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1、(10)申请公布号 CN 103734745 A (43)申请公布日 2014.04.23 CN 103734745 A (21)申请号 201310693004.8 (22)申请日 2013.12.18 A23L 1/305(2006.01) A23L 1/30(2006.01) (71)申请人 武汉市元大生物科技有限公司 地址 430060 湖北省武汉市武昌区首义路首 义新村 226 号 -2308 (72)发明人 朱玲 刘敏 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 张瑾 (54) 发明名称 一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶 囊的制备方法 (57) 。
2、摘要 本发明涉及一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆 菌复合微胶囊的制备方法。包括 ： 离心脱脂 ； 等电 点沉淀法去除酪蛋白 ； 微滤膜除菌 ； 超滤浓缩 ； 接 种嗜酸乳杆菌 ； 加入乳化剂均质 ； 真空浓缩 ； 将蛋 白浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中 ； 添加冻 干保护剂 ； 冷冻干燥。该方法制备得到的乳铁蛋 白的含量较高， 乳铁蛋白的纯度大约为 48%。与传 统工艺相比， 降低了乳铁蛋白结构中热敏性成分 的分解， 提高了乳铁蛋白的收率 ； 同时该方法制 备所得的复合微胶囊能够增强其对外界环境的抵 抗力， 降低乳铁蛋白在加工、 运输过程中和人体胃 酸中的活性损失， 显著提高乳铁蛋白和嗜酸乳杆 。
3、菌到达肠道的生理活性， 有效保持免疫与微生态 双活性， 增强产品对人体的保健功能， 提高产品的 附加价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103734745 A CN 103734745 A 1/1 页 2 1. 一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征在于包括如下步 骤 ： 1） 离心脱脂 新鲜牛初乳在 0-4条件下经 3000-3500r min 离心 20min 脱脂 ； 2） 等电点沉淀法去除酪蛋白 将脱脂乳置于 35-40。
4、水浴中， 缓慢滴加乳酸溶液调其 pH 值至 4.6-4.8， 静置 30min 后， 在 20条件下离心除去酪蛋白， 收集离心后的上清液得初 乳乳清 ； 3） 微滤膜除菌 将上述初乳乳清用陶瓷膜过滤， 除去乳清中残留的脂肪、 蛋白和菌体 等， 获得澄清的乳清液 ； 4） 超滤浓缩 将上述透过液采用分子截留量为 10kD 的中空纤维超滤膜装置进行超滤 分离， 截留富含乳铁蛋白的浓缩液 ； 5） 接种嗜酸乳杆菌 按浓缩液体积的 3-5% 接入高密度嗜酸乳杆菌， 于恒温培养箱中 30-40发酵培养24-36h， 使嗜酸乳杆菌活菌数量达到109cfu/L以上， 获得富含嗜酸乳杆菌 活菌体的乳铁蛋白发酵。
5、液 ； 6） 加入乳化剂均质 将乳酸甘油酯和大豆磷酯复合溶解后以发酵液质量的 0.1%-0.5% 加入到乳清发酵液中， 均质 ； 7）真空浓缩 将步骤 6 得到的乳状液在 45-55条件下真空浓缩， 使浓度达到 18-27% ； 8）将步骤 7 所得到的浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中， 调节溶液 pH 值为 6.0-8.0 ； 9） 添加冻干保护剂 在所得浓缩液中添加5-10%质量浓度的葡聚糖和1-10%质量浓度 的甘露醇， 控制料液的厚度在 10-20mm 范围内 ； 10） 冷冻干燥 将步骤 9 所得的浓缩液预冻至 40， 将捕水器降温至 60， 开 启真空泵， 将系统真空抽至 10Pa。
