技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体适用于一种消除畜禽粪便、农作物秸秆 等农业废弃物臭气的一种农业废弃物除臭菌剂及其产品的制备方法。
背景技术
随着现代农业的快速发展，特别是畜牧业的规模化、集约化生产，导致大 量畜禽粪便等农业废弃物的大规模集中弃置；同时由于城市化的发展趋势加 速，城市生活垃圾的产生量惊人，农业废弃物和生活垃圾中有机成分比例很高， 组成复杂。这些有机废弃物中含有大量的致病微生物和寄生虫卵，在弃置过程 中会产生大量的恶臭气体，主要包括氨气、硫化氢、吲哚、硫醇、硫醚、甲醛、 乙醛、丙烯醛、甲胺、乙胺、苯酚、硫酚及挥发性脂肪酸等，对人类生存环境 造成污染，严重危害了城乡居民的身体健康。为了有效解决这一问题，国内外 有许多除臭菌剂产品问世，主要以化学除臭菌剂居多，主要是pH调节剂、氧 化剂或杀菌剂；也有部分微生物除臭菌剂，如酵素菌和EM菌剂，这些产品不 同程度的缓解了有机废弃物的臭味的产生，但效果不太理想，没有被市场所接 受。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明的目的是提供一种成本低，使用方 便，无污染环境、无毒副作用，除臭菌剂对消除农业废弃物产生的恶臭气体具 有显著的作用，可以减少H2S和NH3的释放量的一种农业废弃物除臭菌剂。
本发明的另一目的是提供一种农业废弃物除臭菌剂产品的制备方法。
本发明所述的一种农业废弃物除臭菌剂是由于下列微生物：巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)CGMCC：1.223、细黄连霉菌(Streptomyces microflavus)CGMCC：4.891、康宁木霉(Trichoderma koningii)CGMCC：3.2774， 按质量份数比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5。
上述三种微生物公众可以在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心购买。
一种农业废弃物除臭菌剂所采用的技术方案是按下列步骤来实现的：
1.生产工艺流程图(见图1)；
2.培养基：
2.1马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g， 15磅30min灭菌；
2.2高氏淀粉琼脂培养基：硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g， 氯化钠0.5g，硫酸亚铁10mg，可溶性淀粉20g，琼脂20g，凉开水1000mg，PH7.2～ 7.4，8磅30min灭菌；
2.3营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉提取物3.0g，氯化钠10g， 琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH7.0，15磅30min灭菌；
2.4载体培养基：沸石50％，麸皮20％，骨粉14％，鱼粉14％，红糖2 ％；
3.将本发明所用的三种微生物菌株分别接种于马铃薯琼脂培养基、高氏 淀粉琼脂培养基和营养肉汁琼脂培养基三种培养基上进行一级培养；然后分别 接种于上述三种培养基的液体培养基(不加琼脂)中，进行液体二级扩大培养， 就制备出三种组成微生物菌株的液体菌剂。
4.将上述三种微生物纯菌剂以1∶1∶1的比例共同接种于载体培养基中， 接种量为0.2％，控制培养基水分含量在55-60％，在28-34℃条件下培养7 天；
5.将上述经过培养的复合菌剂再进行35-45℃干燥处理，作活菌检验符合 中华人民共和国农业行业标准化NY 335-1998后就成为本发明产品。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.本发明的微生物复合除臭菌剂能够有效增加农业废弃物在发酵过程中 的微生物数量，迅速提高发酵体的温度，降低农业废弃物的臭气，从而促进农业 废弃物的腐解速度。
2.加入本发明的微生物复合除臭菌剂除臭效果。
3.该微生物复合除臭菌剂无污染环境、无毒副作用。
4.使用本发明的微生物复合除臭菌剂，在发酵过程中保持比其它处理低 的NH4+-N浓度和其它处理高的NO3-N浓度，有利于降低臭味和增加氮素保留率。
