技术领域
本发明涉及可以对在生物体内或培养细胞内生产的目的蛋白质进 行简便定量的，用于在生物体内生产目的蛋白质的基因治疗用载体。
背景技术
在患者体内生产目的蛋白质进行基因治疗时，目的蛋白质的血浓 度只有在可以建立该蛋白质的ELISA法等测定方法时可以进行确定， 在不能建立上述测定方法时不能进行确定。利用标记蛋白测定上述蛋 白浓度的分析方法已实际应用并作为商品销售。但是，这种测定的灵 敏度低，尚没有建立用于在基因治疗测定血液浓度的方法。参考文献 (Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding IFN-γR/Fc，The Journal of Clinical Investigation，2000年7月，第106卷，第2期， p207-215)中通过不测定目的蛋白质而对受其影响的蛋白质定量化间接 地证明了目的蛋白质的表达。显示出血液中浓度测定的难度。
发明的公开
本发明的目的在于提供一种基因治疗用载体，其能够在进行基因 治疗时高敏感度地监控目的蛋白质的血液中浓度，几乎不会引起由标 记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反应。
本申请的发明人进行深入的研究结果发现，通过以整合了编码由 通过基因治疗有待在体内生产的目的蛋白质和胰高血糖素的C末端侧 19-29个氨基酸肽的融合蛋白质的核酸的载体进行基因治疗，以上述胰 高血糖素肽为标记可高敏感度地测定目的蛋白质的血液中浓度，并且 发现几乎不会诱导由标记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反 应，从而完成本发明。
换言之，本发明提供了一种基因治疗用载体，该载体具有如下结 构：在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端 侧19-29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合 蛋白质的核酸，其能够在哺乳动物细胞内生产前述融合蛋白质。此外， 本发明提供了一种基因治疗方法，其包括将有效量的上述本发明的基 因治疗用载体施用于有待上述目的蛋白质在体内或细胞内表达的哺乳 动物或培养哺乳动物细胞。进而，本发明还提供了上述本发明的基因 治疗用载体在制备基因治疗用药物中的用途。进而，本发明还提供了， 通过前述基因治疗用载体的表达对体内或培养哺乳动物细胞内生产的 目的蛋白质的定量方法，其包括对从施用了上述本发明的基因治疗用 载体的哺乳动物或培养哺乳动物细胞中收集的被检试样中的C末端侧 19-29个氨基酸肽区域进行免疫测定。进而，本发明还提供了在哺乳动 物体内或培养哺乳动物细胞中由外部施用的表达载体的表达所生产的 目的蛋白质的标记剂，其包含胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸 的肽。进而，本发明还提供了一种体内或培养细胞内生产的蛋白质的 标记方法，其包括通过以与作为标记剂的胰高血糖素的C末端侧19-29 个氨基酸肽的融合蛋白质形式表达由外部施用的表达载体产生的目的 蛋白质，从而在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内以胰高血糖素的C 末端侧19-29个氨基酸肽对体内或培养细胞内生产的目的肽进行标 记。进而，本发明还提供了胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽 作为在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内由外部施用的表达载体产 生的目的蛋白质的标记剂的用途。
通过本发明，首次提供了下述基因治疗用载体，其能够以高敏感 度测定目的蛋白质的血液中浓度且其标记肽不具有生理作用。胰高血 糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽由于其没有自体生理作用，在各种 哺乳动物中十分保守，且基本不引起免疫反应，因此通过采用市售的 免疫测定试剂盒的高敏感度地免疫测定可对其定量。
附图的简要说明
图1表示实施例1中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列。
图2是图1的续。
图3是图2的续。
图4表示实施例1-5中使用的用于哺乳动物表达的载体pCAGGS 的基因图谱。
图5表示实施例1中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来 自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图6表示实施例1中测定的，在采用本发明的载体进行基因治疗 时的目的蛋白质的血液中浓度，以及采用本发明的载体进行基因治疗 时和采用插入了编码没有融合来自胰高血糖素的标记肽的目的蛋白质 的核酸的载体进行基因治疗时的血糖值随时间的变化。
图7表示实施例2中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图8是图7的续。
图9是图8的续。
图10表示实施例2中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来 自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图11表示实施例2和比较例2中，大鼠的移植心脏的附着生长天 数。
图12表示实施例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图13是图12的续。
图14是图13的续。
图15表示比较例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图16是图15的续。
图17表示实施例3中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来 自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图18表示实施例3和比较例3中，大鼠的心肌炎病变部位的面积 比率。
图19表示实施例4中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图20是图19的续。
图21是图20的续。
图22表示实施例4中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来 自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图23表示实施例4和比较例4中，大鼠的心肌炎病变部位的面积 比率。
图24表示实施例5中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片 段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图25表示实施例5中用于通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定 的目的蛋白质的血液中浓度，与通过人白介素8测定的目的蛋白质的 血液中浓度之间的相互关系。
发明的最佳实施方式
通过本发明的载体与目的蛋白质融合表达的所谓“胰高血糖素的C 末端侧19-29个氨基酸肽”是指从胰高血糖素的C末端算起从第19位 至第29位的合计11个氨基酸构成的肽。即，该肽具有序列表的序列 号1所示的氨基酸序列的肽。这个“胰高血糖素的C末端侧19-29个 氨基酸肽”作为目的蛋白质的标记使用，下面，方便起见称为“来自 胰高血糖素的标记肽”。
本发明的载体中整合了编码来自胰高血糖素的标记肽区域与目的 蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。
本发明中使用的用于哺乳类动物的表达载体是基因治疗领域公知 的，其没有限制只要是用于哺乳类动物的表达载体即可。本发明的特 征在于作为目的蛋白质的标记的来自胰高血糖素的肽的区域与目的蛋 白质相融合的形式表达，用于哺乳类细胞的表达载体没有任何限定， 可以使用在基因治疗领域中使用的公知的任一用于哺乳类细胞的表达 载体。可以是质粒载体也可以是病毒载体，从安全性角度考虑，优选 使用质粒载体。各种用于哺乳类细胞的表达载体是众所周知的，此外 也有市售的，可以优选使用这些周知的或市售的载体。周知或市售的 载体的例子可列举为pCAGGS(Efficient selection for high expression transfactans with a novel eukaryotic vector，Gene 1991 Dec.15，108(2)p193-199，基因图谱示于图4，其碱基序列示于序列表的 序列号3)、PROMEGA公司的pCI载体、pSI载体和pTARGET载体 以及INVITROGEN公司的pcDNA5/TO等，其不受上述限定。
通过基因治疗于体内生产的目的蛋白质没有任何限定，可举例为 如干扰素、白介素和CTLA4之类的各种细胞因子、生长因子、胰岛素 等激素和细胞粘着因子等及其受体。此外，任意的抗原蛋白质可通过 基因疫苗形式在体内得以生产。此外，目的蛋白质本身也可以是融合 蛋白质。例如，也可以在需要与Fc受体结合的所需的细胞因子的一端 融合免疫球蛋白，优选IgG，尤其是IgG1的恒定区域(Fc)，以提高与 Fc受体的结合能力的目的蛋白质(参照下述实施例1-4)。编码IgG的Fc 区域的核酸的碱基序列是周知的，例如编码人的IgG的Fc区域的核酸 的碱基序列记载于例如Genebank登录号：BC020823等处，编码大鼠 的IgG的Fc区域的核酸的碱基序列示于本申请的图1-3等中。
本发明的载体通过在哺乳动物细胞用表达载体的克隆位点处插入 编码目的蛋白质与上述标记肽的融合蛋白质的核酸获得。并且，标记 肽优选融合于目的蛋白质的一端尤其是C末端。
基因治疗可通过将本发明的基因治疗用载体施用于哺乳动物来进 行。施用途径优选静脉注射或肌肉注射之类的非经口腔施用途径。载 体的施用量可根据目的蛋白质的性质、有待治疗的疾病的种类和程度 等进行相应设定，每1kg体重的载体施用量通常是1mg-10mg左右，优 选2mg-4mg左右。作为制剂，可以使用例如溶解于林格氏(ringer)溶液 中的基因治疗用载体溶液作为注射液。可以在其中添加医药制剂领域 中周知的注射用添加剂。或者，也可以将本发明的基因治疗用载体施 用于体外培养的哺乳动物细胞。即，将淋巴细胞或骨髓细胞等细胞取 出进行体外培养，对培养细胞施以基因载体，再以获得具有目的蛋白 质生产能力的细胞对患者进行的基因治疗，本发明的基因治疗用载体 也可施用于培养哺乳动物细胞。或者，可在体外研究基因治疗用载体 的治疗效果的实验中施用培养的哺乳动物细胞。
