红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102357123 A (43)申请公布日 2012.02.22 CN 102357123 A *CN102357123A* (21)申请号 201110299601.3 (22)申请日 2011.09.28 A61K 36/66(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (71)申请人 南京正宽医药科技有限公司 地址 211200 江苏省南京市溧水县永阳镇庆 丰小区绿村 22 栋 301 室 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种从红茂草醇提物在抗肿瘤 药物。

2、中的新用途， 该提取物具有抗肿瘤转移作用， 具体表现为抑制黑色素瘤自发性肿瘤转移和实验 性肿瘤转移， 可用于制备抗黑色素肿瘤转移药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 102357132 A1/1 页 2 1. 红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。 2. 如权利要求 1 所述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用， 其特征在 于 ： 所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成 ： 取红茂草药材， 加入 6-10 倍药材重量的体 积浓度为60-75乙醇进行加热回流， 回流0.2-0.8小时， 。

3、重复一次， 合并乙醇提取液， 浓 缩至 95时相对密度为 1.20 1.25 的浸膏， 干燥， 粉碎成干浸膏粉。 3. 如权利要求 2 所述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用， 其特征在 于 ： 所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成 ： 取红茂草药材， 加入 8 倍药材重量的体积浓 度为 70乙醇进行加热回流， 回流 0.5 小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至 95时相 对密度为 1.20 的浸膏， 干燥， 粉碎成干浸膏粉。 权 利 要 求 书 CN 102357123 A CN 102357132 A1/5 页 3 红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用 技术领域。

4、 0001 本发明涉及中药提取物的新用途， 具体涉及红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转 移药物中的应用。 背景技术 0002 据世界卫生组织 (WHO) 统计， 20 世纪 80 年代全世界每年新患癌症的病人约 700 万， 每年死于癌症者约 500 万人。50 年代初， 我国癌症死亡占全部死因的第 9 位或第 10 位， 70 年代我国癌症死亡已跃居第 3 位。1991 年统计资料， 我国一些大中城市居民的癌症死亡 已占据全部死因的第 1 位。我国每年新患癌症约 160 万人、 死于癌症者约 130 万人。上述 资料表明 ： 全世界和我国的癌症发病率在逐年明显增加。此外， 我国癌症病人就诊时晚。

5、期 病人仍占多数， 具有已失去了手术等根治机会、 治疗效果较差的特点。 广大医务工作者加强 肿瘤治疗的研究， 掌握和提高现有各种治疗手段的治疗效果， 对降低癌症死亡率， 减少复发 率， 提高癌症病人的生活质量具有重要意义。按现在我国癌症死亡的水平， 全国每 1 分钟就 有2个人死于癌症， 每天将有2800多人被癌症夺走生命， 1年将相当于一个有百万人口的城 市被毁灭。 可见， 癌症是常见病、 多发病， 对人们生命和健康有者严重威胁， 对国民经济建设 的影响也是巨大的。在美国， 每年癌症治疗费用 830 亿美元， 占全国医疗费用的 14。几乎 每个人都感受到癌症的威胁。因为全世界每年因癌症死亡的。

6、人数高达 630 万人， 而我国每 年因癌症死亡的人数已达 130 万人， 并且癌症病人每年以 3的速度递增， 相当于每 200 个 家庭中就有 1 个家庭受到癌症的威胁。 0003 化疗是目前治疗癌症的一个重要手段， 化疗药物在杀死癌细胞的同时， 对机体正 常细胞也存在毒性。近年来， 随着抗癌新药的不断涌现， 联合化疗方案的合理应用， 化疗的 疗效有了较大的提高， 但这些药物同时对正常组织器官有损害或毒性作用， 从而降低机体 免疫功能， 出现骨髓抑制等一系列毒副反应， 影响化疗的疗效， 甚至迫使化疗终止。临床研 究表明， 在化疗时根据患者的体质、 癌症分期以及出现的毒副反应症状， 辅以中药治。

