技术领域
本发明涉及一种增强学习记忆能力的方法,通过提高N-甲基-D- 天冬氨酸(NMDA)2B受体的表达增强学习记忆能力的方法,属于 神经生物学技术领域。
背景技术
大量的研究证明,记忆在大脑里的贮存是由神经细胞突触的相 互作用而控制的。Hebb在1949年指出:当突触前和突触后神经元同 时被激活时,其相互联结强度增大,而这一神经元突触间联结强度的 变化直接影响大脑的学习和记忆能力。
N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体在神经元突触联结中起到异 常重要的作用。当突触前后的神经元被同时激活时,NMDA受体即被 激活并开放其通道,允许Ca2+流进入突触后神经细胞,从而引发一系 列的生化反应,最终调节神经元的突触可塑性及学习记忆的能力。
NMDA受体由NR1和不同种类的NR2亚基组成(Nakanishi, Science 258,597-603,1992;Hollmann&Heinemann,Annu.Rev. Neurosci 17,31-108,1994)。NR1亚基是钙离子通道蛋白,而NR2亚 基则调节通道的启闭(Monyer et al.,Science 256,1217-21,1992)。在 海马和皮层等组成的前脑区,通常只有NR2A和NR2B与NR1亚基 一起构成受体复合物(Monyer et al.,Neuron 12,529-40,1994)。个体 从幼年到成年的转变及衰老过程中,NR2B基因表达量逐渐降低 (Sheng et al.,Nature 368,144-147,1994;Okabe et al.,J.Neurosci. 18,4177-88,1998),同时NMDA通道的开放时间也逐渐缩短 (Carmignoto&Vicini,Science 258,1007-11,1992;Hestrin,Neuron 9, 991-9,1992),最终导致神经突触可塑性及学习记忆能力的降低。
进一步研究发现,NMDA受体活化是诱导长时程增强(LTP)的 必要条件,在神经突触可塑性和记忆中起到重要作用。破坏海马区的 NMDA受体会造成突触可塑性的阻抑及记忆功能的丧失。例如,使用 NMDA受体拮抗剂可完全阻止大多数海马突触中LTP的产生。在大 脑内注入了NMDA受体拮抗剂的大鼠,学习记忆能力降低。用遗传 工程敲除技术使小鼠某个基因缺失是研究基因功能的有效手段,把 NMDA受体或参与NMDA受体生物活性的基因敲除后,也可以观察 到动物学习记忆能力降低(Silva et al.,1992a;Silva et al.,1992b;Chen &Tonagawa1997年的综述)。利用NMDA受体基因敲除小鼠所做的 实验结果表明,在大脑的某一特定区域完全抑制NMDA受体,可使 某种类型的记忆受到抑制,但这些结果并未指明NMDA受体在更多 类型的学习与记忆中扮演的角色,也未指明这些结果在提高学习与记 忆能力方面以及在改善与学习记忆相关的异常或疾病方面的应用价 值。研究结果表明NMDA受体、神经突触可塑性、LTP及各种类型 的学习记忆之间具有密切的相关性,但确切关系如何,尚不十分明确。 这些研究结果在提高学习与记忆的能力,以及在提高学习记忆能力, 改善神经异常或疾病方面的应用价值如何,也未予以指明。随着年龄 的增长,老年痴呆症和中风等神经性异常和疾病变得越来越普遍。发 明一种能提高学习和记忆的能力的方法,并能改善神经性疾病导致的 学习记忆能力降低,在神经医学领域将具有十分重要的意义。
发明内容