在基因治疗中，通过向体内导入的载体生产上述目的蛋白质与来 自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。另外，对体外培养的哺乳动物 细胞施用基因治疗用载体时，该培养细胞内生产出上述目的蛋白质与 来自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。由于目的蛋白质与标记肽融 合，可以通过测定来自胰高血糖素的标记肽的浓度来测定目的蛋白质 的浓度。并且，由于免疫测定本发明中使用的来自胰高血糖素的标记 肽的试剂盒是市售的(DAICHI RADIOISOTOPELABORATORIES，公 司等制备的胰高血糖素RIA试剂盒)，可以使用这种市售免疫测定试剂 盒容易地进行测定。
定量来自胰高血糖素的标记肽的被检试样是来自施用了本发明的 基因治疗用载体的个体的各种体液或组织等或其稀释物，优选是全 血，血清或血浆或其稀释物等血液试样。此外是，基因治疗用载体施 用于体外培养的哺乳动物的情况下，被检试样是培养细胞的匀浆或培 养上清液等。
实施例1、比较例1
以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’- gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-tcaacc actgcacaaaatcttgggctttacccggagagtgggagagact-3’作为引物进行PCR，进 而用以该PCR产物的300倍稀释物为模板，用5’- gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-gagaga gagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用 EcoR I将扩增产物整合入用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的克 隆位点。通过这些步骤，获得插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的 pCAGGS-IgG-glu19-29(在免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的编码区域 的下游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段插入 pCAGGS的EcoR I部位)。
下面，以大鼠心肌炎的心脏的cDNA为模板，用5’- gagaattcatttaaatgattctgctggtggtcctgatg-3’，5’-gcagcatcgc ggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的 EcoR I位点插入具有序列表的序列号2所示的碱基序列(显示含有限制 性酶切位点)的DNA片段，制备出本发明的载体(实施例1)。并且，图 1-图3还显示了序列号2的其它信息。如图1至图3所示，插入的核酸 片段为，在两端都有EcoR I位点的，且位于编码干扰素γ受体(IFNγ R)蛋白质与免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的融合蛋白质的区域的下 游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段(IFNγR- IgG-胰高血糖素19-29)。
对7只大鼠每一只的尾静脉注射不含来自胰高血糖素的标记肽的 质粒载体(比较例1)和以上述方式制备的含有来自胰高血糖素的标记肽 的本发明的质粒载体(实施例1)，进行基因治疗。注射液的组成是在 20ml的林格氏溶液中溶解了800μg的质粒每只。注射后，随时间推移 采血，将采血获得的1-10μl的血浆稀释100-1000倍，用市售的RIA 试剂盒，按照该试剂盒附带的说明书测定来自胰高血糖素的标记肽的 浓度，进而测定目的蛋白质(本实施例中是IFNγR/IgG1Fc融合蛋白 质)的浓度。即，RIA具体是按以下方式进行。在400μl检测用缓冲液 中添加200μl标准胰高血糖素溶液或稀释的被检血浆，进而添加100 μl胰高血糖素-125I溶液，添加100μl胰高血糖素抗血清，4℃下放置 48小时。之后，添加100μl第二抗体，400μl胰高血糖素RIA用沉 淀稳定剂，4℃下放置30分钟，离心分离(2000×g30分钟，4℃)后， 除去上清液后测定计数率求出浓度。
图5是血液中浓度的测定结果。实施例1中，静脉注射后第1天 结果为2870±1062ng/ml(平均±标准偏差)，第3天为1440±334ng/ml， 第7天为1120±433ng/ml，第16天为281±162ng/ml，所有的例子均 可被测定。另一方面，用不含来自胰高血糖素的标记肽的质粒载体的 基因治疗中，以同样方式检测，其结果低于检测限。
图6是质粒静脉注射4，8，12小时后的血糖值和以上述同样方式 用RIA测定法检测的蛋白血液中浓度的值。实施例1中，血糖浓度4 小时后显示为2815±2318ng/ml，8小时后为6061±2789ng/ml，12小 时后为5752±2270ng/ml，显示出最大血液中浓度的8-12小时后的血糖 为8小时后89.3±15.1mg/dl(实施例1)vs 81.8±7.5mg/dl(比较例1)，12 小时后63.5±5.7mg/dl(实施例1)vs 71.4±6.9mg/dl(比较例1)，没有差 异。
从以上结果表明，通过使用本发明的载体，能够在施用载体的数 十天后，从极少量的血浆样品中足以测定出目的蛋白质的血液中浓 度。
实施例2、比较例2
以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’- gagaattcatttaaatggcttgtcttggactccagagg-3’，5’-gcagcatcgcgg ccgcgtctgaatctgggcatggttctgg-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I 将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG- glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体 pCAGGS的EcoR I位点插入具有图7至9以及序列号4所示的碱基序 列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠CTLA4-IgG-胰高血糖素19-29(在 大鼠CTLA4编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合 来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达 CTLA4-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例2)。为了比较，制备 了插入有不含CTLA4编码区域仅插入IgG-胰高血糖素19-29编码区域 的重组载体(比较例2)。
对心脏移植后的大鼠以与实施例1同样方式施用重组载体，测定 血液中浓度。同时，研究移植心脏的附着生长天数。
结果示于图10和图11中。如图10所示，实施例2中，CTLA4-IgG -胰高血糖素19-29蛋白的变化如图7所示。就是说，尽管在100倍稀释 物中无法测定胰高血糖素之前的值，但一天后急剧上升，显示出超过 5000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出超过1000 ng/ml的蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第105天后。此外，如图11 所示，实施例2中，10只中有1只在14天时被排斥，直至检测的第105 天剩下的9只都附着生长。用不含CTLA4的pCAGGS-SP-IgG-glu19-29治疗的组中(实施例2)，5只中有1只在第5天时，1只在第6天时，3 只在第7天时被排斥，这些显著地显示出pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29治疗的有效性。
实施例3、比较例3
以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’- gagaattcatttaaatggcactctgggtgactgcagtc-3’，5’-gcagcatcg cggccgcgtggccatagcggaaaagttgctt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS- IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体 pCAGGS的EcoR I位点插入具有图12至14以及序列号5所示的碱基 序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL13-IgG-胰高血糖素19-29(在 大鼠白介素13(IL13)编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下 游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中 表达IL13-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例3)。为了比较，制 备了插入有不含IL13编码区域的仅插入有SP-IgG-胰高血糖素19-29编 码区域(序列表序列号6及图15和图16)的重组载体(比较例3)。
对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57 卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓 度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积 率。
结果示于图17和图18中。IL13-IgG-胰高血糖素19-29蛋白的变化 如图17所示。换句话说，第1天时呈现超过2000ng/ml的蛋白浓度， 尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出约8ng/ml的蛋白浓度直至检测的宰 杀后的第16天后。此外，如图18所示，施用本发明基因治疗用载体 pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29(插入IL13-IgG-glu19-29的载体pCAGGS)的 组，与施用不含IL13的pCAGGS-SP-IgG-glu19-29的组相比，心肌炎病 变部位的面积明显更小，显示出了pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29治疗的 有效性。
