获得油菜早代稳定系的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102428869 B (45)授权公告日 2012.12.26 CN 102428869 B *CN102428869B* (21)申请号 201110283114.8 (22)申请日 2011.09.22 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 成都市农林科学院 地址 611130 四川省成都市温江区柳城镇东 北路 559 号 (72)发明人 付绍红 张汝全 杨进 李云 王继胜 陈晓华 邹琼 陶兰蓉 康泽民 唐蓉 (74)专利代理机构 成都立信专利事务所有限公 司 51100 代理人 江晓萍 (54) 发明名称 获得油菜早代稳定系的方法 (57) 。

2、摘要 本发明获得油菜早代稳定系的方法， 包括 1） 将两个遗传背景不同的油菜材料进行人工去雄杂 交获得 F1代杂交种子 ； 2） 将 F1代杂交种子在培养 基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍 ； 3） 对加倍后的 F1代单株进行染色体鉴定 ； 4） 加倍 后的 F1代植株进行自交或强制自交获得 F2代 ； 5） F2代进行田间种植观察， 并鉴定每个单株的育性， 选择可育后代自交获得 F3代 ； 6） 对 F3代进行纯合 度鉴定， 说明这些株系是纯合系 ； 通过以上方式 可以在 F2代获得稳定的纯合系 - 早代稳定系。 本发明方法能提高油菜新品系或新品种纯合的速 度， 提高育种效率， 快速。

3、选育优良保持系、 恢复系 及常规油菜品种。 (51)Int.Cl. 审查员 李安 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 获得油菜早代稳定系的方法， 该方法包括以下步骤 ： 1） 将两个遗传背景不同的油菜材料进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子 ； 2） 将 F1代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 必须确保加 倍成功， 加倍是部分或全部染色体加倍， 即对加倍后的 F1代单株进行染色体鉴定， 通过染色 体数目、 形态鉴定加倍效果 ； 3。

4、） 加倍后的 F1代植株进行自交或强制自交获得 F2代 ； 4） 对 F2代进行田间种植观察， 并鉴定每个单株的育性， 选择可育后代自交获得 F3代 ； 5） 对 F3代进行纯合度鉴定， 通过形态、 细胞学以及分子标记鉴定， 对后代 DNA 进行聚合 酶链反应扩增， 电泳观察每个特异引物扩增下单株的 DNA 带型及条带数目， 显示每个单株 都是两个亲本的杂交后代， 每个单株之间分子标记图谱一致， 说明这些单株是纯合系 早代稳定系 ； 通过以上方式可以在 F2代获得稳定的纯合系早代稳定系， 上述的将 F1代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体 方法如下 ： 1） 用纯度为。

5、 75% 酒精进行种子表面消毒 2540 秒， 用 0.1% 升汞消毒 1217 分钟， 然 后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接 种在第一培养基上 ； 2)让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件 ： 温度2325， 白天光照1216小时， 光照强度 20003000 勒克斯， 夜晚暗培养 812 小时， 待植株长到 12 片真叶时， 从下胚 轴处剪下植株继续在第二培养基上生长 ； 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植株转 入第三培养基中进行生根培养 ； 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植。

6、株在室温炼苗 37 天， 取出植株将植 株上的培养基用自来水冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡 1530 分钟后移栽到温室中， 温 室温度 1625， 相对湿度 6080%， 能保证移栽成活率在 95% 以上 ； 上述的第一培养基由以下配比的组分组成 ： MS 培养基 1L 6- 苄基腺嘌呤 0.51.5mg 染色体加倍诱导剂 3070mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第一培养基的 pH=5.86.0， 上述的第二培养基由以下配比的组分组成 ： MS 培养基 1L 6- 苄基腺嘌呤 0.51mg 染色体加倍诱导剂 2040mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第二培养基的 pH=5.。

7、86.0， 权 利 要 求 书 CN 102428869 B 2 2/2 页 3 上述的第三培养基由以下配比的组分组成 ： MS 培养基 1L - 萘乙酸 0.030.5mg 染色体加倍诱导剂 520mg 蔗糖 2030g 琼脂 810g， 第三培养基的 pH=5.86.0， 上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成 ： 水 1L 易保或克露 0.61.2g - 萘乙酸 0.51mg。 2. 如权利要求 1 所述的获得油菜早代稳定系的方法， 其特征在于染色体加倍诱导剂采 用秋水仙素、 氟乐灵、 氨磺乐灵中的至少一种。 权 利 要 求 书 CN 102428869 B 3 1/8 页 4 获得油菜。