6、， 开启加热， 使物料得到一定升华潜热， 并保持系统真空在 20-30Pa 直至冻干， 系统真空达到 5Pa， 保持一定时间， 使物料彻底冻干后入库备用。 2. 如权利要求 1 所述的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 2） 中， 乳酸溶液浓度为 0.8mol L， 离心机转速为 4000-6000r min。 3. 如权利要求 1 所述的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 3） 中， 陶瓷膜孔径为 0.4-1.2m， 过滤时操作温度为 50-55， 进口压力为 0.5MPa， 出口压力为 0.27MPa， 表。
7、面流速为 75L/min。 4. 如权利要求 1 所述的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征 在于 ： 所述步骤4） 中， 超滤的工艺参数为 ： 操作温度35-55、 操作压0.08-0.12MPa、 超滤速 度 3.5-4.5 L min。 5. 如权利要求 1 所述的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 6） 中， 乳化剂是乳酸甘油酯 ： 大豆磷酯为 1 ： 1 的混合物。 6. 如权利要求 1 所述的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 8） 中壁材是羧甲基纤维素 ： 阿拉伯胶为 1 ： 。
8、1 的混合物。 权 利 要 求 书 CN 103734745 A 2 1/5 页 3 一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及保健食品加工领域， 具体涉及一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合 微胶囊的制备方法。 背景技术 0002 乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白， 广泛存在于乳汁、 唾液、 泪液等外分泌液或血浆、 中性粒细胞中。 它是一种具有多种生物学功能的蛋白质， 能够参与铁的转运， 对肠中的铁离 子具有增溶作用， 而且具有广谱抗菌、 抗氧化、 抗癌、 调节免疫系统等功能。 由于乳铁蛋白具 有广泛而独特的生物学功能和理化特性， 作为食品、 医药等领域的新兴。
9、成员， 正在受到越来 越多的关注。它在治疗、 营养补充、 食品等方面将有着广阔的应用前景， 因此非常具有开发 和研究价值。 0003 嗜酸乳杆菌不仅存在于胃中， 它还是人体小肠内的主要益生菌。 它能调整肠道菌 群平衡， 抑制肠道有害微生物的增殖。嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拮抗作用。其所分泌 的嗜酸乳菌素、 嗜酸杆菌素、 乳酸菌素等抗生物素类物质 , 能有效抵制肠道致病菌的生长， 减轻肝脏解毒负担。 嗜酸乳杆菌在肠道内发酵后， 还可产生乳酸和醋酸， 能提高钙、 磷、 铁的 利用率， 促进铁和维生素 D 的吸收， 产生维生素 K 及维生素 B， 还可以减少胆固醇的吸收， 并 能降低辐射对人体的伤害。
10、。 0004 最近几年， 牛初乳制品已成为食品及功能性乳制品开发的热点， 牛初乳生产加工 企业、 牛初乳制品种类越来越多。 但是由于起步较晚， 目前我国的牛初乳生产企业大多规模 较小， 产品质量不高， 主要是以普通牛初乳为原料生产出的牛初乳类干粉产品， 特异性乳铁 蛋白产品很少， 同时这些产品在生产过程中主要应用巴氏杀菌、 喷雾干燥等热处理技术， 产 品中乳铁蛋白的活性会有较大损失， 不易保藏， 胃肠通过率非常低。 而本实验则是探索如何 在工业化生产的条件下， 最大限度地保持乳铁蛋白和嗜酸乳杆菌的双重生物活性， 同时克 服胃酸的杀伤， 增强制品对人体的保健功能。 发明内容 0005 本发明提供。