实施例4、比较例4
以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’- gagaattcatttaaatggaaatctgctggggaccctac-3’，5’-gcagcatcgcgg ccgcttggtcttcctggaagtagaactt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I 将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG- glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体 pCAGGS的EcoR I位点插入具有图19至21以及序列号7所示的碱基 序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL1RA-IgG-胰高血糖素19-29(在大鼠白介素1受体拮抗剂编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区 域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大 鼠细胞中表达IL1RA-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例4)。
对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosin fraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57 卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓 度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积 率。为了比较，施用比较例3的载体(比较例4)。
结果示于图22和图23中。如图22所示，实施例4中，IL1RA-IgG -胰高血糖素19-29蛋白的变化如图22所示。就是说，第1天时呈现超过 2000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，呈现出约20ng/ml的 蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第16天后。此外，如图23所示， 实施例4与比较例4相比，心肌炎病变部位的面积明显更小，显示出 了pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29治疗的有效性。
实施例5
为了制备插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的pCAGGS-glu19-29， 以5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccccgggtaaagcccaagatt ttgtgcagtggttg-3’，5’-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgca caaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用EcoR I整合入pCAGGS的克 隆位点。
接着，以Cos7细胞的cDNA为模板，以5’- gagaattcatttaaatgacttccaagctggccgtggct-3’，5’-gcagcatcgcgg ccgctgaattctcagccctcttcaaaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I 将这些PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体 pCAGGS的EcoR I位点插入具有图24以及序列号8所示的碱基序列 (显示含有限制性酶切位点)的人IL8-胰高血糖素19-29(在人白介素8编 码区域的下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在 大鼠细胞中表达IL8-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例5)。
对大鼠，按与实施例1同样方式施用重组载体，1天后采血，测定 血液中浓度。同时，定量相同试样中人IL-8的浓度。人IL-8的浓度的 定量采用BIOSOURSE公司(Nivelles，Belgium)制造的IL-8EASIA试剂 盒按照其说明书进行。
结果示于图25中。如图25所示，两者的摩尔浓度大致相同，这 证明了用胰高血糖素19-29标记肽的方法的正确性。
序列表
<110>NIIGATA TLO CORPORATION
<120>基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体
在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定量的方法
<130>03PF275-PCT
<150>JP 2003-3967
<151>2003-01-10
<160>24
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>编码人，小鼠或大鼠胰高血糖素C19-29区域的寡肽
<400>1
Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
1 5 10
<210>2
<211>1471
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1461)
<223>编码大鼠IFN-r受体，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物
<400>2
gaattcatttaa atg att ctg ctg gtg gtc ctg atg ctg tct gcg gag atc 51
Met Ile Leu Leu Val Val Leu Met Leu Ser Ala Glu Ile
1 5 10
ggg agt gga gct ttg atg agc acc gag gat cct aag ccg ccc tcg gtg 99
Gly Ser Gly Ala Leu Met Ser Thr Glu Asp Pro Lys Pro Pro Ser Val
15 20 25
cct gcg cca aca aat gtt cta att acg tcc tat gac ttg aac cct gtc 147
Pro Ala Pro Thr Asn Val Leu Ile Thr Ser Tyr Asp Leu Asn Pro Val
30 35 40 45
gta cat tgg aag cac cag aac gtg tcg cag gct gcc gtc ttc act gta 195
Val His Trp Lys His Gln Asn Val Ser Gln Ala Ala Val Phe Thr Val
50 55 60
cag gta aag atg tat cca gaa tac tgg act gat gcc tgc acc aac att 243
Gln Val Lys Met Tyr Pro Glu Tyr Trp Thr Asp Ala Cys Thr Asn Ile
65 70 75
gcc cat cat tat tgt aat atc tac aaa cac att tcc tat cct gac tca 291
Ala His His Tyr Cys Asn Ile Tyr Lys His Ile Ser Tyr Pro Asp Ser
80 85 90
tct gcc tgg gcc aga gtt aag gcc aag gtt gga caa aga gaa tct gcc 339
Ser Ala Trp Ala Arg Val Lys Ala Lys Val Gly Gln Arg Glu Ser Ala
95 100 105
tat gcg cag tca gaa gag ttt att atg tgc cga aag ggg aag gtt gga 387
Tyr Ala Gln Ser Glu Glu Phe Ile Met Cys Arg Lys Gly Lys Val Gly
110 115 120 125
ccg cct ggc ctg gac atc gga agg aag gaa gat cag ctg att gtc cac 435
Pro Pro Gly Leu Asp Ile Gly Arg Lys Glu Asp Gln Leu Ile Val His
130 135 140
ata ttt cac cct aag gtc aat gtg agt cag gaa acc atg ttt ggt gac 483
Ile Phe His Pro Lys Val Asn Val Ser Gln Glu Thr Met Phe Gly Asp
145 150 155
gga aat acc tgt tac aca ttc gac tac act gtg ttt gtg aaa cat tac 531
Gly Asn Thr Cys Tyr Thr Phe Asp Tyr Thr Val Phe Val Lys His Tyr
160 165 170
agg agt ggg gag atc cta cat aca gaa cat agc gtc cta aaa gaa gat 579
Arg Ser Gly Glu Ile Leu His Thr Glu His Ser Val Leu Lys Glu Asp
175 180 185
tgt agc gaa act ctg tgt gag tta aac atc tca gtg tcc acg ctg aat 627
Cys Ser Glu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Ile Ser Val Ser Thr Leu Asn
190 195 200 205
tcc aat tac tgt gtt tca gta gtt gga aag tcg tct ttc tgg caa gtt 675
Ser Asn Tyr Cys Val Ser Val Val Gly Lys Ser Ser Phe Trp Gln Val
210 215 220