7、疗， 可 有效地增强化疗的效果， 又能在一定程度上避免或减轻放化疗的毒副反应， 延长患者的生 存期和提高患者的生存质量。而中药作为我国得天独厚的资源， 有些药物具有明显的抗肿 瘤作用， 因此从我国传统的天然药物中筛选高效低毒、 靶向性强的抗肿瘤药物具有十分重 要的意义。 0004 王光凤等采用多种肿瘤模型， 研究橘皮中提取的黄酮化合物川陈皮素的抗肿瘤作 用。结果显示， 川陈皮素 8 32mg/kg 小鼠黑色素瘤 B16 的抑瘤率为 42.24 65.95， 对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率为38.8459.09； 对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为36.02 45.98。川陈皮素与小剂量的紫杉醇、 丝裂。

8、霉素、 52 氟尿嘧啶、 顺铂和阿霉素联用时， 表现 明显的协同效应。川陈皮素对小鼠 Lewis 肺癌腋皮下接种肺转移的抑制率为 33.63 38.94 ； 对小鼠 Colon26 结肠癌腹腔接种腹膜转移的抑制率为 37.74 43.40。( 王 光凤， 王小晨， 肖璘， 等 . 柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究， 中草药， 2007， 38(11) ： 1694-1697)， 但以上研究都只能对某种肿瘤细胞发挥作用， 研究还不够深入。 说 明 书 CN 102357123 A CN 102357132 A2/5 页 4 0005 红茂草主要化学成分为多种异喹啉类生物碱。全草含 ： 异紫堇碱、。

9、 原阿片碱、 紫 堇碱、 异紫堇啡碱、 木兰碱、 血根碱、 别隐品碱、 海罂粟碱。根含 ： 原阿片碱、 白屈菜红碱、 血 根碱、 别隐品碱、 隐品碱， 但没有报道过红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应 用。 发明内容 0006 发明目的 ： 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种红茂草醇提取物在制 备抗黑色素瘤转移药物中的应用。 0007 技术方案 ： 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 0008 红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。 0009 上述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用， 所述的红茂草醇提物按 如下方法制备而成 ： 取红茂草药材， 加入 6-。

10、10 倍药材重量的体积浓度为 60 -75乙醇 进行加热回流， 回流 0.2-0.8 小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至 95时相对密度为 1.20 1.25 的浸膏， 干燥， 粉碎成干浸膏粉。 0010 上述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用， 所述的红茂草醇提物按 如下方法制备而成 ： 取红茂草药材， 加入 8 倍药材重量的体积浓度为 70乙醇进行加热回 流， 回流 0.5 小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至 95时相对密度为 1.20 的浸膏， 干 燥， 粉碎成干浸膏粉。 0011 红茂草为罂粟科秃疮花属植物秃疮花 Dicranostigma leptopo。

11、dum(Maxim.) Fedde， 以全草入药。 0012 有益效果 ： 0013 为了更好地理解本发明的实质， 下面将红茂草醇提取物的药理试验及实验结果来 说明其在制药领域中的新用途。以下是红茂草醇提取物抗肿瘤转移作用的研究， 实验方法 及结果如下 ： 0014 一、 红茂草醇提取物的制备 ： 0015 取 50 克红茂草药材， 加入 8 倍药材重量的体积浓度为 70乙醇进行加热回流， 回 流0.5小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至95时相对密度为1.20的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0016 二、 红茂草醇提取物对自发性 B16F10 黑色素瘤转移模型的影响 0017 。

12、1. 实验材料 0018 1.1 实验动物与细胞 0019 清洁级 C57BL/6 小鼠 ( 雌性， 6-8 周龄， 16-20g)， 上海斯莱克实验动物有限责任公 司， 许可证号 ： SCXK( 沪 )2007-0005 ； B16F10 黑色素瘤细胞株。 0020 1.2 实验药物 0021 红茂草醇提取物 ： 按照上述方法制备而成。 0022 1.3 实验试剂 0023 DMEM( 美国 GIBCO 公司批号 ： 1340114)， PBS( 实验室自制 )， 小牛血清 ( 天津 市洋生物制品科技有限公司批号 ： QWTC0701)， Trypsin(AMRESCO 公司批号 ： 200。

13、9/08) EDTA(AMRESCO 公司批号 ： 0105)， 甲醛 ( 上海久亿化学试剂有限公司批号 ： 20070610)， 生理 说 明 书 CN 102357123 A CN 102357132 A3/5 页 5 盐水 ( 上海华源长富药业有限公司批号 ： 070405045)， NaHCO3( 南京化学试剂有限公司批 号 ： 050480039)， 液体石蜡 ( 上海久亿化学试剂有限公司批号 ： 20040701)。 0024 1.4 实验器材 0025 莱卡倒置荧光显微镜 ( 德国莱卡公司型号 ： DM1L)， 精密移液器 ( 法国吉尔森公司 型号 ： P2)， 全自动高压灭菌锅。