附图说明
图1复合微生物菌剂制备工艺图；
图2固体发酵料的温度变化(℃)图；
图3不同处理堆肥发酵脱臭效果比较图；
图4不同处理在不同时间的氨气释放浓度图；
图5不同处理在不同时间的H2S释放浓度图；
图6不同处理堆肥发酵过程的温度变化图；
图7各处理在堆肥发酵过程中的PH值变化图；
图8不同处理堆料的NH4+-N含量随堆肥时间的变化图；
图9不同处理堆料的NO3--N含量随堆肥时间的变化图；
图10不同处理堆制发酵各时期的大肠菌群数变化图。
具体实施方式
结合说明书附图，下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明，但本发 明不局限于以下实施例。
实施例1一种农业废弃物除臭菌剂
由巨大芽孢杆菌、细黄连霉菌、康宁木霉组成，上述所说的三种微生物的 质量份数比为0.5～1.5∶0.5～1.5∶0.5～1.5。
实施例2制备实施例1所述农业废弃物除的臭菌剂的方法
1.制备培养基
1.1马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g， 15磅30min灭菌。
1.2高氏淀粉琼脂培养基：硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g， 氯化钠0.5g，硫酸亚铁10mg，可溶性淀粉20g，琼脂20g，凉开水1000mg，PH7.2～ 7.4，8磅30min灭菌。
1.3营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉提取物3.0g，氯化钠10g， 琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH7.0，15磅30min灭菌。
1.4载体培养基：沸石50％，麸皮20％，骨粉14％，鱼粉14％，红糖2 ％。
3.从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买细黄连霉菌、普 通高温放线菌、康氏木霉三种各1管，将上述三种微生物菌株分别通过试管斜 面培养、液体种子培养和三级扩大培养，制备出三种菌株的纯菌剂。
4.将上述三种微生物纯菌剂以0.5∶1∶1.5的比例共同接种于载体培养基 中，接种量为0.2％，控制培养基水分含量在58％，在32℃条件下培养7天。
5.将上述经过培养的复合菌剂再进行35-45℃干燥处理，作活菌检验符合 中华人民共和国农业行业标准化NY 335-1998后就成为本发明产品。
实施例3一种农业废弃物除臭菌剂
由巨大芽孢杆菌、细黄连霉菌、康宁木霉按重量百分比1∶1∶1组成。
实验例4制备实施例3所述的农业废弃物臭菌剂的方法同实施例1。
实施例5一种农业废弃物除臭菌剂
由巨大芽孢杆菌、细黄连霉菌、康宁木霉按重量百分比1.5∶1∶0.5组成。
实施例6制备实施例5所述的农业废弃物臭菌剂的方法同实施例1。
实验例1除臭效果实验
1试验材料与方法
1.1培养基
牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号合成培养基，查氏合成培养基，酵母膏 蛋白胨培养基。
1.2土壤样品
鸡粪堆下面的土壤，麦草堆下面的土壤
表1堆肥材料的主要成分 材料 水分(％) 有机碳(％) 全氮(％) 碳氮比 鸡粪 麦草 71 13.5 30.146 39.9 2.338 0.65 14.0 66.5
1.3实验设计
腐解材料
本实验以麦草为堆肥基质，用鸡粪作堆肥发酵的调理剂，麦草铡成3cm长。
固体发酵罐的规格
发酵罐高150cm、内径80cm、外径90cm，底部有进气口，上部为出口，内 外夹层为隔热材料，可以在线监测温度变化与耗氧率。
实验处理
将一定量的麦草和鸡粪混合均匀，调整两者比例，使混合物的碳氮比C/N为31∶1，加水使混合料含水量为65％，实验设三个处理，即：
处理1：为对照(CK)，不加任何微生物菌剂；
处理2：加入其它厂制备好的复合微生物菌剂CM1，CM1加入量为1∶100 (W/V)。
处理3：加入实施列1制备好的复合微生物菌剂CM2，CM2加入量为1∶100 (W/V)。
1.4实验测定
测定除臭效果采用感官感觉法对固体发酵料的气味进行测定(评判)。
测定温度变化用ZDR-11固态温度记录议连续测定温度变化并记录。
耗氧速率用BY-84H型O2测定仪测定含氧量。以最大供氧速率[1L/ (min·kg)]供氧20min，使出口含氧量在20％以上，然后关闭供氧阀门，测 定氧随时间变化率，既为耗氧速度。
