技术领域
本发明涉及一种胸腺五肽(TP-5)的缓释微球。该种微球由药物胸腺 五肽、生物可降解药用高分子材料及乳化稳定剂及乳化稳定剂组成，可采 用乳化分散法、溶剂挥发法、喷雾干燥法或低温喷雾提取法制备。采用本 专利方法制备的微球，可缓慢释放胸腺五肽，缓释期长达数天或数月，可 明显减少服药次数，更有利于临床治疗。
背景技术
胸腺功能不全、慢性病毒感染、增生性变化等与自身免疫的发生有关。 当胸腺本身功能不足或依赖胸腺的免疫系统出现明显的原发性或继发性 缺陷，而自身的调节又不足以修复时，给予外源性胸腺激素就可以产生明 显的疗效。如果机体免疫系统功能紊乱、低下或亢进，外源性胸腺激素可 产生明显的双向调节作用。
胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II(Thymopoietin II)结构中的5 肽片段，具有与胸腺生成素II相同的生理功能和药效，由于TP-5的制备 采用了国际上先进的多肽固相合成工艺，故具有纯度高、不含有大分子蛋 白质，有效成份超过市售的胸腺素等优点。已有资料证明TP-5具有使血 液中超氧化物岐化酶(SOD)含量升高、超氧负离子自由基含量显著下降 的功能。本品还具有诱导T细胞分化作用，并与T细胞特异受体结合，使 细胞内c AMP水平上升，从而诱导一系列胞内反应，达到调节免疫功能的 作用。在多种免疫功能紊乱的状况下，无论是抑制还是超敏，TP-5都能 通过促进或抑制的双向调节作用使免疫功能趋于正常。胸腺五肽已于 1985年在意大利上市，商品名为Timunox。目前胸腺五肽已获FDA批准用 于对HIV的临床研究。国内已于1997年批准了胸腺五肽及其冻干粉针的 新药生产，其适应证为(1)慢性乙型肝炎；(2)各种原发性或继发性T 细胞缺陷病(如儿童先天性免疫缺陷病)；(3)某些自身免疫性疾病(如类 风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、儿童支气管哮喘和哮喘支气管炎等)； (4)各种细胞免疫功能低下的疾病(如病毒性肝炎、预防上呼吸道感染、 顽固性口腔溃疡等)；(5)肿瘤的辅助治疗。
TP-5系人工合成的小肽化合物，结构明确，化学纯度高，不含致敏 的大分子蛋白质，因此，无论是动物安全性评价还是临床观察结果，均显 示本品无明显的毒副作用及不良反应。按WHO的有关标准要求，TP-5是 一个较为理想的免疫增强剂，值得临床推广应用。
由于TP-5是一种肽类化合物，易被胃肠道酶破坏，因此不适于设计 成口服给药剂型。目前市售制剂为注射用冻干粉针，规格为1mg，用前加 灭菌注射用水1ml溶解后肌肉注射，或溶于250ml 0.9％氯化钠注射液静脉 慢速滴注，一次1-2支，或隔日1次。TP-5治疗病症范围较广，用药时 间为1-24个月不等，因此临床上需长期频繁注射给药，给患者带来诸多 不便，顺应性差，临床使用和治疗极为不便，从某种意义上限制了该药的 临床应用和市场开发。
发明内容
本发明目的，是通过药剂学研究，将TP-5制成可用于肌肉或皮下注 射的缓释微球，延缓TP-5释药时间，使其缓释期长达数天或1个月以上， 实现1次注射药效维持在2周以上或更长，减少注射次数，提高患者顺应 性，方便临床使用。
本发明所述的TP-5缓释微球，直径为1-250μm，是由微球总重量2-20 ％(W/W)的TP-5、80-98％(w/w)的分子量在5000-75000道尔顿的可生物 降解的药用高分子材料及0.25％-10％(w/w)的乳化稳定剂组成。其中， 生物可降解药用高分子材料选自聚氰基丙烯酸烷酯、聚丙交酯(PLA)、聚 乙交酯(PGA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟丁酸(PHB)、 聚羟戊酸(PHV)、聚癸酸(PDA)、聚酸酐、聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯、 聚乳酸-聚乙二醇、聚羟乙酸-聚乙二醇等，可使用其中一种或两种或两种 以上混合物，最优选高分子材料为聚丙交酯-乙交酯(PLGA)，其聚合比例 在50∶50-85∶15，分子量可在12000-75000道尔顿之间。乳化稳定剂选 自聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸 钠、羧甲基纤维素钠等，最优选PVA。
本发明所述的TP-5缓释微球，可通过乳化分散法、溶剂挥发法、喷 雾干燥法或低温喷雾提取法制备。根据TP-5性质，最优选复乳化-溶剂挥 发法。具体操作为：将生物可降解药用高分子材料先溶解于二氯甲烷、氯 仿、乙酸乙酯、二氧六环、乙醚、丙酮或四氢呋喃等有机溶剂中，制成有 机相，再把TP-5溶于水溶液中制成水相。将水相加入有机相中，采用匀 化或超声振荡方法进行乳化，使形成W/O初乳。另制备含一定浓度乳化稳 定剂的水溶液，将初乳倒入该溶液中，搅拌形成W/O/W复乳，再将复乳移 入适量含乳化稳定剂的水溶液中，置于机械搅拌器上搅拌，离心，收集所 得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，冷冻干燥，即得TP-5缓释 微球。
精密称取TP-5缓释微球约40mg，置于容积为2ml的具盖塑料离心管 中，加入pH7.4的磷酸盐等渗缓冲液1ml作释放介质，置于恒温水浴振荡 器中，在37℃和60rpm的条件下恒温振荡，在0-60天内，定期取样。 每次取样时将离心管取出，10000rpm离心10分钟，取上清液0.5ml作为 供试液。弃去剩余的上清液，沉淀部分再加入新鲜的释放介质1ml，继续 振荡。取供试液，照HPLC方法依法测定，按外标法计算累积释放度。测 定结果显示，本发明方法制备的微球，体外释药可维持2周至60天。
附图说明
附图1：实施例1体外释药曲线
附图2：实施例2体外释药曲线
附图3：实施例3体外释药曲线
附图4：实施例4体外释药曲线
附图5：实施例4微球电镜照片
具体实施方式
本发明的实施例描述如下：
实验例1
称取1000mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯 甲烷中，称取40mg-TP-5溶于400μl蒸馏水中。配制浓度为3％的PVA水 溶液20ml和浓度为0.3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有 PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速 (22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为 3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟， 得W/O/W型复乳，移入300ml 0.3％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以 500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后， 再离心收集，冷冻干燥即得。