本发明运用转基因、功能基因组学、化学遗传学等方法,研究 学习记忆的分子机制,明确在学习记忆中起关键作用的基因;并在此 基础上,提出提高个体学习与记忆能力的方法;提出可缓解与学习记 忆相关的神经退行性疾病的方法;提出筛选调节学习记忆能力的新化 合物的方法;提出鉴定在与学习记忆相关的生物过程中起作用的基因 的方法。
本发明提出了可用于增强个体学习记忆能力的方法。该方法是 通过修饰大脑神经突触的NMDA受体,从而使该受体的功能增强, 表现在突触可塑性的增强和NMDA受体活性的增强,即受体通道开 放时间的延长或波峰的增加。
本发明提出了可用于改善与学习记忆相关的神经退行性疾病或 异常的方法。该方法是通过修饰异常大脑内神经突触的NMDA受体, 使该受体的功能增强,最终提高病人学习与记忆的能力。
本发明提出了通过遗传操作改变人类和动物大脑以增强其学习 记忆的能力。遗传改造导致动物大脑内神经突触NMDA受体被修饰, 从而增强NMDA受体的功能。
本发明提出了通过转基因技术使其大脑内能表达转入的NR2B 基因的非人类的转基因动物。本发明中的动物是啮齿类,最常用的是 大鼠。
本发明提出了鉴定具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习 记忆能力的化合物的方法。该方法是在NR2B基因的启动子上连接一 段报告基因,再加入可能促进NR2B启动子表达的化合物,然后测定 报告基因的表达,如果表达增强则说明该被试化合物可通过促进 NR2B基因的表达来增强学习记忆功能。
本发明提出了在体或离体鉴定通过影响NMDA受体的功能来增 强学习记忆能力的化合物的方法。离体鉴定的方法是:a.两组离体培 养的细胞,一组细胞转入能编码NR2B的外源DNA分子,另一组不 转入;b.在未转化组细胞中加入可能促进NR2B表达或提高NMDA 受体活性的化合物;c.比较加入化合物而未被转化的细胞与转化细 胞,必要时还可比较未加入化合物也未被转化的细胞的NMDA受体 功能。在加入化合物而未被转化的细胞中NMDA受体功能如果与转 化细胞NMDA受体功能一致,则说明被试化合物能通过影响NMDA 受体功能来增强学习与记忆能力。
在体鉴定实验原理同上,只是将培养细胞换成转基因和未转基 因两组动物。
本发明提出了另一种在体和离体鉴定通过增强NMDA受体而增 强学习记忆能力的化合物的方法。离体鉴定的方法是:a.离体培养的 细胞分成两组;b.一组细胞中加入可能会增强NMDA受体功能的被 试化合物;c.直接或间接地测定两组细胞中NMDA的功能以确定被试 化合物对NMDA受体的影响。该实验中所用的细胞均是经NR2B基 因转化的细胞,其有利之处是它们对各种被试化合物的敏感性更强。
在体鉴定的方法原理同上,以动物代替细胞。实验中所用动物 也是转基因动物,优点是它们对被试各种化合物的敏感性更强。
本发明提出了鉴定能影响NMDA受体介导的学习记忆过程中的 基因和基因产物的方法。方法是:a.将动物或离体培养的细胞分成两 组,其中一组转入能编码NR2B的外源DNA分子,另一组不转入; b.比较转基因和非转基因组动物或细胞的基因表达情况(测定其 mRNA或蛋白质的含量)或蛋白质修饰情况(测定共价键或非共价键 情况);C.将在转基因动物或细胞中表达发生变化的一种或多种基因, 或修饰发生变化的一种或多种基因产物分离出来;d.鉴定分离出来的 基因或基因产物。
本发明提出了另一种鉴定影响NMDA受体介导的学习记忆能力 的基因或基因产物的方法。方法是:a.培养带有NMDA受体的细胞并 分成两组;b.在其中一组直接或间接地激活NMDA受体;c.比较两组 细胞中基因表达(测定mRNA或蛋白质的含量)或蛋白质修饰情况 (测定共价键或非共价键情况);d.将在被激活组受体中表达发生变 化的一种或多种基因,或者修饰发生变化的一种或多种基因产物分离 出来;e.鉴定分离出来的基因或基因产物。
