技术领域
本发明涉及医用药物，具体涉及基因药物，尤其是治疗肝癌的基因药物及其制 备方法。
背景技术
肝癌是五大常见的恶性肿瘤之一，在全球发病率日益上升，严重危害着人类的 生命健康。和其它肿瘤一样，肝癌的治疗多采用手术治疗和化疗，但疗效不甚理想。 随着基因的分子生物学理论和技术的逐步完善，基因治疗给肝癌的治疗带来了希望。 如何实现基因治疗的靶向性？这是基因治疗研究者首先需考虑的问题。
直接杀伤肿瘤细胞是肝癌基因治疗的主要策略之一。治疗基因是否仅仅针对肝 癌细胞而不损伤正常的肝细胞，是值得关注的首要问题。也就是需选择肿瘤特异性 的治疗基因。近几年来，来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3 蛋白因其独特凋亡诱导效应而倍受研究者的青睐。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗肝癌的基因药物，使其具有良好的肝细胞靶向性， 对肝癌细胞具有极大的杀伤能力，且不诱导正常细胞的凋亡等特点。同时，本发明 还提供了该药物的制备方法。
以下是实现本发明目的的技术方案。
本发明提供的靶向性特异性治疗肝癌的基因药物，它是脱唾液酸粘蛋白(Asor) 一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物和含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体组成的 复合物；所述的真核表达载体为pcDNA3或pcDNA3.1；脱唾液酸粘蛋白(Asor) 一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物与含鸡贫血病毒VP3基因的真核表达载体的质量 比(蛋白∶核酸)为3-6∶1。
本发明提供的治疗肝癌的基因药物的制备方法，包括以下步骤：
a.以人血浆为原料制备脱唾液酸粘蛋白(Asor)；[参见Whitehead P.H，Sammons H.G.et al Asimple technique for the isolation of orosomucoid from normal and pathological sera. Biochim.Bioiphy.Acta，1966；124：209-211]。
b.用蛋白质交联剂水溶性碳二亚胺(EDC)将脱唾液酸粘蛋白(Asor)同多 聚左旋赖氨酸(PLL)连接，制备脱唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL) 连接物(Asor-PLL)，具体是将Asor、PLL、EDC按质量比1∶1∶0.5混合后用蒸馏 水溶解，用NaOH调节pH至7.2-7.4，37℃下搅拌反应72小时，再经透析、冻干 后得粉末状Asor-PLL连接物。
c.采用PCR方法扩增鸡贫血病毒标准株的vp3基因，将vp3基因克隆于真 核表达载体，得到含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体；
d.将上述制得的Asor-PLL连接物与含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体 分别溶解于0.9％NaCl溶液中，两溶液的浓度均为1-10μg/μl，将两溶液按质量比(蛋 白∶核酸)为3-6∶1的比例充分混合后，37℃放置16小时以上，经过滤除菌，制得本 发明药物。所述的以人血浆为原料制备脱唾液酸粘蛋白(Asor)的方法，是通过 DEAE-纤维素为填料的离子交换层析和硫酸铵分级分离技术[参见Whitehead P.H， Sammons H.G et al Asimple technique for the isolation of orosomucoid from normal and pathological sera.Biochim.Bioiphy.Acta，1966；124：209-211]，从人血浆中提取人血清粘蛋白 (Orosomucoid，OR)，然后通过酸水解的方式除去人血清粘蛋白中的唾液酸制得脱 唾液酸粘蛋白(Asor)。所述的真核表达载体是pcDNA3或pcDNA3.1。所述的 Asor-PLL连接物与含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体的质量比(蛋白∶核酸) 为3∶1。
本发明还提供了一种治疗肝癌的基因药物制剂，该制剂含有有效量的脱唾液酸 粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物(Asor-PLL)与含鸡贫血病毒vp3 基因的pcDNA3或pcDNA3.1真核表达载体组成的复合物和制药学上可接受的载体。 如以生理盐水或磷酸盐缓冲液为溶剂的注射液，其所含脱唾液酸粘蛋白(Asor)一 多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物和含鸡贫血病毒vp3基因的pcDNA3真核表达载体 复合物的浓度为100-400μg/ml，优选浓度为200μg/ml。以含鸡贫血病毒vp3基因 的pcDNA3真核表达载体的质量计算的浓度为200μg/ml。