测定微生物群体动态变化(CFU)
采用微生物纯培养法测定固体发酵料中各种微生物的CFU变化规律。
化学指标(C/N)
水溶性碳采用重铬酸钾容量法-外加热法；全氮采用H2SO4-水扬酸一混合 盐消煮法；铵态氮(NH4+-N)采用碱解扩散法。
种子发芽指数(GI)
取发酵料新鲜样品按水肥比5∶1浸提，吸取5ml 浸提液置于垫有滤纸 的培养皿中，同时设置对照(蒸馏水)，每个培养皿内放10粒饱满的小麦种子， 在20℃恒温培养24小时，承担发芽率和根长，计算GI。GI由以下公式确定：
GI(％)＝[(堆肥浸提液的种子发芽率*种子根长)/(蒸馏水的种子发芽 率*种子的根长)]*100
1.5结果与讨论
气味
表2固体发酵料的气味变化 腐解时间(天) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK CM1 CM2 +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + ++ + + ++ - - + - - + - - + - - + - - + - -
注：“-”不臭；“+”微臭；“++”较臭；“+++”很臭
从表2可以发现，加入微生物复合菌剂后，经过5天的发酵就使发酵料不 产生臭味，而对照物经过10天的发酵仍然具有微臭，说明微生物复合菌剂的 除臭效果明显。
综前所述，微生物复合菌剂CM1和CM2能够有效增加麦草和鸡粪在固体发 酵过程中的微生物数量，迅速提高发酵体的温度，降低鸡粪的臭气，从而促进麦 草和鸡粪的腐解速度。
实验例2除臭效果实验
1.材料与方法
菌株分离培养基牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号、察氏培养基、豆芽汁 蔗糖培养基、好气性纤维素分解菌培养基；分离能快速利用硫醇化合物的微生 物培养基。
试验原料鸡粪取自西北农林科技大学试验农场鸡场的当日新鲜粪；小麦 秸秆为本校农场当年产的风干麦草；发酵菌曲为细黄连霉菌；除臭菌剂为用本 发明的产品。
表6试验原料基本成分 原料 含水率(％) 氮(g·kg-1) 碳(g·kg-1) 碳氮比/(C/N) 鸡粪 麦草 72.3 10.5 32.6 6.27 218.4 453.3 6.7 72.3
1.2方法
将除臭菌剂实施例1制备好的作为本试验的。
试验设计
(1)发酵罐规格发酵罐为立式圆柱型，直径100cm，高150cm。
(2)试验处理设3个处理即三组发酵罐同时堆肥，处理I(CK)为： 鸡粪+麦草，处理II为：鸡粪+麦草+发酵菌曲，处理III为：鸡粪+麦草+除臭菌 剂。所有处理均用麦草调节混合料的C/N，使C/N为31∶1。加水使混合料含 水量为65％。
(3)堆制发酵方法发酵罐底部和上部留孔，自然通风静态发酵。
采样及测定
(1)采样时间及部位装入发酵罐当天及第3、5、7、10、15、20、25、 30、35天同部位各采样1次。采样部位为料面以下50cm。
(2)臭味指标测定采用六级分类法划分气体臭度，在每次采样时记录。
Ms0：无臭味；Ms1：勉强感觉到臭味；Ms2：微弱的臭味；Ms3：明显的臭味； Ms4：很强的臭味；Ms5：难以忍受的臭味。
(3)氨气和硫化氧气体测定用GS-3型大气采样机按照采样时间采集空 气样，以硼酸吸收凯氏法测定氨气的量，用锌铵络盐吸收比色法测定硫化氢的 量。
(4)温度用TDR-21型温度自动记录仪设定每隔1小时自动记录 料面以下50cm处的温度。
(5)微生物学指标的测定细菌总数采用平板倾注混合法；真菌总数采用 平板计数法；放线菌总数采用平板计数法；大肠菌群数采用乳糖发酵法。
(6)化学指标的测定有机质采用灼烧减重法；pH用pH值计测试；氧化镁 蒸馏法测定NH4+-N；紫外法测定NO3--N；原子吸收分光光度法测定全磷和全钾。
1.3结果分析
脱臭效果
人工嗅觉六级分类测定各处理的脱臭效果见图3：
从图3中看出，处理II和处理III均在第3天达到了Ms5级，处理III第5天 臭味开始减弱，处理II还处在最臭阶段，处理III在第15天即无臭味，处理II 在20天时无臭味，处理I(CK)臭味持续时间最长，在第7天时还处在最臭 阶段，到35天时才没有臭味；加入除臭菌剂的处理III能够比处理II和处理I (CK)更快地达到堆肥无臭化，处理III比处理II、处理I(CK)分别提早5天 和20天消除臭味；处理III在MS4级以上臭度的停留时间比处理II、处理I(CK) 分别短3天和13天。说明加入除臭菌剂后有更好的脱臭效果。