本发明中的实验表明,转基因大鼠前脑中NR2B的超常表达导致 了NMDA受体活性的增强,促使神经突触对10-100赫兹刺激的反应 时程增加。在六大行为测试的实验中,这些转基因大鼠的学习与记忆 能力都得到提高,说明NR2B在调节突触可塑性和记忆形成随年龄而 变化的过程中起着关键作用。也进一步说明NMDA受体功能的增强 可导致突触可塑性的提高,从而显著增强哺乳动物学习与记忆的能 力。
运用NR2B转基因动物的研究指出,当NMDA受体的功能增强 的程度适当时,学习与记忆的能力才随之增强。例如,与非转基因动 物相比,当NMDA受体通道的衰退时间延长15-20%时,可增加转基 因动物学习记忆行为的能力;继续增加NMDA受体的活性(例如本 发明中将通道衰退时间、峰值或通道开放增加30%、40%、50%或更 多时),学习记忆的增强度却相对要低。
本发明的主要技术如下:
(一)转基因的技术和方法:
1、获取编码NR2B的基因序列:见相关报道。例如,本发明中 所需要的大鼠NR2B基因序列见GenBank Accession No.U60210;人 NR2B基因序列见GenBank Accession No.NM000834。
2、本发明所用转基因的启动子来源于αCαMK II基因,该基因仅 在前脑区具有活性(Mayford et al.,Cell 81,891-904,1995)。已知针 对大脑内某些特殊类型的细胞,还有另外一些启动子可以引导外源基 因的组织特异性表达,例如:pkcγ启动子,telencephalin启动子, neuronal enolase启动子以及prp启动子等。对体细胞进行基因转化, 组织特异性则不是启动子的必要条件,所以,一般构建的启动子如 CMV启动子或β-actin启动子均应可用于体细胞的基因转化。
3、本发明中转基因动物制备方法见具体实施方法中所述。其他 可参考以下文献:Joyner,“Gene Targeting”IRL Press,Oxford,1993; Hogan et al.(Eds.),“Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.,1994;Wasserman&DePamphilis,“A Guide to Techniques in Mouse Development,”Academic Press,San Diego CA,1993.有一种将 外源DNA导入生殖细胞的方法是用显微注射技术把构建的基因注射 到早期胚胎(如4细胞期前)的前核中(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 78,5016,1981;Brinster et al.,Proc.Natl.A cad.Sci.USA 82, 4438,1985).本发明中用该方法制备NR2B转基因大鼠的详细过程见 Tsien et al.,Cell 87,1317-26,1996。
在上述生殖细胞的转化中,被转化的基因可以是构建的一段线性 基因,也可以是一个环状质粒,还可以是整合了目的基因的病毒载体, 可以被整合进宿主的基因组。目的基因还可被构建成为一种外源染色 体质粒,可以在宿主细胞中自我复制。
还可利用携带了NR2B基因的重组病毒载体从体内、体外和ex vivo感染神经细胞来获得转基因动物。逆转录病毒、腺病毒和单腺疱 疹病毒等均可作为病毒载体。
结果发现,NR2B转基因大鼠获得新信息(即学习)和保存已有 信息(即记忆)的能力都得到提高。
(二)其他技术和方法:
