技术领域
本发明涉及一种从鲜鹿茸中综合提取活性成分的方法，属于从鹿茸中提取活 性成分的技术。
背景技术
鹿茸为梅花鹿或马鹿的尚未骨化的幼角，是我国传统名贵中药，它的治疗作 用在历代本草中都有记载。现代药物化学分析表明，鹿茸中含有多种生理活性成 份，主要有不饱和脂肪酸、雌激素、甾体化合物、胆固醇、磷脂、氨基酸、多肽、 多胺、多糖及次黄嘌呤、对羟基苯甲醛和微量元素等，这些活性成分具有抗衰老、 抗氧化、提高机体免疫力等多种功效。鹿茸组织中的蛋白质、多肽类物质占总重 量的50％以上，近些年来从鹿茸中分离得到了多种对机体生长、发育及其调控具 有重要功能的生长因子，如表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、神经 生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)、转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)、生长激素(Growth hormone，GH)和胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors，IGF-1)等。(王秋玉，王本祥.论鹿茸生长因子，中医药学报，2000， 6∶10～12)
在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸要经过煮炸、烘干等步骤，由于要经过多次 长时间高温煮炸，一方面会使很多水溶性成分损失掉，另一方面蛋白质、多肽等 热敏性成分的活性破坏殆尽。因此传统的加工工艺没有能充分利用鹿茸中的活性 成分，从而大大降低了鹿茸的应用价值，造成很大的资源浪费。
一些专利介绍了从鹿茸中提取生长因子的研究(中国，CN 1104095A，1995； 中国，CN 1603344A，2005)，但是这些方法在提取鹿茸中多肽时，又忽视了对 蛋白质以外的活性成分的利用。
发明内容
本发明的目的是针对上述已有技术的不足，提出的一种综合提取鹿茸中活性 成分的方法。主要目标是提取鲜鹿茸中的两大类活性组分：一类是弱极性的脂溶 性物质，如不饱和脂肪酸、雌激素、甾体化合物、胆固醇、磷脂等；另一类是蛋 白质、多肽类活性物质。
本发明是通过下述技术方案实现的，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净、切块后，经胶体磨在4～10℃下粉碎，粉碎时 可以加入少量预冷的去离子水。将粉碎后的鲜鹿茸首先在-20℃以下预冷冻，然 后在-30～-50℃下冷冻干燥机上进行干燥。
(2)超临界CO2萃取鲜鹿茸中脂溶性成分的过程是：将鹿茸冻干粉装入萃 取釜中，萃取温度25～35℃，萃取压力20～60MPa，CO2流速10～25kg/h；萃 取物在分离釜中进行二级减压分离：一级分离釜的压力为10～18MPa，温度为 25～35℃，收集包含有雌二醇、雌三醇、孕酮、睾酮、低级脂肪酸、磷脂、谷 甾醇的活性成分的产物；二级分离釜压力为5～8MPa，温度为25～50℃，收 集包含有亚油酸、亚麻酸、二十碳四烯酸的活性成分的产物。
(3)超声波强化浸提过程包括：向鲜鹿茸的超临界CO2萃余物中按质量比 加入3～10倍的的缓冲液，超声波强化浸提温度为20～30℃，超声功率为120～ 250w，超声时间为30～60min；浸提液在-4℃下按5000r/min速度离心10～20 min；然后沉淀部分加入3～5倍质量比的同种缓冲液，重复上述步骤；合并两次 离心所得上清液。
(4)在10～20℃条件下，利用孔径为2～6kDa的超滤膜将步骤(3)所得 提取液进行浓缩，同时以去离子水进行溶液置换，收集浓缩液。
(5)将步骤(4)所得浓缩液首先在-20℃以下冷冻，然后在-30℃～-60 ℃的冷冻干燥机上进行干燥，获得的冻干粉含水量低于3％。
上述步骤(3)所用缓冲液为pH 9～12的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、碳酸氢 钠-氢氧化钠缓冲液或稀氨水和1mol/L硫酸配制的溶液，主要以提取鹿茸中的胰 岛素样生长因子-1(IGF-1)为目标；也可以根据目标蛋白的性质选用其它缓冲 液作为提取剂。
本发明的优点在于利用本发明技术可以实现鹿茸中两大类活性物质的综合 利用，提高鹿茸的应用价值；利用超临界CO2萃取技术既可以使脂溶性活性物 质得到回收利用，又相当于为提取鹿茸中蛋白质、多肽过程进行脱脂预处理。
具体实施方式
实施例11000g鲜鹿茸经燎毛、洗净、切块后，经胶体磨粉碎至120～350μm 结束。将粉碎后的鲜鹿茸首先在-20℃下预冷冻，然后在-30℃～-50℃的冷 冻干燥机上进行干燥，干燥后产品的含水量为低于5％。
将200g鹿茸冻干粉装入萃取釜中，萃取温度35℃，萃取压力55MPa，CO2流速15kg/h；一级分离釜的压力为15MPa，温度为35℃，萃取物为淡黄色膏状，， 萃取率为1.5～2.0％，包含有雌二醇、雌三醇、孕酮、睾酮、低级脂肪酸、磷脂、 谷甾醇的活性成分；二级分离釜压力为5MPa，温度为50℃，萃取物为乳白色 油脂状，萃取率为1.0～1.5％，包含有亚油酸、亚麻酸、二十碳四烯酸等活性成 分。
利用0.2mol/L碳酸钠和0.2mol/L碳酸氢钠溶液混合，配制成pH9.8的碳酸 钠-碳酸氢钠缓冲液作为提取剂。取100g超临界CO2萃余物，加入1000g提取 剂，搅匀后进行超声浸提30min，提取温度为20℃，超声功率为200w；以5000 r/min的速度在-4℃下离心20min；向沉淀中再加入500g提取剂，重复上述提 取步骤；合并两次离心所得上清液。上清液中含有胰岛素样生长因子(IGF-1) 和生长激素(GH)等活性多肽，IGF-1提取率可以达到3200～3500ng/g鲜鹿茸。 超声波提取液用截留分子量为6kDa的超滤膜进行超滤浓缩，并用去离子水进 行溶液置换。将超滤浓缩液在-20℃下预冷冻，然后在-40～-60℃用冷冻干燥机 进行干燥。干燥后获得的冻干粉含水量低于3％。
实施例2采用萃取温度35℃，萃取压力20MPa，其它超临界CO2萃取、分离 工艺条件同实施例1。与实施例1结果比较，一级分离釜中的萃取率下降，仅为 1.2～1.5％，产物中检测不到低级脂肪酸和磷脂，而雌二醇、雌三醇的含量增大； 二级分离釜的萃取率有所增大，为1.3％～1.7％，产物中亚油酸、亚麻酸、二十 碳四烯酸等活性成分的含量变化不大。
实施例3利用0.5mol/L氨水和1mol/L硫酸配制pH11的碱性溶液，作为鲜鹿 茸超临界CO2萃余物的提取剂。IGF-1提取率为3000～3300ng IGF-1/g鲜鹿茸， 还可以同时提取鹿茸中的生长激素(GH)，GH提取率为20～40ng GH/g鲜鹿 茸。