11、一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法， 以新鲜牛 初乳和高密度培养的嗜酸乳杆菌为原料， 采用超滤浓缩、 真空冷冻干燥技术制备同时具备 免疫和微生态调节双重活性的复合微胶囊。 该方法获得的初乳制品中富含高浓度乳铁蛋白 和嗜酸乳杆菌。 0006 其通过如下步骤来实现 ： 1） 离心脱脂 新鲜牛初乳在 0-4条件下经 3000-3500r min 离心 20min 脱脂 ； 2） 等电点沉淀法去除酪蛋白 将脱脂乳置于 35-40水浴中， 缓慢滴加乳酸溶液调其 pH值至4.6-4.8， 静置30min后， 在20下经离心， 除去酪蛋白， 收集离心后的上清液得初乳 乳清 ； 3） 微滤膜除。
12、菌 将预处理后的乳清用陶瓷膜过滤， 除去乳清中残留的脂肪、 蛋白和菌 说 明 书 CN 103734745 A 3 2/5 页 4 体等， 获得澄清的乳清液 ； 4） 超滤浓缩 将上述透过液采用分子截留量为 10kD 的中空纤维超滤膜装置进行超滤 分离， 截留富含乳铁蛋白的浓缩液 ； 5） 接种嗜酸乳杆菌 按浓缩液体积的 3-5% 接入嗜酸乳杆菌， 于恒温培养箱中 30-40 发酵培养 24-36h， 使嗜酸乳杆菌活菌数量达到 109cfu/L 以上， 获得富含嗜酸乳杆菌活菌体 的乳铁蛋白发酵液 ； 6） 加入乳化剂均质 将乳酸甘油酯和大豆磷酯复合溶解后以发酵液质量的 0.1%-0.5% 加入。
13、到乳清发酵液中， 均质 ； 7）真空浓缩 将步骤 6 得到的乳状液在 45-55条件下真空浓缩， 使浓度达到 18-27% ； 8）将步骤 7 所得到的浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中， 调节溶液 pH 值为 6.0-8.0 ； 9） 添加冻干保护剂 在所得浓缩液中添加5-10%质量浓度的葡聚糖和1-10%质量浓度 的甘露醇， 控制料液的厚度在 10-20mm 范围内 ； 10） 冷冻干燥 将上述浓缩液预冻至 40， 将捕水器降温至 60， 开启真空泵， 将 系统真空抽至 10Pa， 开启加热， 使物料得到一定升华潜热， 并保持系统真空在 20-30Pa 直至 冻干， 系统真空达到 5Pa， 。
14、保持一定时间， 使物料彻底冻干后入库备用 ； 更 近 一 步 地， 所 述 步 骤 2）中， 乳 酸 溶 液 浓 度 为 0.8mol L， 离 心 机 转 速 为 4000-6000r min。 0007 更近一步地， 所述步骤 3）中， 陶瓷膜孔径为 0.4-1.2m， 过滤时操作温度为 50-55， 进口压力为 0.5MPa， 出口压力为 0.27MPa， 表面流速为 75L/min。 0008 更近一步地， 所述步骤 4） ， 超滤的工艺参数为 ： 操作温度 35 55、 操作压 0.08 0.12MPa、 超滤速度 3.5-4.5 L min。 0009 更近一步地， 所述步骤 6）。
15、 中， 乳化剂是乳酸甘油酯 ： 大豆磷酯为 1 ： 1 的混合物。 0010 更近一步地， 所述步骤 8） 中， 壁材是羧甲基纤维素 ： 阿拉伯胶为 1 ： 1 的混合物。 0011 通过以上方法制备得到的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊， 乳铁蛋白的 含量较高， 经SDS-PAGE凝胶电泳结果表明， 所制得的乳铁蛋白的纯度大约为48%。 与传统工 艺相比， 由于采用膜技术进行 “冷杀菌” ， 低温浓缩， 降低了乳铁蛋白结构中热敏性成分的分 解， 提高了乳铁蛋白的收率 ； 同时该方法制备所得的复合微胶囊能够增强其对外界环境的 抵抗力， 降低乳铁蛋白在加工、 运输过程中和人体胃酸中的活性损失。
16、， 显著提高乳铁蛋白和 嗜酸乳杆菌到达肠道的生理活性， 有效保持免疫与微生态双活性， 增强产品对人体的保健 功能， 提高产品的附加价值。 且该制品的各项理化指标和卫生指标均符合国家标准， 适合工 业生产的实际需要， 大大提高了生产效率。 0012 具体实施方式 0013 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步具体的说明。 实施例 说 明 书 CN 103734745 A 4 3/5 页 5 0014 一、 乳铁蛋白浓缩液的制备 1） 备选 50kg 牛初乳置于大型低温离心机， 温度控制在 4， 经 3500r min 离心 20min 脱脂。 0015 2） 将脱脂乳置于 38水浴中， 缓慢。