能增强NMDA受体功能的所有方法,都应该能发生如在NR2B 转基因动物中所观察到的学习与记忆能力的提高。因此,通过NR2B 的高表达来改变NMDA受体中NR2B与NR2A的比例,也可能得到 同样的结果。另外一些增强NMDA受体功能的方法是(但不局限于 此):1).利用一些小分子物质直接或间接地增加NMDA受体的功能; 2).在转录水平(例如调节启动子)、翻译水平(可以包括调节上游的 转录因子)和/或翻译后水平(蛋白质的共价或非共价修饰)来调节 受体亚基的表达3).利用一些能在细胞内作用于NMDA受体的胞内区 域,或者作用于受体下游反应中的信号分子的物质,来调节受体与它 下游的靶物质之间的相互作用;4).利用一些物质在细胞内刺激下游基 因的表达,下游基因是指在转基因大鼠或细胞中所看到的那些表达异 常的基因;5).通过调整其他神经元受体(如AMPA受体、GABA受 体、serotonin受体)或突触前神经传递因子释放等间接增强NMDA 受体介导的过程,来影响NMDA受体的应答反应。
如前所述,NR2B即是调节的靶标。在本发明中,可以通过遗传 操作的方法使NR2B在大脑某一区域得到高表达。一个受体可用能编 码NR2B亚基的载体稳定地转化。这种转化一般应用于幼年或胚胎时 期的受体,这样受体在幼年期和成年期其突触可塑性就得到了增强。 特殊情况下,可对胚胎时期的生殖细胞进行转化,这样受体就可将转 入的基因传至其后代。这种转化技术还可用于人类,详见下述。
另外,受体的体细胞也可用于稳定或临时性地转入能编码NR2B 亚基的载体。体细胞转化适用于幼年或成年的受体,以校正或逆转大 脑中的缺陷或病理情况,即基因治疗。基因治疗即是将外源的NR2B 基因转入靶细胞,其表达的额外的NR2B亚基能与NMDA受体整合 在一起。
本发明中的病体和受体既指人也指动物,发明的方法可应用于一 切含有NMDA受体的具有中枢神经系统的有机体。
在本发明中,前脑区的NMDA受体是增强的靶标,前脑区包括 皮层、纹状体、海马结构(hippocampal structures)、海马形成区 (hippocampal formation)、杏仁核和边缘系统。其他与学习相关的脑 区也可作为作用靶区,包括小脑和丘脑区、和基底神经节。只要具有 NMDA受体的神经系统的任何区域都可以通过增强NMDA受体来达 到目的。可用于改善与学习记忆相关的多种不适和疾病,如精神分裂 症、老年痴呆症、其他与衰老相关的学习记忆损害以及包括滥用药物 和酒精引起的记忆损害等的各种失忆症,还可用于由于脑部外伤、中 风或局部缺血(如溺水)而导致的大脑损伤的个体的恢复。
本发明中所指的动物是指除了人之外的一切脊椎动物。也指动物 个体在发育的各个阶段,包括胚胎和胎儿阶段。本发明中所用的动物 是啮齿类,常用的是小鼠、大鼠和兔子;但并不是说局限于此,猫、 狗、海豚和灵长类动物均可以使用。
本发明中用于转基因的目的基因是NR2B基因的全部编码区;或 者它的互补DNA(cDNA);或者含有NR2B部分或全部编码区的外 源基因,前脑中组织特异性的启动子可以启动其表达。本发明中所用 的NR2B编码顺序与受体动物是同源的,但这不是必须的。
(三)利用NMDA受体功能增强对突触可塑性、学习记忆的深 入影响来鉴定化合物:
1、体外鉴定通过增强NR2B基因的表达来增强学习记忆能力的 化合物的方法:
(1)构建带有报告基因的NR2B启动子重组DNA片段;
(2)在上述重组基因中连接上可能调节NR2B启动子的被试化 合物;
(3)测定报告基因的表达;
如果报告基因表达增强,即可说明被试化合物可以通过增强 NR2B基因的表达来增强学习与记忆的能力。