基因药物Asor-PLL-pcDNA3-vp3，利用Asor受体介导的内吞作用，实现CAV vp3 基因的靶向性转移，同时利用CAV VP3蛋白仅诱导具有致瘤性表型或转化表型细胞 的凋亡，而不诱导正常细胞的凋亡的“肿瘤细胞靶向性”，实现CAV VP3在体内特 异诱导肝组织中肝癌细胞的凋亡效应以实现肝癌的特异性基因治疗。
附图说明
图1为尾静脉注射Asor-PLL-vp3复合物后裸鼠各组织的RT-PCR结果
M表示分子量标准，A表示实验鼠肝组织RT-PCR结果，B表示实验鼠肝癌组 织RT-PCR结果，C表示实验鼠心肌组织RT-PCR结果，D表示实验鼠肺组织RT-PCR 结果，E表示实验鼠肾组织RT-PCR结果，F表示实验鼠脾组织RT-PCR结果。图中 实验鼠肝组织和肝癌组织的RT-PCR结果为阳性，显示本发明药物具有显著的肝细 胞靶向性。
图2为Asor-PLL-vp3复合物抑瘤效应。
1表示第一组的实验组和对照组实验裸鼠的瘤块大小平均值统计学直框图。2 表示第二组的实验组和对照组实验裸鼠的瘤块大小平均值统计学直框图。图中深色 直框图代表对照组实验裸鼠瘤块大小平均值，浅色直框图代表实验组实验裸鼠瘤块 大小平均值。经统计学分析，第一组实验结果P＜0.05，第二组实验结果P＜0.01，显 示本发明药物具有显著的抑瘤效应。
具体实施方式
实施例1
(1)Asor-PLL连接物的制备
以人血浆为原料制备脱唾液酸粘蛋白(Asor)：通过DEAE-纤维素为填料的离 子交换层析和硫酸铵分级分离技术[参见Whitehead P.H，Sammons H.G.et al Asimple technique for the isolation of orosomucoid from normal and pathological sera.Biochim.Bioiphy. Acta，1966；124：209-211]，从人血浆中提取人血清类粘蛋白(Orosomucoid，OR)，然 后通过酸水解的方式除去人血清粘蛋白中的唾液酸，制得脱唾液酸粘蛋白(Asor)。
人血清类粘蛋白(Orosomucoid，OR)
↓酸水解，除唾液酸
脱唾液酸粘蛋白(Asor)
用蛋白质交联剂水溶性碳二亚胺(EDC)将脱唾液酸粘蛋白(Asor)同多聚左 旋赖氨酸(PLL)连接，制得脱唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL)连 接物(Asor-PLL)，具体是将Asor、PLL、EDC按质量比1∶1∶0.5混合后用蒸馏水 溶解，用NaOH调节pH至7.2-7.4，37℃下搅拌反应72小时，再经透析、冻干后 得粉末状Asor-PLL连接物。
(2)采用PCR方法扩增鸡贫血病毒标准株的vp3基因，将vp3基因装入真核 表达载体，得到含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体；
a.鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)病毒标准株Cux-1由中国兽医监 察所提供。
b.PCR引物：
vp3基因克隆引物P1为5′CG GGATCCGCTTAGCCGAGAGGGGC3′；
BamH I
vp3基因克隆引物P2为5′CG GAATTCGAGCTCTTGCCATC3′；
EcoR I
5′端分别含有限制性内切酶BamH I和EcoR I的限制性内切酶位点。扩增的目 的片段为鸡贫血病毒vp3基因的编码序列及部分调控序列。
c.PCR扩增反应条件
循环参数为95℃变性5min，94℃1min、50℃1min、72℃2min，循环扩增次数 35次，最后72℃延伸10min。
回收纯化的PCR产物、载体pcDNA3分别用BamHI和EcoRI进行双酶切， 分别回收0.4Kb和5.0Kb大小的片段。连接和转化按常规进行。挑取若干个单菌落， 分别进行质粒扩增、提取，经BglII酶切分析，筛选出含插入片段的重组质粒。
vp3基因的测序结果如下(由北京赛百盛公司完成)：
CG GGATCCGCTTAGCCGAGAGGGGCAACCTG GGCCCAGCGGAGCCGCGCAGGGGCAAGTAATTTCAAATGAACGCTCTCCAA
GAAGATACTCCACCCGGACCATCAACGGTGTTCA GGCCACCAACAAGTTCAC GGCCGTTGGAAACCCCTCACTGCAGAGAGA
TCCGGATTGGTATCGCTGGAATTACAATCACTCTATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGCTCGCGCTCCCACGCTA AGATCTGC
AACTGCGGACAATTCAGAAAGCACTGGTTTCAAGAATGTGCCGGACTTGAGGACCGATCAACCCAAGCCTCCCTCGAAGAAG
CGATCCTGCGACCCCTCCGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAAAGA AAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCG
CAAGAAGGCGTATAAGACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTC GAATTCCG