各处理对氨气的释放影响
氨气、硫化氢、硫醇和甲硫醇等是粪便堆制期臭气的主要成分。由图4看 出，各处理氨气的释放在发酵前期都有短期的释放增加期，时间长短因处理不 同而有差异，加入除臭菌剂的处理III的增加期是0～3d，加入发酵菌剂的是处 理II和处理I(CK)的释放增加期在0-5天。整个发酵过程氨气释放浓度顺 序是处理I(CK)＞处理II＞处理III，陈书安等研究认为要降低氨气释放量， 时间应选择在0-15d内，且越早除臭效果越好，加入除臭菌剂的处理III在0 -10d内氨气释放平均浓度比处理II和处理I(CK)分别下降了21％和46％，可 以减少臭味的产生。
各处理对硫化氢的释放效果
H2S作为降低堆放臭气的主要目标气体之一，要达到理想除臭效果，需在 10d之内控制H2S的释放，由图5得知，处理III和处理II同处理I(CK)的H2S的释放期基本一致，但处理III和处理II的释放浓度均低于处理I(CK)，在0 -10d处理III的H2S的释放量减少速率最大，因此，加入除臭菌剂的处理III表 现出了对H2S的释放具有短时期、低浓度的效果。
除臭菌剂对堆肥过程的影响
堆肥过程的温度变化参见图6，处理III在第3天温度即上升到60℃以上， 处理II也在第4天至第5天温度达到60℃，处理III表现了较处理II、处理I(CK) 升温快的特点。处理II的最高温度比处理III的最高温度高1.5℃，但处理III在 60℃以上的持续时间比处理II在60℃以上的持续时间长4天。维持3天以上的 60℃高温，更有利于有效杀灭致病菌，同时有利于破坏大分子物质，使堆料达 到更好的腐熟度。处理III有10天60℃以上的高温期，将对堆料物质转化和堆 料无害化处理产生积极作用。
微生物菌群变化见表7。
表7不同时期各类微生物数量变化 采样时间 细菌总数 放线菌总数 真菌总数 处理I 处理II 处理III 处理I 处理II 处理III 处理I 处理II 处理III 0 1 3 5 7 10 15 20 25 30 35 10.21 11.09 10.43 9.21 8.86 8.04 7.43 6.62 6.77 7.03 7.21 10.83 11.40 10.76 10.32 9.68 9.42 9.07 9.83 9.86 9.23 9.34 10.62 11.73 10.94 10.66 9.23 9.11 9.05 9.24 9.26 9.56 9.03 7.64 7.68 8.23 8.32 8.11 8.04 8.15 8.13 7.56 7.32 7.18 7.92 8.15 8.34 8.56 8.46 8.12 8.10 8.28 7.94 7.85 7.63 7.87 8.24 8.65 8.71 8.52 8.38 8.24 8.18 8.09 8.03 7.81 8.32 8.61 8.26 7.84 6.97 7.12 7.08 6.84 6.72 7.16 7.14 8.54 9.06 8.41 8.09 7.57 6.21 6.36 6.94 7.11 7.23 7.34 8.39 9.17 8.86 8.41 8.06 6.89 6.84 6.65 6.94 7.18 7.31
注：表中数字是微生物总数(个·g-1堆料)的对数值。
从表7可看出，三种处理中不同类型微生物数量不同，发酵开始时，各处 理中微生物数量最多的是细菌，其次是真菌和放线菌。在发酵的第1天，所有 微生物数量迅速增加，但可看出在料温较高时期(3-15d)，微生物数量呈下 降趋势。之后随着料温的下降，微生物数量有所回升，但已达不到开始堆肥时 微生物的水平。在发酵过程中，无论是中温阶段还是高温阶段，细菌的数量总 v是最大。在发酵过程中，细菌是优势菌群，对发酵升温有较大的作用，放线菌 在高温阶段较活跃，利用尚未分解的难降解的有机物，进行生长繁殖，数量逐 渐增加，是这个阶段分解有机物的主要菌群，加入除臭菌剂的处理III，在升温 阶段的细菌数量最大，方差分析显示与处理I(CK)，处理II间的差异显著(P ＜0.05)，达到了最快的升温效果；在高温阶段，各处理的放线菌数量均高于 升温前及降温后的数量，这一阶段处理III的放线菌数量大于处理I(CK)和处 理II的数量，对保持持续高温起到积极作用，且各处理间的差异显著(P＜ 0.05)。
发酵过程的pH值变化