另外,用未转化的某些细胞也可体外筛选化合物:两组离体培 养的一定类型的细胞,其中一组经被试化合物处理,用生化或电生理 的方法测定其NMDA受体的活性。如果受体活性比未处理组高,则 说明该化合物可进一步用于药物学研究。
2、利用转基因动物体内鉴定通过增强NR2B基因的表达或 NMDA受体的活性来增强学习记忆能力的化合物的方法:
(1)两组大鼠,其中一组为NR2B转基因动物,另一组不转基因;
(2)以可能正性调节NR2B基因表达或NMDA受体活性的被试 化合物处理未转基因的动物;
(3)用生物化学或行为测试的方法比较化合物处理未转基因的 动物与转基因动物的学习与记忆能力(需要时还可与既未 用化合物处理又未转基因的动物的学习记忆能力进行比 较)。
如果在化合物处理未转基因的动物组出现的学习记忆能力的变 化,与转基因组学习记忆能力的变化一样,即可说明被试化合物可以 通过增强NR2B基因的表达或NMDA受体的活性来增强学习记忆的 能力。
3、体内鉴定通过增强NMDA受体的活性来增强学习记忆能力的 化合物的另一种方法:
(1)两组动物;
(2)以可能正性影响NMDA受体活性的被试化合物处理其中一 组动物,另一组不予处理;
(3)直接或间接测定并比较两组动物中NMDA受体的活性。
结果可说明被试化合物对NMDA受体功能的影响。
该方法可做如下的改变:以NR2B转基因动物代替上述未转基 因的动物;或者一组转基因,一组不转基因;或者一组进行基因敲除 使NMDA受体功能降低或丧失功能(Tsien et al.,1996,supra)。
4、鉴定那些影响NMDA受体介导的学习记忆过程的基因或基因 产物的方法
(1)利用转基因动物体内鉴定的方法
a.两组动物,一组转NR2B基因,一组不转入;
b.通过测试mRNA或蛋白质的产生或者翻译后蛋白质的修 饰等比较两组动物的基因表达情况;
c.将在转基因动物中表达发生变化的基因或者发生修饰的 基因产物分离出来;
d.鉴定这些基因或基因产物。
该方法可作如下变化:将以上的转基因动物、未转基因的动物 与基因敲除的动物进行比较。
该方法还可作如下的变化:用化学或神经元电刺激的方法增强 未转基因动物的NMDA受体功能,观察处理后动物的基因表达情况, 并将该结果与转基因动物的基因表达情况进行比较。
(2)体外鉴定的方法
以上实验可用转基因的神经元细胞或非神经元细胞代替动物(转 入基因可以是NR2B基因,或者有选择地同时转入NR2A,NR2C, NR2D等NR2其他亚基的基因),用生物化学或生理的方法观察基因 转入后细胞的变化情况。
利用转基因动物的细胞或组织块也可以在体外鉴定基因或基因 产物。
(3)通过本发明也可推导出其他鉴定基因和基因产物的方法。 例如:用酵母双杂交方法、噬菌体展示或免疫沉淀等,可鉴定出与受 体或者编码受体的基因之间有物理作用的蛋白质,即能得到与细胞中 NMDA受体信号传导途径相关的有用信息。
利用NMDA受体编码区的多态性和突变性来进行诊断的方法。 可发生在受体编码区或非编码区的突变或多态性,与某种学习与记忆 相关,能被鉴定出来。这些多态性与学习记忆的增强或损伤相关。被 鉴定出来的多态基因可以用于预测智商或者学习记忆能力的测定,或 者可以用于诊断学习记忆异常的诱因。
本发明的有益效果体现在以下几个方面:
在该发明中首先明确了NMDA受体在各种类型的学习与记忆中 都起着“主要分子开关”的作用,这对明确学习记忆的机制有着十分 重要的作用,可促进神经生物学基础理论研究的发展。
不仅如此,本发明提出的一系列方法还具有显著的实用价值,具 体表现在:
1.运用本发明中的方法,通过改变与学习记忆密切相关的大脑区 域(如海马)NMDA受体的数量,来改变神经元中的突触可塑性,从 而提高哺乳动物学习与记忆的能力。