aat aca gaa aca tca aaa gac gcc tgt atc ccc ttt ctc cat gat gac 723
Asn Thr Glu Thr Ser Lys Asp Ala Cys Ile Pro Phe Leu His Asp Asp
225 230 235
aga gaa gaa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag 771
Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys
240 245 250
cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc 819
Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
255 260 265
cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc acg 867
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
270 275 280 285
tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc 915
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser
290 295 300
tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca cca 963
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro
305 310 315
gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc 1011
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
320 325 330
ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc 1059
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr
335 340 345
agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa 1107
Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu
350 355 360 365
ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag gaa 1155
Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu
370 375 380
gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc 1203
Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe
385 390 395
tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca cag 1251
Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln
400 405 410
gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt tac 1299
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
415 420 425
ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga 1347
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly
430 435 440 445
aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat 1395
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
450 455 460
actgag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg 1443
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val
465 470 475
cag tgg ttg atg aat acc tgagaattct 1471
Gln Trp Leu Met Asn Thr
480
<210>3
<211>4790
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工表达载体pCAGGS的DNA序列
<400>3
gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 420
atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480
gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540
gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600
tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 660
gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 720
ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 780
gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 840
ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 900
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 960
cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020
ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1080
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc 1140
cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc 1200
gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260
ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct 1320
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1380
gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc 1440
tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500
cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg 1560
acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1620
gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1680
acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgag gaattcactc 1740
ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca 1800
aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg 1860
agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt 1920
ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg 1980
agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg 2040
ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga 2100
aaagccttga cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta 2160
acatccctaa aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta 2220
ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt 2280
ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 2340
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 2400
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagcg 2460
gatccgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc 2520
ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat 2580
gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 2640
ggaggcctag gcttttgcaa aaagctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 2700
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 2760