8、早代稳定系的方法 0001 技术领域 ： 0002 本发明与农业有关， 特别与获得油菜早代稳定系的方法有关。 0003 背景技术 ： 0004 油菜新品种选育时间较长， 正常情况下通过常规的人工杂交选育一个常规油菜品 种需要67代的时间， 选育杂交品种时间更长。 常规油菜新品系选育是通过两个遗传背景 不同的品系杂交形成 F1代， F1代自交形成 F2代， F2代再选择优良单株自交形成 F3代， F3代 再选单株自交， 一直到 F6 F7代才能获得稳定的油菜新品系， 以 1 年 1 代计算， 所花时间大 概在 78 年的时间， 通过异地加代也需要 4 年左右的时间。另外， 可以在 F1代对油菜花。

9、粉 进行小孢子离体培养， 然后对培养后代进行人工染色体加倍获得稳定的单双倍体 （doubled haploid ,DH 系） 纯合系。该方法能有效缩短纯合系选育的时间， 但该方法对易于小孢 子离体培养的材料很有效， 对于其他的不易于小孢子培养的材料而言只能通过常规自交的 方式来获得稳定的纯合系， 并且该方法投入的人力物力较大。 对于远缘杂交或种间杂交， 由 于染色体数目不同， 获得稳定的纯合系， 难度较大， 不管是通过常规杂交的形式还是小孢子 离体培养的方式都难以获得稳定的纯合系。 0005 目前， 在油菜中还未出现过早代稳定系的报道。 所谓早代稳定是指 ： 两个不同遗传 背景的植株杂交后在F。

10、2或F3代获得稳定纯合的株系， 该株系遗传背景一致， 能稳定遗传， 即 植株在杂交后代的前两代就遗传稳定， 不再发生性状分离。 目前， 水稻中有过早代稳定系的 报道， 主要是通过二倍体植株与三倍体植株杂交， 在杂交后代中自交选育而来的， 其遗传及 生物学机理还不明确。 但该方法获得早代稳定系的效率较低， 首先三倍体水稻不易获得， 其 次三倍体与二倍体不易获得杂交后代种子。 0006 发明目的 ： 0007 本发明的目的是为了克服以上不足， 提供一种能提高油菜新品系或新品种纯合的 速度， 提高育种效率， 选育优良保持系、 恢复系及常规油菜品种， 获得油菜早代稳定系的方 法。 0008 本发明的目。

11、的是这样来实现的 ： 0009 本发明获得油菜早代稳定系的方法， 该方法包括以下步骤 ： 0010 1） 、 将两个遗传背景不同的油菜材料 （可以是常规油菜品系、 油菜近缘属种、 油菜 种间材料） 进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子， 获得的杂交种子的数目要比较多 ； 0011 2） 、 将 F1代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍， 必须 确保加倍成功， 加倍可以是部分或全部染色体加倍 （如甘蓝型油菜染色体 38 条， 加倍后染 色体为 6076 条） ， 但不能是嵌合体 （嵌合体是指 ： 部分细胞染色体加倍， 其余细胞染色体 未加倍） ； 0012 3） 、 对加倍后。

12、的 F1代单株进行染色体鉴定， 通过染色体数目 （根尖或幼嫩的花药， 在显微镜下观察染色体数目， 染色体数目较正常植株多， 多一倍或多 10 条以上） 、 株叶形态 鉴定加倍结果 （叶片较正常植株更厚、 花器官更大、 植株整体较正常植株大等） ； 0013 4） 、 加倍后的 F1代植株进行自交或强制自交获得 F2代 ； 说 明 书 CN 102428869 B 4 2/8 页 5 0014 5） 、 对 F2代进行田间种植观察， 并鉴定每个单株的育性 （通过醋酸洋红对花粉染 色， 判断花粉育性） 选择可育后代自交获得 F3代 ； 0015 6） 、 对 F3代株系进行纯合度鉴定， 通过形态 。