2.运用本发明中的方法,可通过多种方法修饰NMDA受体,增 强受体的活性,以缓解和改善与学习记忆相关的神经退行性疾病或异 常。
3.运用本发明中的方法,可对与学习记忆相关的神经退行性疾病 或异常进行基因治疗。
4.由于增强NMDA受体的活性可提高学习记忆的能力,则损害 NMDA受体的功能也即可损害学习记忆能力。运用本发明提供的方法 可通过损害NMDA受体的功能改善需要抑制认知等方面的疾病,如 慢性疼痛(可塑性或记忆的一种形式);或用于遭遇到精神创伤后的 选择性失忆。
5.运用本发明中的方法,可筛选具有通过增强NR2B基因表达 从而增强学习记忆能力的化合物,这给研制治疗与学习记忆相关的疾 病的新药,或重新评价有关药物提供了重要的方法和技术。
6.运用本发明中的方法,能鉴定出影响NMDA受体介导的学习 记忆过程的基因和基因产物。这不仅可促进脑功能基因组学基础理论 的发展,还可利用新发现的基因或基因产物 为靶标,进行新药的筛选。
7.运用本发明中的方法,利用NMDA受体编码区的多态性和突 变性来进行诊断的方法。可发生在受体编码区或非编码区的突变或多 态性,与某种学习与记忆相关,能被鉴定出来。这些多态性与学习记 忆的增强或损伤有关。被鉴定出来的多态基因可以用于预测智商或者 学习记忆能力的测定,或者可以用于诊断学习记忆异常的诱因。
具体实施方式
(一)NR2B转基因大鼠的制备与特点
1、转化基因的制备:pJT-NR2B与Sal一起被消化,再从质粒 DNA中纯化出线型NR2B转化基因表达载体pJT-NR2B(CaMKII启 动子和NR2B基因)。
2、转基因大鼠的制备方法:将上述制备的线型DNA注射进纯 种大鼠的受精卵前核中(Tsien et al.,cell 87,1317-261996)。该鼠经 过交配产生F1和F2。研究发现这种杂交产生的野生型的F2具有良 好的学习能力。
3、转基因动物的基因型分析:用动物尾巴的血液提取DNA,分 析所有后代的基因型。用动物尾DNA(约1μg)在以下条件下进行 扩增:30个热循环(1min,94℃;45sec,55℃;1min,72℃)。采用Northern blot方法分析SV40的poly(A),以测定转化基因的mRNA。做Western blot时,从Upstate Biotechnology购买抗NR1,NR2A,NR2B的抗 体。从大鼠前脑中制备突触膜蛋白。样品溶于7.5%-SDS聚丙烯酰胺 中,分别用上述制备的抗体进行免疫印渍(immunoblotting),以过氧 化物标记的二抗和ECL检测系统(NEN Life Science产品)进行分 析。在做原位杂交时,解剖动物大脑并迅速冷冻。
4、结果
转基因大鼠在其生长、体重和交配方面都显正常,其笼外行为与 野生型的同胞没有显著差异,也未见其有强占性和骚动性方面的迹 象。Northern blot分析表明在大鼠的皮层和海马区NR2B转化基因的 表达较高,而在丘脑、脑干和小脑等部位的表达较弱。Western blot 分析方法显示:在转基因大鼠中,其皮层和海马部位NR2B蛋白质都 有增加。同时在这些区域可见NR1蛋白质有少量增加,而NR2A蛋 白质量不变。结果显示在受体复合物中NR2B与NR2A的比率和 NMDA受体总数都有所增加。
用原位杂交的方法分析转化基因的解剖学分布,发现转化基因高 浓度分布在皮层、纹状体、海马和杏仁核部位。在光镜水平,未见转 基因动物结构异常,而且,海马和皮层中树状棘的形状和结构也正常。
(二)NR2B转基因大鼠的电生理学分析