14、 ( 日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020)， 超净工作台 ( 苏净集团 安泰公司制造型号 ： SW-CJ-ZFD)， 超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号 ： Nu-6511)， CO2培养箱 (FORMA型号 ： 3111)， 纯水仪(美国Spring公司型号 ： S/N020579)， 电子天平(德国赛多利斯 有限公司型号 ： BT323S)， 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A)， 冰箱(西门子公司型号 ： KG18V21TI)， 液氮罐(CBS型号 ： 2001)， 离心机(上海安亭科学仪器 厂型号 ： KA-1000)， PH 计 (HAN。

15、NA 公司型号 ： HI-221)， 注射器。 0026 2. 实验方法 0027 2.1 制备 B16F10 细胞悬液 0028 常规培养 B16F10 肿瘤细胞， 实验前 4-5 天， 按 1 10 细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含 6-8106 细胞， 取对数生长期的 细胞， 弃去培养液， 用 PBS 洗净， 加入 1mL 0.25胰酶 +0.02 EDTA 消化液， 放入细胞培养 箱中， 1-3min 后， 轻敲培养瓶使细胞脱落。加 10mL DMEM， 用移液管吹打细胞， 获得单细胞悬 液， 转入 50mL 聚丙烯离心管。离心细胞 (120。

16、0rpm10min)， 然后用 PBS 洗两遍。用苔盼蓝 计数细胞， 调整细胞浓度为 1107/mL。 0029 2.3 复制 B16F10 自发性肿瘤转移模型 0030 每只 C57BL/6 小鼠左后肢足垫皮下注射含 5105个 B16F10 细胞的悬液 0.05mL， 这些小鼠每五天称一次体重。 于接种后第八天按照左足垫上原发瘤的大小将小鼠随机分为 四组 ： 模型组对照组 ( 生理盐水组 )、 红茂草醇提取物低剂量组 (2g/kg 小鼠体重 )、 红茂草 醇提取物中剂量组 (4mg/kg 小鼠体重 )、 红茂草醇提取物高剂量组 (6g/kg 小鼠体重 )， 每 组动物数为 10 只。从接种。

17、的第九天开始各组灌胃给予相应剂量的药物， 模型组给予相应 的生理盐水， 每日一次， 直至处死动物， 采集标本。在接种后第 23 天， 麻醉小鼠， 截除荷瘤下 肢， 10 PBS- 福尔马林固定原发瘤组织， 称取原发肿瘤重量以及用直尺测量原发瘤的长轴 (L1)和纵轴(L2)， 按照以下公式计算原发瘤的体积 ： 0.5236L1(L2)2。 切除原发灶后22 天处死小鼠， 取出肺， 避免镊子触及脏器表面损伤组织， 用 PBS 洗净组织。10 PBS- 福尔马 林固定肺组织， 称取肺重， 拍照并且在解剖显微镜下计算肺肿瘤结节数。 0031 3. 实验结果 0032 3.1 红茂草醇提取物对 B16F。

18、10 黑色素瘤自发性转移模型肺转移的影响 0033 实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验， 由实验数据可以看出， 红茂草 醇提取物各剂量组与对照组相比对黑色素瘤自发性转移模型的肺转移结节数均有抑制作 用， 且呈现剂量相关性 ： 红茂草醇提取物 2g/kg 剂量组 (P 0.05)、 红茂草醇提取物 4g/kg 剂量组 (P 0.01)、 红茂草醇提取物 6g/kg 剂量组 (P 0.01)。对于肺重的影响， 红茂草 醇提取物6g/kg剂量组的肺重量明显低于对照组的肺重(P0.01)， 其他两组无明显作用。 0034 3.2 红茂草醇提取物对 B16F10 黑色素瘤原发位肿瘤体积和重。