13、（每个单株的生长发育的整齐度， 叶色、 叶型、 植株高度、 花器官大小、 育性等） 、 细胞学 （染色体的形态、 染色体的数目） 以及分子标 记进行鉴定 （用两个杂交亲本材料的特异 SSR(simple sequence repeat, 即简单重复序 列 , 微卫星标记 ) 引物或其他特异分子标记引物， 对后代进行聚合酶链反应 （或 PCR 反应， Polymerase chain reaction） ， 电泳观察每个特异引物扩增下单株 DNA 的带型及条带数 目） ， 显示每个单株都是两个亲本的杂交后代， 每个单株之间分子标记图谱一致， 说明这些 单株是纯合系 早代稳定系 ； 0016 通过。

14、以上方式可以在 F2代获得稳定的纯合系 早代稳定系。 0017 上述的方法中将 F1代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体 加倍的具体方法如下 ： 0018 1） 用纯度为 75% 酒精进行种子表面消毒 2540 秒， 用 0.1% 升汞消毒 1217 分 钟， 然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种 子接种在第一培养基 （染色体加倍诱导培养基） 上 ； 0019 2) 让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件 ： 温度 2325， 白天光照 1216 小时， 光照强度 20003000 勒克斯， 夜间暗培养 812 小时， 待长到 12。

15、 片真叶时， 从下 胚轴将植株剪下继续在第二培养基 （分化培养基） 上生长 ； 0020 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养 ； 0021 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根， 将植株在室温炼苗 37 天后， 取出植株 将植株上的培养基用自来水冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡 1530 分钟后移栽到温室 中， 温室温度 1625， 相对湿度 6080%， 能保证移栽成活率在 95% 以上 ； 0022 上述的第一培养基由以下配比的组分组成 ： 0023 MS 培养基 1L 0024 6- 苄基腺。

16、嘌呤 （6BA） 0.51.5mg 0025 染色体加倍诱导剂 3070mg 0026 蔗糖 2030g 0027 琼脂 810g， 0028 第一培养基的 pH=5.86.0， 0029 MS 培养基由 Murashige 和 Skoog 发明， 简写为 MS， MS 培养基可在市场上买到。 0030 上述的第二培养基由以下配比的组分组成 ： 0031 MS 培养基 1L 0032 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 0.51mg 0033 染色体加倍诱导剂 2040mg 0034 蔗糖 2030g 0035 琼脂 810g 0036 第二培养基的 pH=5.86.0 0037 上述的第三培养基由。

17、以下配比的组分组成 ： 说 明 书 CN 102428869 B 5 3/8 页 6 0038 MS 培养基 1L 0039 - 萘乙酸 0.030.5mg 0040 染色体加倍诱导剂 520mg 0041 蔗糖 2030g 0042 琼脂 810g， 0043 第三培养基的 pH=5.8-6.0， 0044 上述的浸泡冲液由以及下配比的组分组成 ： 0045 水 1L 0046 易保或克露 0.61.2g 0047 - 萘乙酸 0.51mg 0048 易保或克露是由美国杜邦公司生产。 0049 上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、 氟乐灵、 氨磺乐灵中的至少一种。 0050 本发明具有以下优。

18、点 ： 0051 1、 可以在较短时间内 （F2代） 获得稳定的纯合系 （早代稳定系） 。 0052 2、 纯合系 （早代稳定系） 能稳定遗传， 遗传特性明显。 0053 3、 种子加倍的概率 30% 以上， 从加倍后代中获得稳定纯合系 （早代稳定系） 的概率 30% 左右。 0054 4、 本发明可以用在油菜保持系、 恢复系， 以及常规油菜品种的选育上， 可以在 F2代 内获得稳定的油菜新品系或新品种。对油菜品质育种、 抗性育种、 高油分育种、 常规育种及 杂交育种具有明显的优势， 提高育种效率， 降低育种成本和风险。 0055 5、 该方法与常规油菜品系或品种选育方法比较可以提高效率 50。

19、% 以上， 缩短品种 选育时间 45 年。 0056 附图说明 ： 0057 图 1 为获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0058 图 2 为采用 F009 和 YH 获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0059 图 3 为采用 1325 和白菜菜心获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0060 图 4 为采用 P3 和诸葛菜获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0061 图 5 为采用 1365 和中双 11 获得油菜早代稳定系的方法流程图。 0062 具体实施方式 ： 0063 实施例 1 ： 0064 参见图 1、 图 2， 甘蓝型油菜 F009（染色体 2n=38） 与白菜型油菜 YH（雅安黄油。