突触可塑性是指神经元之间信息传递的效率的变化。科学家们普 遍认为突触可塑性是突触水平研究学习记忆的最佳细胞分子模型,30 多年来的研究进展已充分证明突触可塑性参与了记忆的获取、巩固和 提取。学习记忆涉及到脑的许多区域和许多细胞分子过程,其中海马 脑区是参与学习记忆的重要脑区之一,而突触长时程增强(LTP)和 突触长时程减弱(LTD)是突触可塑性的表现。因此,我们测试与对比 了NR2B转基因大鼠和野生型同笼对照大鼠海马CA1区突触传递的 长时程增强(LTP)的特性。
1、海马脑片记录
海马脑片取自于4~6月龄的转基因大鼠以及正常大鼠,快速得到 海马的脑片后放到28℃、盛有人工脑脊液的孵育盒内。脑薄片在记 录盒中放置两个小时以上再记录。将一双钨丝组成的刺激电极放在海 马CA1区,同样在海马CA1区的辐射层,通过装有人工脑脊液的玻 璃微电极(3-12兆欧)记录胞外场电位。
2、结果
我们在CA1区Schaffer collateral侧支通路上做了一系列的LTP 实验。结果显示,一个单串的强直刺激(100Hz,1sec)可以在正常对 照大鼠海马(4~6个月)的脑片上,诱发出虽小的但可信的突触长时 程增强现象(LTP:123.05±0.60%)。然而同样的刺激可以在转基因 大鼠脑片上诱导出显著增强的LTP(LTP:146.54±0.70%,P<0.05)。
(三)NR2B转基因大鼠的行为学分析
1、方法:
行为学测试:成年(3至6个月)转基因大鼠以及正常大鼠,标 准条件(23±1℃,湿度50±5%)下饲养。所有的实验在隔音的、特殊的行 为学测试室内完成。所有的实验者都不知道每只动物的基因型。
新物体辨别实验
实验装置为一开场箱子,长、宽、高分别为120、120、38cm, 木质合板做成,用黑色的、无毒油漆漆成黑色。训练前,将动物放到 实验箱内适应环境5分钟,每天3次,连续3天。训练时,将两件物 体相隔80cm英寸放在实验箱内,将动物放到实验箱内,让其自由探 索5分钟。动物在离物体1英寸的距离内将头朝向此物体或除了尾巴 以外的身体部位接触到此物体时被认为是在探索这一物体。记录下动 物探索每一物体的时间。相隔一定的时间后,再将动物放回次实验箱 内,让其自由探索5分钟。之后,其中一个已经熟悉的物体被一新的 物体所取代。所有的物体根据自身的复杂性和情感上的中立性进行平 衡。而且,为了避免物体和实验箱内留有气味信息,每次实验结束后, 实验箱和物体均用70%的酒精擦拭。偏好指数被定义为花在探索某一 物体上的时间与探索两种物体的时间总和的比值,它可用来衡量识别 记忆。双因子方差分析和posthoc Dunnett’test用来分析基因型对行为 学反应的影响。
恐惧条件反射:此试验运用恐惧条件反射箱和多种参数监视器。 简言之,整个装置有以下几部分组成:反射箱(50×50×44cm),底部 有40根铁栅栏组成;发生器;扬声器;光束扫描器和工作台。反射 箱的壁是透明的,因此动物的凝固反应可以通过装在窗帘上的窥视窗 观察到,训练前,每只动物都要放到反射箱内让其适应环境,每次5 分钟,一共进行3次。条件刺激为85dB、2.8kHz的声音,非条件刺 激为一持续的0.75mA的足部电击。训练时,每只动物单独放到反射 箱内,自由探索3分钟,接着给予30秒的声音刺激,从声音刺激结 束前2秒开始给予2秒钟的电刺激。声音和电刺激匹配以后,让动物 继续呆在反射箱内30秒,然后立刻将其放回鼠笼内。在这个过程中, 实验者使用5秒采样实践方法和光束扫描系统记录动物的凝固反应。 凝固被定义为除了呼吸运动以外的身体所有部位都不动。电刺激后的 30秒内的凝固反应为早期凝固。在保持测试实验中,每一只动物被 放到反射箱内,记录3分钟内的凝固反应,这种情况下的条件反射称 为场景恐惧条件反射。接下来,动物被放到另外一个新的反射箱内(三 角形的箱子,光滑的平底,壁被染成黄和黑两色)。在给予声音刺激 前监视3分钟。然后,给予训练是相同的声音,持续3分钟,记录凝 固反应,这时称为线索恐惧条件反射。双因子方差分析和posthoc Dunnett’test用来分析基因型对行为学反应的影响。 水迷宫实验:水迷宫实验的装置为直径1.2米的圆形池子,具体过程和 以前所描述的一样,参见Tsien et al.,1996。动物的运动轨迹通过摄 像头描绘出来,并记录下逃避的潜伏期。单因子方差分析和posthoc Dunnett’test用来分析基因型对逃离潜伏期的影响。