BglII：AGATCT HindIII：AAGCTT HaeIII：GGCC
BamHI：GGATCC EcoRI：GAATTC ATG：起始密码 TAA：终止密码
克隆结果与标准株一致。
(3)将上述制得的Asor-PLL连接物与含鸡贫血病毒vp3基因的真核表达载体分 别溶解于0.9％NaCl溶液中，两溶液的浓度均为1-10μg/μl，将两溶液按质量比(蛋 白∶核酸)为3∶1充分混合后，37℃放置16小时，经过滤除菌，制得浓度为200μ g/ml(以0.9％NaCl溶液中含鸡贫血病毒vp3基因的pcDNA3真核表达载体的质量 计算的浓度)本发明药物注射液制剂。
实施例2
将脱唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物和含鸡贫血病毒 vp3基因的pcDNA3真核表达载体分别溶解于0.9％NaCl溶液中，将两溶液按质量比 (蛋白∶核酸)为4∶1充分混合后，37℃放置16小时，经过滤除菌，制得浓度为 200μg/ml(以0.9％NaCl溶液中含鸡贫血病毒vp3基因的pcDNA3真核表达载体的 质量计算的浓度)本发明药物注射液制剂。
实施例3
将脱唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物和含鸡贫血病毒 vp3基因的pcDNA3真核表达载体分别溶解于磷酸盐缓冲液(其组成为：0.8％NaCl， 0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)中，将两溶液按质量比(蛋白∶核酸) 为3∶1充分混合后，37℃放置16小时，经过滤除菌，制得浓度为200μg/ml(以磷 酸盐缓冲液中含鸡贫血病毒vp3基因的pcDNA3真核表达载体的质量计算的浓度) 本发明药物注射液制剂。
实施例4 药效学实验
一、实验材料：
本发明基因药物：Asor-PLL-pcDNA3-vp3的生理盐水(0.9％NaCl)静脉注射液， 其所含脱唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋赖氨酸(PLL)连接物和含鸡贫血病毒 VP3基因的pcDNA3真核表达载体复合物的浓度为200μg/ml。
二、实验动物：裸鼠购置华中科技大学同济医学院实验动物中心，5-6周龄， 体重16-24g。
三、建立人肝癌裸鼠原位移植瘤模型
首先建立皮下人肝癌荷瘤裸鼠模型，形成人肝癌实体瘤，将瘤体取出，切碎。 行皮下瘤肝移植手术建立人肝癌裸鼠原位移植瘤模型。2周后，随机将存活裸鼠分 成实验组和对照组。
四、实验方法
(1)实验组尾静脉注射Asor-PLL-pcDNA3-vp3的生理盐水静脉注射液。每克 鼠重注射0.1ml。对照组尾静脉注射等量的生理盐水作为空白对照。
(2)5天后，处死动物，进行体内瘤体及各主要脏器vp3基因分布及表达水平 的检测。通过RT-PCR技术验证该复合物体内的肝细胞靶向性。
a.TRIzol法提取总RNA。(按美国Introvigen公司TRIzol试剂盒说明书进行操 作)
b.RT(逆转录)反应按常规方法进行。(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁 克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社，1992)
c.PCR扩增反应条件
PCR引物：
vp3检测引物P1为5′CAAGAAGATACTCCACCCG 3′；
vp3检测引物P2为5′TTTAGCTCGCTTACCCTGT 3′；
循环参数为95℃变性5min；94℃50sec、50℃45sec、72℃1min；循环扩增次 数35次；72℃10min。PCR产物长度为290bp。
(3)通过观察肿瘤块的大小，经统计学检验，验证vp3基因的体内抑瘤效应。
五、实验结果
肿瘤组织总RNA的RT-PCR结果表明vp3基因在组织中得以表达，且通过裸鼠 各主要脏器总RNA的RT-PCR结果，证实了该复合物的肝细胞靶向性，见图1。第 一组实验组瘤块平均体积为1.21±0.28mm3，对照组瘤块平均体积14.33±5.51 mm3，经统计学分析，P＝0.02682，P＜0.05，见表1。第二组实验组瘤块平均体积为 1.73±0.72mm3，对照组瘤块平均体积20.76±7.07mm3，经统计学分析， P＝0.006050，P＜0.01，见图2和表2。
两组实验瘤块体积表
表1 第一组 单位mm3 A 10.80 20.68 11.52 B 1.00 1.52 1.10
P＜0.05，A：对照组(3只裸鼠)，B：实验组(3只裸鼠)
表2 第二组 单位mm3 A 27.00 22.40 10.60 23.04 B 2.44 1.24 1.00 2.25
P＜0.01，A：对照组(4只裸鼠)，B：实验组(4只裸鼠)
实施例5
以磷酸盐缓冲液(其组成为：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4， 0.024％KH2PO4)为溶剂的本发明药物注射液取代生理盐水注射液进行实施例4的药 效学实验，结果与实施例4一致。
以下为序列表，其中
序列1为vp3基因核酸序列；