20、菜， 染色体 2n=20） 剥蕾进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子。F1代杂交种子在培养基上用秋 水仙素进行人工染色体加倍。对加倍后的 F1代植株进行染色体及形态学鉴定， 正常情况下 F009 与 YH 杂交后代染色体数目为 29 条， 加倍后染色体数目为 4858条不等， 判断染色 体加倍成功。对 F1代植株进行自交 （或强制自交） 获得 F2代， 对 F2 代进行田间种植观察、 育 性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色， 判断花粉育性， 出现三种情况 （1、 单倍体植株， 花粉极 少， 且育性极低 ； 2、 多倍体植株完全不育， 花器官发育受阻， 不能正常的开花， 无花粉 ； 3、 正 常可育。

21、的植株， 花粉量多， 花粉育性 95% 以上） 。对 F2代正常可育单株进行自交获得 F3代。 对 F3代进行纯合度鉴定， 种植 F3代单株株系， 32% 的可育株系单株植株整齐一致， 开花结实 说 明 书 CN 102428869 B 6 4/8 页 7 正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定， 染色体条数一致， 染色体形态未出现异常。SSR 分 子标记， 通过 DNA 聚合酶链反应， 电泳观察每个特异引物扩增下单株 DNA 带型， 显示每个单 株都是 F009 与 YH 的杂交后代， 且每个单株 DNA PCR 扩增条带数目及带型一致， 可以判断这 些株系为纯合系， 即早代稳定系。 0065 。

22、本实施例 1 中将 F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具 体方法如下 ： 0066 1） 用纯度为 75% 酒精进行种子表面消毒 25 秒， 用 0.1% 升汞消毒 12 分钟， 然后用 无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在 第一培养基 （染色体加倍诱导培养基） 上 ； 0067 2)让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件 ： 温度25， 白天光照16小时， 光照强 度 2000 勒克斯， 晚上暗培养 8 小时， 待长到 12 片真叶时， 将植株从下胚轴剪下继续在第 二培养基上生长 ； 0068 3） 将剪下的植株继续插入第二。

23、培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养 ； 0069 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗 3 天后， 取出植株 将植株上的培养基冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡 15 分钟后移栽到温室中， 温室温度 25， 相对湿度 60%， 能保证移栽成活率在 95% 以上 ； 0070 上述的第一培养基由以下配比的组分组成 ： 0071 MS 培养基 1L 0072 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 0.5mg 0073 秋水仙素 30mg 0074 蔗糖 20g 0075 琼脂 8g。 0076 第一培养基的 pH=5.。

24、86.0。 0077 MS 培养基由 Murashige 和 Skoog 发明， 简写为 MS， MS 培养基可在市场上买到。 0078 上述的第二培养基由以下配比的组分组成 ： 0079 MS 培养基 1L 0080 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 0.5mg 0081 秋水仙素 20mg 0082 蔗糖 30g 0083 琼脂 8g。 0084 第二培养基的 pH=5.86.0。 0085 上述的第三培养基由以下配比的组分组成 ： 0086 MS 培养基 1L 0087 - 萘乙酸 0.03mg 0088 秋水仙素 5mg 0089 蔗糖 20g 0090 琼脂 8g。 0091 第三培养基。

25、的 pH=5.8-6.0。 说 明 书 CN 102428869 B 7 5/8 页 8 0092 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成 ： 0093 水 1L 0094 易保或克露 0.6g 0095 - 萘乙酸 0.5mg。 0096 实施例 2 ： 0097 参见图 1、 图 3， 甘蓝型油菜 1325（染色体 2n=38） 与白菜菜心 （染色体 2n=20） 剥蕾 进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子。F1代杂交种子在培养基上用氟乐灵进行人工染色 体加倍。 对加倍后的F1代植株进行染色体及形态学鉴定， 正常情况下1325与白菜菜心杂交 后代染色体数目为 29 条， 加倍后染色体数目为 。