2、结果
我们首先做了新事物辨别实验,此实验用来检测动物的视觉认知 记忆,在进化上是比较保守的,它是需要海马的参与。(Reed&Squire, Behav.Neurosci.111,667-75,1997;Myhrer,Behav.Neurosci. 102,356-62,1998;Mumby et al.Behav.Neurosci.110,266-81,1996)。 为了增加实验的难度,我们使用了5分钟训练计划。在训练部分中, 从探索偏好指数来看,花在探索两个物体的时间总和,转基因及野生 型动物间并不存在明显差异,提示两组动物探索两物体的动机以及对 两物体的好奇心是相同的。在保持实验中,其中一个熟悉的物体被一 新的物体所取代,让动物探索5分钟。在1个小时的保持实验中,两 组动物对新事物表现出相同的偏好,提示两组动物对记忆中的物体在 一个小时内记忆的保持能力是相同的。然而,一天或三天后再来做保 持实验时,转基因动物对新事物显示出了较强的偏好。表明转基因动 物具有较好的长期记忆。
接着,我们做了动物的两种联合性情感记忆,场景恐惧条件反射 和线索恐惧条件反射。给予动物非条件刺激(如电击足部)和条件刺 激(如声音),经过几次匹配后,动物就建立了恐惧条件反射。已经 证实场景恐惧条件反射要依赖于海马的,而线索恐惧条件反射是非海 马依赖性的(Philips&LeDoux,Beha.Neurosci.106,274-85,1992)。但 这两种类型的恐惧条件反射是需要NMDA受体的激活(Kim et al.,Beha.Neurosci.106,591-6,1992;Davis et al.,In:The psychology of learning and memory(Bower GH.Ed).New York:Academic Press, 1987)。两种条件反射都是在训练后1小时、1天、3天和7天进行。 首先,我们分析场景恐惧条件反射,转基因动物表现出一致的、较强 的凝固反应。单因子方差分析显示,1小时的早期凝固反应在两组动 物间不存在明显的差异,训练后1天和3天则表现出明显的差异,post hoc分析显示在转基因动物和野生型动物间存在显著的差异 (P<0.05)。
最后,我们使用水迷宫实验方法测试了转基因动物的空间学习能 力,这个过程需要海马中的NMDA受体的激活(Tsien et al.,Cell 1996; Morris et al.,Nature 297,681-3,1982)。随着训练过程的延续,转基因 和对照组动物逃到平台的时间(称为潜伏期)逐渐缩短,然而,在整 个过程中,两组动物间都存在着明显的组间差异,提示转基因动物的 空间学习记忆能力要好于野生型动物。
我们用转基因技术,在大鼠的大脑特异部位,包括海马和前脑皮 层等高量表达NR2B受体。这些转基因模式大鼠表现出海马部位LTP 增强、学习记忆能力提高。本发明的重要之处在于,改变了一个相同 基因(与NR2B转基因小鼠相同),也能够对不同种的动物——大鼠 产生同样的效应。这一结果充分证明了,在动物的大脑内改变一个基 因的表达量,能够提高动物的学习记忆能力。