17、滴加浓度为 0.8mol L 的乳酸溶液调其 pH 值 至4.8， 静置30min后， 在20条件下经5000rmin离心20min， 收集离心后的上清液得初 乳乳清。 0016 3） 将预处理后的乳清用孔径为 0.4m 的陶瓷膜过滤， 过滤参数为 ： 操作温度为 55， 进口压力为 0.5MPa， 出口压力为 0.27MPa， 表面流速为 75L/min。 0017 4） 将上述透过液采用分子截留量为 10kD 的中空纤维超滤膜装置进行超滤分离， 超滤的工艺参数为 ： 操作温度 51、 操作压 0.11MPa、 超滤速度 4.2L min。 0018 5） 按浓缩液体积 5% 接入嗜酸乳杆菌。
18、母液， 于恒温培养箱中 30厌氧发酵培养 24h， 嗜酸乳杆菌活菌数量达到 2.74109cfu/L ； 6） 将乳酸甘油酯和大豆磷酯为 1 ： 1 的复合物溶解后以发酵液质量的 0.3% 加入到乳清 发酵液中， 均质 ； 7） 将步骤 6 得到的乳状液在 50条件下真空浓缩， 浓度为 21% ； 8） 将浓缩液缓慢加入到已溶解的羧甲基纤维素、 阿拉伯胶混合比为 1 ： 1 的壁材中， 用 2NHCl 调节溶液 pH 值为 6.5 ； 9） 在所得浓缩液中添加5%质量浓度的葡聚糖和4%质量浓度的甘露醇， 料液的装液厚 度为 10mm ； 10） 将上述浓缩液先在 40条件下预冻 2h， 将捕水。
19、器降温至 60， 开启真空泵， 将 系统真空抽至 10Pa， 开启加热， 并保持系统真空在 30Pa 直至冻干， 系统真空达到 5Pa， 保持 30min ， 使物料彻底冻干后入库备用 ； 试验例 本发明产品对小鼠免疫功能方面的研究 1. 试验材料与方法 1.1 实验动物与分组 ： SPF 级昆明种雄性小鼠 120 只， 体重为 18-22g， 由河南省实验动物中心提供， 实验动物 生产许可证号 SCXK（豫） 2005-0001。饲料由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供， 生产许可证号为 SCXK （湘） 2006-0001。每 30 只分为 1 组， 共四组。每大组随机分为蒸馏水 对照。
20、组、 普通牛初乳对照组、 高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊组， 每组 10 只小鼠。 0019 1.2 剂量选择及样品处理 ： 取高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊 1.67g（按人体口服推荐量折算所得） 加 蒸馏水至200ml， 取普通牛初乳1.67g加蒸馏水至200ml， 空白对照组予以等体积的蒸馏水， 分别给予受试动物灌胃， 每天灌胃一次， 灌胃体积为 4ml， 连续 30 天。 0020 1.3 实验方法 ： 1.3.1 迟发型变态反应 (DTH)（足跖增厚法） 小鼠腹腔注射 2%(v/v)SRBC（0.2ml/ 每鼠） 致敏后 4 天， 测量左后足跖部厚度， 然后在 测量部位皮。
21、下注射20%(v/v)SRBC(20ul/每鼠)， 于注射后24h测量左后足跖部厚度， 同一部 位测量三次， 取平均值。以攻击前后足跖厚度差值 （足跖肿胀度） 来表示 DTH 的程度。 0021 1.3.2 抗体生成细胞检测 (Jerne 改良玻片法 ) 说 明 书 CN 103734745 A 5 4/5 页 6 取羊血， 用生理盐水洗涤 3 次， 每次离心 (2000 r/min)l0min将压积 SRBC 用生理盐 水配成 2%(v/v) 的细胞悬液， 每鼠腹腔注射 0.2ml。将免疫后 4 天的小鼠处死， 取脾， 轻轻 磨碎， 用 Hanks 液制成细胞悬液， 200 目筛网过滤， 洗。