26、48-58 条不等， 判断染色体加倍成功。对 F1 代植株进行自交 （或强制自交） 获得 F2代。对 F2代进行田间种植观察、 育性鉴定即通过醋酸 洋红对花粉染色， 判断花粉育性， 出现三种情况 （1、 单倍体植株， 花粉极少， 且育性极低 ； 2、 多倍体植株完全不育， 花器官发育受阻， 不能正常的开花， 无花粉 ； 3、 正常可育的植株， 花粉 量多， 花粉育性 95% 以上） 。对 F2代正常可育单株进行自交获得 F3代。对 F3代进行纯合度 鉴定， 种植 F3代单株株系， 30% 的可育株系单株植株整齐一致， 开花结实正常。对整齐一致 株系进行细胞学鉴定， 染色体条数一致， 染色体形态。

27、未出现异常。 SSR分子标记， 通过DNA聚 合酶链反应， 电泳观察每个特异引物扩增下单株 DNA 带型， 显示每个单株都是 1325 与白菜 菜心的杂交后代， 且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致， 可以判断这些株系为纯合 系， 即早代稳定系。 0098 本实施例 2 中的将 F1代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色 体加倍的具体方法如下 ： 0099 1） 用纯度为 75% 酒精进行种子表面消毒 30 秒， 用 0.1% 升汞消毒 15 分钟， 然后用 无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在 第一培养基 （染色体加倍诱导培。

28、养基） 上 ； 0100 2) 让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件 ： 温度 230C， 白天光照 14 小时， 光照 强度2500勒克斯， 晚上暗培养10小时， 待长到12片真叶时， 将植株从下胚轴剪下继续在 第二培养基上生长 ； 0101 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养 ； 0102 4） 生根培养二周后， 植株长出粗壮的根后， 将植株在室温炼苗 5 天后， 取出植株 将植株上的培养基冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡 20 分钟后移栽到温室中， 温室温度 20， 相对湿度 70%， 能保。

29、证移栽成活率在 95% 以上 ； 0103 上述的第一培养基由以下配比的组分组成 ： 0104 MS 培养基 1L 0105 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 1mg 0106 氟乐灵 50mg 0107 蔗糖 25g 0108 琼脂 9g。 0109 第一培养基的 pH=5.86.0。 0110 MS 培养基由 Murashige 和 Skoog 发明， 简写为 MS， MS 培养基可在市场上买到。 说 明 书 CN 102428869 B 8 6/8 页 9 0111 上述的第二培养基由以下配比的组分组成 ： 0112 MS 培养基 1L 0113 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 0.8mg 0。

30、114 氟乐灵 40mg 0115 蔗糖 25g 0116 琼脂 9g。 0117 第二培养基的 pH=5.86.0。 0118 上述的第三培养基由以下配比的组分组成 ： 0119 MS 培养基 1L 0120 - 萘乙酸 0.3mg 0121 氟乐灵 13mg 0122 蔗糖 25g 0123 琼脂 9g。 0124 第三培养基的 pH=5.86.0。 0125 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成 ： 0126 水 1L 0127 易保或克露 0.9g 0128 - 萘乙酸 0.8mg。 0129 实施例 3 ： 0130 参见图 1、 图 4， 甘蓝型油菜 P3（染色体 2n=38）与诸。

31、葛菜 （又名二月兰， 染色体 2n=24） 剥蕾进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子。F1代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵 进行人工染色体加倍。对加倍后的 F1代植株进行染色体及形态学鉴定， 正常情况下 P3 与 诸葛菜杂交后代染色体数目为31条， 加倍后染色体数目为5262条不等， 判断染色体加倍 成功。对 F1代植株进行自交 （或强制自交） 获得 F2代。对 F2 代进行田间种植观察、 育性鉴 定即通过醋酸洋红对花粉染色， 判断花粉育性， 出现三种情况 （1、 单倍体植株， 花粉极少， 且 育性极低 ； 2、 多倍体植株完全不育， 花器官发育受阻， 不能正常的开花， 无花粉 ； 3、 正常可。

32、 育的植株， 花粉量多， 花粉育性 95% 以上） 。对 F2代正常可育单株进行自交获得 F3代。对 F3 代进行纯合度鉴定， 种植F3代单株株系， 35%的可育株系单株植株整齐一致， 开花结实正常。 对整齐一致株系进行细胞学鉴定， 染色体条数一致， 染色体形态未出现异常。 SSR分子标记， 通过DNA聚合酶链反应， 电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型， 显示每个单株都是P3 与诸葛菜的杂交后代， 且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致， 可以判断这些株系为 纯合系， 即早代稳定系。 0131 本实施例 3 中的将 F1代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍的 具体方法。