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ccgctgcatt aatgaatcgg 2820
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 2880
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 2940
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3000
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3060
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3120
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3180
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc 3240
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3300
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3360
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3420
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3480
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3540
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 3600
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 3660
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 3720
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 3780
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 3840
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 3900
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 3960
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 4020
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 4080
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 4140
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 4200
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 4260
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 4320
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 4380
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 4440
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 4500
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 4560
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 4620
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 4680
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 4740
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 4790
<210>4
<211>1233
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1224)
<223>编码大鼠CTLA4，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物
<400>4
gaattcattt aa atg gct tgt ctt gga ctc cag agg tac aaa act cac ctg 51
Met Ala Cys Leu Gly Leu Gln Arg Tyr Lys Thr His Leu
1 5 10
cag ctg cct tct agg act tgg cct ttt gga gtc ctg ctt tct ctt ctc 99
Gln Leu Pro Ser Arg Thr Trp Pro Phe Gly Val Leu Leu Ser Leu Leu
15 20 25
ttc atc cca atc ttc tct gaa gcc ata caa gtg acc caa cct tca gtg 147
Phe Ile Pro Ile Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val
30 35 40 45
gtg ttg gcc agc agc cac ggt gtc gcc agc ttt cca tgt gaa tat gca 195
Val Leu Ala Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ala
50 55 60
tct tca cac aac act gat gag gtc cgg gtg acg gtg ctg cgg cag aca 243
Ser Ser His Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr
65 70 75
aat gac caa gtg aca gag gtc tgt gcc acg aca ttc aca gtg aag aac 291
Asn Asp Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Val Lys Asn
80 85 90
acg ttg ggc ttc cta gat gac ccc ttc tgc agt ggt acc ttt aat gaa 339
Thr Leu Gly Phe Leu Asp Asp Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu
95 100 105
agc aga gtg aac ctc acc atc caa gga ctg agg gct gct gac acc gga 387
Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly
110 115 120 125
ctg tac ttc tgc aag gtg gaa ctc atg tac cca ccg cca tac ttt gtg 435
Leu Tyr Phe Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val
130 135 140
ggc atg ggc aac ggg acc cag att tat gtc atc gat cca gaa cca tgc 483
Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys
145 150 155
cca gat tca gac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc 531
Pro Asp Ser Asp Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys
160 165 170
aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc 579
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
175 180 185
ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag gtc 627
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
190 195 200 205
acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat ttc 675
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe
210 215 220
agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga cca 723
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro
225 230 235
cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc 771
Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
240 245 250
atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc 819
Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val
255 260 265
acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc 867
Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro
270 275 280 285
gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc aag 915
Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys
290 295 300
gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa ggc 963
Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly
305 310 315
ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag cca 1011
Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro
320 325 330
cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg agt 1059
Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser
335 340 345
tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag 1107
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln
350 355 360 365
gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac 1155
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
370 375 380
cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt 1203
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe
385 390 395
gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 1233
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
400
<210>5
<211>1143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1134)
<223>编码大鼠CTLA4，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物
<400>5
gaattcattt aa atg gca ctc tgg gtg act gca gtc ctg gct ctc gct tgc 51
Met Ala Leu Trp Val Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Cys
1 5 10
ctt ggt ggt ctt gcc acc cca ggg cca gtg cgg aga tcc aca tct ccc 99
Leu Gly Gly Leu Ala Thr Pro Gly Pro Val Arg Arg Ser Thr Ser Pro
15 20 25
cct gtg gcc ctc agg gag ctt atc gag gag ctg agc aac atc aca caa 147
Pro Val Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln
30 35 40 45
gac cag aag act tcc ctg tgc aac agc agc atg gta tgg agc gtg gac 195
Asp Gln Lys Thr Ser Leu Cys Asn Ser Ser Met Val Trp Ser Val Asp
50 55 60
ctg aca gct ggc ggg ttc tgt gca gcc ctg gaa tcc ctg acc aac atc 243
Leu Thr Ala Gly Gly Phe Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Thr Asn Ile
65 70 75
tcc agt tgc aat gcc atc cac agg acc cag agg ata ttg aat ggc ctc 291
Ser Ser Cys Asn Ala Ile His Arg Thr Gln Arg Ile Leu Asn Gly Leu
80 85 90
tgt aac caa aag gcc tcg gat gtg gct tcc agc ccc cca gat acc aaa 339
Cys Asn Gln Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Ser Pro Pro Asp Thr Lys
95 100 105
atc gaa gta gcc cag ttt ata tca aaa ctg ctc aat tac tcc aag caa 387
Ile Glu Val Ala Gln Phe Ile Ser Lys Leu Leu Asn Tyr Ser Lys Gln
110 115 120 125
ctt ttc cgc tat ggc cac gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt 435
Leu Phe Arg Tyr Gly His Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly
130 135 140
gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc 483
Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe
145 150 155
atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct 531
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
160 165 170
aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc 579
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
175 180 185
cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act 627
His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
190 195 200 205
cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa 675
Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
210 215 220
ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc 723
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys
225 230 235
aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 771
Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
240 245 250
aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct 819
Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro
255 260 265
acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta 867
Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val
270 275 280 285
aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg 915
Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly
290 295 300
cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat 963
Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp
305 310 315
ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg 1011
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp
320 325 330
cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac 1059
Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
335 340 345
aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa 1107
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln
350 355 360 365
gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 1143
Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
370
<210>6
<211>825
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(816)
<223>编码大鼠信号肽，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物
<400>6
gaattcatttaa atg aag tcc tgc ggc ctg ttc cct ctc atg gtg ctc ctt 51
Met Lys Ser Cys Gly Leu Phe Pro Leu Met Val Leu Leu
1 5 10
gct ctg ggt gta ctg gca ccc tgg agt gtg gaa gga gcg gcc gcc gtg 99
