合物给药组细胞中TGF-β,TGF-βRI,TGF-βRII,Smad2,Smad3蛋白的相对表达量明显较模型组和对照组1、2和3低，Smad7蛋白的相对表达量明显较模型组和对照组1、2和3高。

    表5药物对E-cadherin,α-SMA,FN,p-ERK,NOX1,NOX2,NOX4蛋白相对表达量的影响

    以上实验结果表明，本发明通过实验优选得到的中药有效部位组合物以中药丹参、桑叶、地黄叶为原料，由丹参总酚酸类、总丹参酮类、桑叶总生物碱、桑叶总黄酮、地黄叶总苷按照一定的重量比例配伍而成，实验结果表明具有显著的降血糖、降血脂、抗氧化、改善血液循环治疗效应，有效部位间可发挥协同增效的作用，起到良好的保护肾损伤、改善肾小管纤维化和防治糖尿病肾病的作用。可作为糖尿病或糖尿病并发症患者的短期或长期辅助治疗剂的原料或产品。

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