试验的pH值变化如图7所示，三种处理的PH值随时间变化的基本趋势相 同，随着发酵过程的进行，在初期微生物大量繁殖，分解蛋白质类有机物，产 生氨氮，促使pH值回升，随着蛋白质有机物进一步降解，氨态氮在硝化细菌 的作用下转化为硝态氮，pH值逐步回落，三种处理的pH值在发酵结束时维持 在6.4-7.1之间。
据胡佩研究，家粪便pH值在7～8之间，除臭效果良好，pH值低于6或高 于8.5均达不到除臭的目的。加入除臭菌剂的处理III和加入发酵菌曲的处理 II的pH值范围均在这一区域，且处理III的PH值的波动小于处理II和处理I (CK)更有利于除臭和物质降解。
氮类物质的变化
畜禽粪中含有许多氮类物质，在堆肥过程中，它们被快速降解为NH4+-N。 部分NH4+-N进一步被微生物转化为NO3--N和有机态氮，大部分来不及被转化的 NH4+-N在pH＞7的环境中以气态挥发。这不仅是堆肥中N的主要损失途径，也是 畜禽堆肥的主要致臭原因。控制堆肥过程中氮类物质以NH4+-N形式积累是臭味 控制和提高N养分保留率的关键所在[22]。
由图8、图9看出，各处理NH4+-N的含量在0-3天有所上升，随之持续 降低，由于大量硝化菌和反硝化菌的存在，有机氮矿化的NH4+-N由硝化菌转化 成NO3--N含量迅速提高。部分NO3--N又被反硝化成N2气体，或由真菌作用被固 定为微生物氮，使NO3--N含量有所降低。本实验中，在3d以后，各处理的NH4+-N含量逐渐降低，减少了碱性条件下NH3的挥发浓度，各时期NH4+-N浓度顺序为 处理III＜处理II＜处理I(CK)，表明处理III能达到更好的除臭效果。在发酵 终了时的NO3--N含量，以处理III的最高，处理II次之，处理I(CK)最低，说 明了加入除臭菌剂的处理III有更优的氮素保留率。
1.2.2.3除臭菌剂对堆肥质量的影响
堆制发酵前后的养分含量变化
发酵前后三种处理的有机质、总氮、全磷、全钾均增加，有机质、全氮增 幅最大的是加入除臭菌剂的处理III，其增幅分别为18.6％和14.6％，其次为处理 II，增幅分别为16.2％和13.2％，处理I(CK)增幅最小，且三种处理间的增幅 差异显著。不同处理的全磷、全钾增幅最大的为处理II，其次为处理III，处理 I(CK)增幅最小，处理II和处理III的全磷、全钾同处理I(CK)增幅差异显 著，但处理II、处理III间的差异不显著，因此，处理III对发酵后养分的增加， 表现出了综合优势。
表8不同处理堆制发酵前后的养分变化(单位：g·kg-1) 有机质 总氮 全磷/P2O5 全钾K2O 发酵前 发酵后 增减幅 度/％ 发酵前 发酵后 增减幅 度/％ 发酵前 发酵后 增减幅 度/％ 发酵前 发酵后 增减幅 度/％ 处理I 处理II 处理III 496.3 484.7 487.2 564.3 563.2 577.8 +13.7a +16.2b +18.6c 23.4 23.8 23.6 26.0 26.9 27.0 +11.3a +13.2b +14.6c 18.3 18.9 18.7 20.5 22.0 21.6 +12.1a +16.4b +15.6b 9.3 9.5 9.1 10.1 10.4 9.9 +8.7a +10.1b +9.4b
堆肥的卫生学指标
如图8所示，随着发酵进程的延长，大肠菌群逐步下降，由堆肥初期的105个/克发酵料的数量级下降到102个/克，发酵料以下的数量级。加入发酵菌曲 的处理II和加入除臭菌剂的处理III在15天时，大肠菌群数量已降至102/克发 酵料的数量级，符合粪便无害化标准，处理III由于在高温期持续的时间长，发 酵结束时大肠菌君数量最少，为3个/克发酵料，表现出更优的肥料完全性。
1.4结论
(1)加入脱臭菌剂的处理III有较好的除臭效果，比处理I(CK)提早20 天消除臭味，MS4级以上臭度停留时间分别处理II和处理I(CK)短3天和13 天，处理III在0～10d内氨气释放平均浓度比处理II和处理I(CK)分别下降 21％和46％。
(2)处理II处理III在堆肥过程中的温度变及堆肥结束后的卫生总指标符 合粪便无害化标准，处理III比处理II有更大的温度优势(60℃以上温度保持多 4天)；处理III在发酵过程中保持比其它处理低的NH4+-N浓度和其它处理高的 NO3--N浓度，有利于降低臭味和增加氮素保留率。处理III发酵前后的有机质和 总氮增幅最大与处理II和处理I(CK)的差异显著，全磷、全钾增幅也较处理 I(CK)有显著的差异。