Ala Leu Gly Val Leu Ala Pro Trp Ser Val Glu Gly Ala Ala Ala Val
15 20 25
ccc aga aac tgt gga ggt gat tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca 147
Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser
30 35 40 45
gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc 195
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
50 55 60
acc atc act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc 243
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
65 70 75
cag gac gat ccc gag gtc cat ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa 291
Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
80 85 90
gtc cac aca gct cag act cga cca cca gag gag cag ttc aac agc act 339
Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
95 100 105
ttc cgc tca gtc agt gaa ctc ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat 387
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
110 115 120 125
ggc agg acg ttc aga tgc aag gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc 435
Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro
130 135 140
atc gag aaa acc atc tcc aaa ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat 483
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His
145 150 155
gta tac acc atg tca cct acc aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc 531
Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val
160 165 170
agt atc acc tgc atg gta aaa ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg 579
Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val
175 180 185
gagtgg cag atg aac ggg cag cca cag gaa aac tac aag aac act cca 627
Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro
190 195 200 205
cct acg atg gac aca gat ggg agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat 675
Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn
210 215 220
gtg aag aag gaa aaa tgg cag cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg 723
Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
225 230 235
ctg cat gaa ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agt ctc tcc cac 771
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
240 245 250
tct ccg ggt aaa gcc caa gat ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc 816
Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
255 260 265
tgagaat tc 825
<210>7
<211>1284
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1275)
<223>编码大鼠IL1受体拮抗剂，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入
物
<400>7
gaattcatttaa atg gaa atc tgc tgg gga ccc tac agt cac cta atc tct 51
Met Glu Ile Cys Trp Gly Pro Tyr Ser His Leu Ile Ser
1 5 10
ctc ctt ctc atc ctt ctg ttt cat tca gag gca gcc tgc cgc cct tct 99
Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe His Ser Glu Ala Ala Cys Arg Pro Ser
15 20 25
ggg aaa aga ccc tgc aag atg caa gcc ttc aga atc tgg gat act aac 147
Gly Lys Arg Pro Cys Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Thr Asn
30 35 40 45
cag aag acc ttt tac ctg aga aac aac cag ctc att gct ggg tac tta 195
Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Leu
50 55 60
caa gga cca aat atc aaa cta gaa gaa aag ata gac atg gtg cct att 243
Gln Gly Pro Asn Ile Lys Leu Glu Glu Lys Ile Asp Met Val Pro Ile
65 70 75
gac ctt cat agt gtg ttc ttg ggc atc cac ggg ggc aag ctg tgc ctg 291
Asp Leu His Ser Val Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Leu Cys Leu
80 85 90
tct tgt gcc aag tct gga gat gat atc aag ctc cag ctg gag gaa gtt 339
Ser Cys Ala Lys Ser Gly Asp Asp Ile Lys Leu Gln Leu Glu Glu Val
95 100 105
aac atc act gat ctg agc aag aac aaa gaa gaa gac aag cgc ttt acc 387
Asn Ile Thr Asp Leu Ser Lys Asn Lys Glu Glu Asp Lys Arg Phe Thr
110 115 120 125
ttc atc cgc tct gag aaa ggc ccc acc acc agc ttt gag tca gct gcc 435
Phe Ile Arg Ser Glu Lys Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala
130 135 140
tgt cca gga tgg ttc ctc tgc aca aca cta gag gct gac cgt cct gtg 483
Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Thr Leu Glu Ala Asp Arg Pro Val
145 150 155
agc ctc acc aac aca ccg gaa gag ccc ctt ata gtc acg aag ttc tac 531
Ser Leu Thr Asn Thr Pro Glu Glu Pro Leu Ile Val Thr Lys Phe Tyr
160 165 170
ttc cag gaa gac caa gcg gcc gcc gtg ccc aga aac tgt gga ggt gat 579
Phe Gln Glu Asp Gln Ala Ala Ala Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp
175 180 185
tgc aag cct tgt ata tgt aca ggc tca gaa gta tca tct gtc ttc atc 627
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
190 195 200 205
ttc ccc cca aag ccc aaa gat gtg ctc acc atc act ctg act cct aag 675
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
210 215 220
gtc acg tgt gtt gtg gta gac att agc cag gac gat ccc gag gtc cat 723
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His
225 230 235
ttc agc tgg ttt gta gat gac gtg gaa gtc cac aca gct cag act cga 771