33、如下 ： 0132 1） 用纯度为 75% 酒精进行种子表面消毒 40 秒， 用 0.1% 升汞消毒 17 分钟， 然后用 无菌水将种子表面的升汞冲洗干净， 用无菌纸将种子表面的水分吸干， 然后将种子接种在 第一培养基 （染色体加倍诱导培养基） 上 ； 0133 2)让种子在第一培养基上生根发芽， 培养条件 ： 温度25， 白天光照12小时， 光照 强度 3000 勒克斯， 晚上暗培养 12 小时 , 待长到 12 片真叶时， 将下胚轴剪下继续在第二 说 明 书 CN 102428869 B 9 7/8 页 10 培养基上生长 ； 0134 3） 将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养， 待。

34、有侧芽分化后， 将侧芽及植 株转入第三培养基 （生根培养基） 中进行生根培养 ； 0135 4） 生根培养二周后， 植株长出较粗壮的根后， 将植株在室温炼苗 7 天后， 取出植 株将植株上的培养基冲洗干净， 并在浸泡缓冲液中浸泡 30 分钟后移栽到温室中， 温室温度 16， 相对湿度 80%， 能保证移栽成活率在 95% 以上 ； 0136 上述的第一培养基由以下配比的组分组成 ： 0137 MS 培养基 1L 0138 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 1.5mg 0139 氨磺乐灵 70mg 0140 蔗糖 30g 0141 琼脂 10g。 0142 第一培养基的 pH=5.86.0。 014。

35、3 上述的第二培养基由以下配比的组分组成 ： 0144 MS 培养基 1L 0145 6- 苄基腺嘌呤 （6BA） 1mg 0146 氨磺乐灵 40mg 0147 蔗糖 30g 0148 琼脂 10g。 0149 第二培养基的 pH=5.86.0。 0150 上述的第三培养基由以下配比的组分组成 ： 0151 MS 培养基 1L 0152 - 萘乙酸 0.5mg 0153 氨磺乐灵 20mg 0154 蔗糖 30g 0155 琼脂 10g。 0156 第三培养基的 pH=5.8 6.0。 0157 上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成 ： 0158 水 1L 0159 易保或克露 1.2g 0。

36、160 - 萘乙酸 0.5mg。 0161 实施例 4 ： 0162 参见图 1、 图 5， 甘蓝型油菜 1365（染色体 2n=38） 与甘蓝型油菜中双 11（染色体 2n=38） 剥蕾进行人工去雄杂交获得 F1代杂交种子。F1代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵 进行人工染色体加倍。对加倍后的 F1代植株进行染色体及形态学鉴定， 正常情况下 1365 与中双 11 杂交后代染色体数目为 38 条， 加倍后染色体数目为 6676 条不等， 判断染色体 加倍成功。对 F1代植株进行自交 （或强制自交） 获得 F2代。对 F2代进行田间种植观察、 育 性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色， 判断花粉育性， 。

37、出现三种情况 （1、 单倍体植株， 花粉极 少， 且育性极低 ； 2、 多倍体植株完全不育， 花器官发育受阻， 不能正常的开花， 无花粉 ； 3、 正 说 明 书 CN 102428869 B 10 8/8 页 11 常可育的植株， 花粉量多， 花粉育性 98% 以上） 。对 F2代正常可育单株进行自交获得 F3代。 对 F3代进行纯合度鉴定， 种植 F3代单株株系， 28% 的可育株系单株植株整齐一致， 开花结实 正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定， 染色体条数一致， 染色体形态未出现异常。SSR 分 子标记， 通过 DNA 聚合酶链反应， 电泳观察每个特异引物扩增下单株 DNA 带型， 显。

38、示每个单 株都是 1365 与中双 11 的杂交后代， 且每个单株 DNA PCR 扩增条带数目及带型一致， 可以判 断这些株系为纯合系， 即早代稳定系。 0163 本实施例 4 中的将 F1代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍的 具体方法同实施例 3。 0164 上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明， 但不应将此理解为本发明上 述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 说 明 书 CN 102428869 B 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102428869 B 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102428869 B 13 3/3 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 102428869 B 14 。