序列2为vp3结构基因对应的氨基酸序列；
序列3为vp3基因克隆引物P1；
序列4为vp3基因克隆引物P2；
序列5为vp3检测引物P1；
序列6为vp3检测引物P2。
序列表
<110>华中科技大学同济医学院
<120>一种靶向性特异性治疗肝癌的基因药物及其制备方法
<130>1
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>458
<212>DNA
<213>Chicken anemia virus
<220>
<221>CDS
<222>(68)..(433)
<223>
<400>1
cgggatccgc ttagccgaga ggggcaacct gggcccagcg gagccgcgca ggggcaagta 60
atttcaa atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg 109
Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr
1 5 10
gtg ttc agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc 157
Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys
15 20 25 30
aga gag atc cgg att ggt atc gct gga att aca atc act cta tcg ctg 205
Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu
35 40 45
tgt ggc tgc gcg aat gct cgc gct ccc acg cta aga tct gca act gcg 253
Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala
50 55 60
gac aat tca gaa agc act ggt ttc aag aat gtg ccg gac ttg agg acc 301
Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr
65 70 75
gat caa ccc aag cct ccc tcg aag aag cga tcc tgc gac ccc tcc gag 349
Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu
80 85 90
tac agg gta agc gag cta aaa gaa agc ttg att acc act act ccc agc 397
Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser
95 100 105 110
cga ccc cga acc gca aga agg cgt ata aga ctg taa gatggcaaga 443
Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu
115 120
cgagctcgaa ttccg 458
<210>2
<211>121
<212>PRT
<213>Chicken anemia virus
<400>2
Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu
20 25 30
Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly
35 40 45
Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn
50 55 60
Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln
65 70 75 80
Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg
85 90 95
Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro
100 105 110 Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu
115 120
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
cgggatccgc ttagccgaga ggggc 25
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
cggaattcga gctcttgcca tc 22
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
caagaagata ctccacccg 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
tttagctcgc ttaccctgt 19