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg
240 245 250
cca cca gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctc 819
Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
255 260 265
ccc atc ctg cac cag gac tgg ctc aat ggc agg acg ttc aga tgc aag 867
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys
270 275 280 285
gtc acc agt gca gct ttc cca tcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 915
Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
290 295 300
ccc gaa ggc aga aca caa gtt ccg cat gta tac acc atg tca cct acc 963
Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr
305 310 315
aag gaa gag atg acc cag aat gaa gtc agt atc acc tgc atg gta aaa 1011
Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys
320 325 330
ggc ttc tat ccc cca gac att tat gtg gag tgg cag atg aac ggg cag l059
Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln
335 340 345
cca cag gaa aac tac aag aac act cca cct acg atg gac aca gat ggg 1107
Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly
350 355 360 365
agt tac ttc ctc tac agc aag ctc aat gtg aag aag gaa aaa tgg cag 1155
Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln
370 375 380
cag gga aac acg ttc acg tgt tct gtg ctg cat gaa ggc ctg cac aac 1203
Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
385 390 395
cac cat act gag aag agt ctc tcc cac tct ccg ggt aaa gcc caa gat 1251
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ala Gln Asp
400 405 410
ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 1284
Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
415 420
<210>8
<211>369
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(360)
<223>编码人IL8和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物
<400>8
gaattcattt aa atg act tcc aag ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc 51
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe
1 5 10
ctg att tct gca gct ctg tgt gaa ggt gca gtt ttg cca agg agt gct 99
Leu Ile Ser Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala
15 20 25
aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac 147
Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His
30 35 40 45
ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca cac tgc 195
Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys
50 55 60
gcc aac aca gaa att att gta aag ctt tct gat gga aga gag ctc tgt 243
Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys
65 70 75
ctg gac ccc aag gaa aac tgg gtg cag agg gtt gtg gag aag ttt ttg 291
Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu
80 85 90
aag agg gct gag aat tca gcg gcc gcc ccg ggt aaa gcc caa gat ttt 339
Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Ala Ala Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe
95 100 105
gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 369
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
110 115
<210>9
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>9
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg 45
<210>10
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>10
tcaaccactg cacaaaatct tgggctttac ccggagagtg ggagagact 49
<210>11
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>11
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg 45
<210>12
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>12
gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc 50
<210>13
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>13
gagaattcat ttaaatgatt ctgctggtgg tcctgatg 38
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>14
gcagcatcgcggccgcttct tctctgtcat catggagaaa 40
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>15
gagaattcatttaaatggct tgtcttggac tccagagg 38
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>16
gcagcatcgc ggccgcgtct gaatctgggc atggttctgg 40
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>17
gagaattcat ttaaatggca ctctgggtga ctgcagtc 38
<210>18
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>18
gcagcatcgc ggccgcgtgg ccatagcgga aaagttgctt 40
<210>19
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>19
gagaattcat ttaaatggaa atctgctggg gaccctac 38
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>20
gcagcatcgc ggccgcttgg tcttcctgga agtagaactt 40
<210>21
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>21
gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccc cgggtaaagc ccaagatttt gtgcagtggt 60
tg 62
<210>22
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>22
gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc 50
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>23
gagaattcat ttaaatgact tccaagctgg ccgtggct 38
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物
<400>24
gcagcatcgc ggccgctgaa ttctcagccc tcttcaaaaa 40