19、量的影响 0035 与生理盐水组相比， 红茂草醇提取物对于接种 B16F10 黑色素瘤细胞后的小鼠足 垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响作用。 说 明 书 CN 102357123 A CN 102357132 A4/5 页 6 0036 4. 结论 0037 红茂草醇提取物能够抑制 B16F10 黑色素瘤肺转移， 而且也抑制转移灶的生长， 但 是对原发肿瘤细胞增殖没有影响， 从小鼠体重变化可以看出， 红茂草醇提取物的毒副作用 很小， 为今后体内安全用药提供基础。 0038 三、 红茂草醇提取物对 B16F10 黑色素瘤细胞实验性肺转移影响 0039 1. 实验材料 同前 00。

20、40 2. 实验方法 0041 2.1 制备细胞悬液 同前 0042 2.2 复制 B16F10 实验性肿瘤转移模型 0043 取 C57BL/6 小鼠置于小鼠注射固定器， 尾静脉注射 0.2mL 细胞悬液 ( 含 5105肿 瘤细胞 )。接种过肿瘤细胞的小鼠随机分为 4 组 ： 模型组对照组 ( 生理盐水组 )、 红茂草醇 提取物低剂量组 (2g/kg 小鼠体重 )、 红茂草醇提取物中剂量组 (4mg/kg 小鼠体重 )、 红茂草 醇提取物高剂量组 (6g/kg 小鼠体重 )， 每组动物数为 10 只， 从接种后开始各组灌胃给予相 应剂量的药物， 模型组给予相应的生理盐水， 每日一次， 给药。

21、 23 天， 处死小鼠， 取肺脏。避免 镊子触及脏器表面， 防止损伤组织， 用 PBS 洗净组织。10 PBS- 福尔马林固定肺组织， 称取 肺重， 拍照， 评价红茂草醇提取物对 B16F10 肿瘤血行肺转移的影响。 0044 3. 实验结果 0045 实验结果采用Excel统计软件学生t检验， 从各组取出的肺组织可以看出， 模型组 的肺组织转移肿瘤结节数目显著多于给药组， 由于肺结节太多， 无法计数统计， 对肺重的统 计分析表明， 红茂草醇提取物高剂量组 (6g/kg) 和红茂草醇提取物中剂量组 (4g/kg) 均能 抑制小鼠肺组织重量， P 值分别为 P 0.01 和 P 0.05。红茂草。

22、醇提取物给药前后小鼠体 重差异不大， 且与对照组相比， 小鼠体重未发现有大幅度减少， 各组的死亡率显示， 红茂草 醇提取物药物对于小鼠的体内毒性较小。 0046 4. 结论 0047 红茂草醇提取物给药组小鼠的死亡率与对照组相当， 而且体重与给药前也没有明 显的减少， 说明红茂草醇提取物的毒副作用很小， 红茂草醇提取物可以很好的抑制实验性 B16F10 黑色素瘤肺转移， 红茂草醇提取物对于 B16F10 细胞直接入血之后的血行过程， 黏附 过程以及穿出血管过程有一定的抑制作用。 具体实施方式 0048 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述。

23、主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0049 制备实施例 1 ： 0050 取 50 克红茂草药材， 加入 8 倍药材重量的体积浓度为 70乙醇进行加热回流， 回 流0.5小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至95时相对密度为1.20的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0051 制备实施例 2 ： 0052 取 50 克红茂草药材， 加入 6 倍药材重量的体积浓度为 70乙醇进行加热回流， 回 说 明 书 CN 102357123 A CN 102357132 A5/5 页 7 流0.5小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至95时。

24、相对密度为1.25的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0053 制备实施例 3 ： 0054 取50克红茂草药材， 加入10倍药材重量的体积浓度为70乙醇进行加热回流， 回 流0.6小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至90时相对密度为1.20的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0055 制备实施例 4 ： 0056 取 50 克红茂草药材， 加入 8 倍药材重量的体积浓度为 60乙醇进行加热回流， 回 流0.5小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至95时相对密度为1.20的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0057 制备实施例 5 ： 0058 取 50 克红茂草药材， 加入 6 倍药材重量的体积浓度为 75乙醇进行加热回流， 回 流0.5小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至95时相对密度为1.25的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 0059 制备实施例 6 ： 0060 取50克红茂草药材， 加入10倍药材重量的体积浓度为60乙醇进行加热回流， 回 流0.6小时， 重复一次， 合并乙醇提取液， 浓缩至90时相对密度为1.20的浸膏， 干燥， 粉碎 成干浸膏粉。 说 明 书 CN 102357123 A 。