22、涤、 离心 2 次， 最后将细胞悬浮在 8ml Hanks 液中， 计数细胞， 并将细胞浓度调整为 5106个 mL。将表层培养基加热溶解后与 等量的 pH7.4、 2 倍浓度的 Hanks 液混合， 分装小试管， 每管 0.5ml， 再向管内加入用 SA 液配 制的 10%SRBC50ul (v/v)、 20ul 脾细胞悬液 （5106个 mL)， 迅速混匀后倾倒于已刷薄层 琼脂糖的玻片上， 待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上， 放入二氧化碳培养箱中温 育 1.5h， 然后用 SA 液稀释的补体 (1 ： 8) 加入到玻片凹槽内， 继续温育 1.5h 后计数溶血空 斑数。 0022 1.。
23、3.3 NK 细胞活性的测定 （乳酸脱氢酶测定法） 受试小鼠颈椎脱臼处死， 无菌取脾， 制成脾细胞悬液， 用 Hanks 液洗 2 次， 每次离心 10min (l000rmin)， 弃上清将细胞浆弹起， 加入0.5ml无菌水20秒， 裂解红细胞后再加入 0.5ml 2倍Hanks液及8mlHanks液， 1000rpm离心10min， 用1mL含10%小牛血清的RPMI1640 完全培养液重悬， 用 1% 冰醋酸稀释后计数， 用台酚兰染色计数活细胞数 （活细胞数应在 95% 以上） ， 调整细胞浓度为 2107个 /ml， 此为效应细胞， 取传代后 24h 生长良好的 YAC-1 细胞 用 。
24、RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为 4105个 /ml， 此为靶细胞 ； 取靶细胞和效应细胞 各 100ul( 效靶比 50 ： 1)， 加入 U 型 96 孔培养板中 ； 靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100ul， 靶细胞最大释放孔加靶细胞和 2.5%Triton 各 100ul ； 上述各项均设三个平行孔， 于 37， 5% 二氧化碳培养箱中培养 4h， 然后将 96 孔培养板以 1500r/min 离心 5min， 每孔吸取 上清 100ul 置平底 96 孔培养板中， 同时加入 LDH 基质液 100ul， 根据室温反应 3-10min， 每 孔加入 1mol/L 的 H。
25、Cl 30ul， 在酶标仪 490nm 处测定光密度 (OD)。 0023 NK 细胞活性 =（反应孔 OD- 自然释放孔 OD） （最大释放孔 OD- 自然释放孔 OD） 100% 2. 试验结果 2.1 本发明产品对小鼠迟发型变态反应 (DTH) 的影响 如表 1 所示， 试验组的小鼠在注射 SRBC 后 24h 其足肿胀度较普通牛初乳对照组有较大 提高， 且与空白对照组和牛初乳对照组比较， 其 P 值均小于 0.05， 表明在服用本发明产品后 小鼠的迟发型变态反应能力有显著提高。 0024 表 1 本发明产品对小鼠迟发型变态反应 (DTH) 的影响 （xs） 2.2 本发明产品对小鼠抗体。
26、生成细胞数的影响 如表 2 所示， 试验组的小鼠溶血空斑数较普通牛初乳对照组有较大提高， 且与空白对 照组和普通牛初乳对照组比较， 其 P 值均小于 0.05， 表明在服用本发明产品后小鼠的抗体 生成细胞数较对照组有显著提高。 说 明 书 CN 103734745 A 6 5/5 页 7 0025 表 2 本发明产品对小鼠抗体生成细胞数的影响 （xs） 2.3 本发明产品对小鼠 NK 细胞活性的影响 如表 3 所示， 试验组的小鼠 NK 细胞活性较普通牛初乳对照组有较大提高， 且与空白对 照组和普通牛初乳对照组比较， 其 P 值均小于 0.05， 表明在服用本发明产品后小鼠的 NK 细 胞活性较对照组有显著提高。 0026 表 3 本发明产品对小鼠 NK 细胞活性的影响 （xs） 应理解， 上述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 说 明 书 CN 103734745 A 7 。