所得微球粒径为1-60μm，平均粒径为40μm。微球外观圆整，粒径 分布均匀。
实验例2
称取600mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯 甲烷中，称取28mgTP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为3％的PVA水 溶液20ml和浓度为0.3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有 PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速 (22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为 3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟， 得W/O/W型复乳，移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上以 500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后， 再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-40μm，平均粒径为25μm。微球外观圆整，粒径 分布均匀。
实施例3
称取1000mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量18000)，溶于2ml二氯 甲烷中，称取80mg TP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为2％的PVA水 溶液20ml和浓度为0.5％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有 PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速 (22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为 3％PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟，然后 将所得W/O/W型复乳移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌器上 以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次 后，再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-70μm，平均粒径为50μm。
实施例4
称取670mg PLGA(聚合比例＝50∶50，分子量40000-75000)，溶于3ml 二氯甲烷中，称取40mg TP-5溶于400μl蒸馏水中，配制浓度为3％的PVA 水溶液20ml和浓度为3％的PVA水溶液300ml。先将TP-5溶液移入溶有 PLGA的二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下置于乳化分散机上高速 (22000rpm)乳匀20秒，然后将所制得的W/O型乳剂转移至20ml浓度为 3％的PVA溶液中，置于乳化分散机上以6000rpm的转速，乳匀1分钟， 然后将所得W/O/W型复乳移入300ml 0.5％的PVA溶液中，置于机械搅拌 器上以500rpm的转速搅拌3小时，离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤 多次后，再离心收集，冷冻干燥。
所得微球粒径为1-60μm，平均粒径为45μm。
实验例
对上述实施例样品进行体外释放度考察和外观形状测定，实验结果如 下：
实验例1 胸腺五肽缓释微球体外释放试验
实验样品：根据实施例1、2、3所述方法制备的微球。
实验试剂：PH7.4的磷酸盐等渗缓冲液。
实验仪器：恒温水浴振荡器、离心机、高效液相色谱仪。
实验方法：精密称取实验样品约40mg，置于容积为2ml的具盖塑料 离心管中，加入pH7.4的磷酸盐等渗缓冲液1ml，置于恒温水浴振荡器中， 在37℃和60rmp的条件下恒温振荡，定期取样。
取样方法：将离心管取出，10000rpm离心10分钟，取上清液0.5ml 作为供试液，弃去上清液，沉淀部分再加入新鲜的释放介质1ml，继续振 荡。
取样时间：1、3、6、9、12、15、18、21、24天。
测定方法：照高效液相色谱法依法测定，按外标法计算累积释放度。
试验结果：见下表。
表1：实施例1、2、3样品体外释药测定结果 样品 载药(μg/mg) 累积释放度(％) 实施例1 37.9 1天 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 30.7 33.1 35.1 50.7 64.5 77.1 86.8 90.9 91.7 实施例2 26.4 1天 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 35.0 39.2 43.7 45.8 62.5 78.2 88.4 93.0 94.2 实施例3 60.6 1天 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 30.7 31.8 33 35 50.7 65.2 79.0 87.9 90
以累积释放度为纵坐标，释药时间为横坐标，绘制释药曲线，结果见 附图1、2、3。
实验例2 胸腺五肽缓释微球体外释放试验
实验样品：根据实施例4方法制备的微球。
取样时间：1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、33、38、43、 49、56、61、65天。
其他条件：同实验例1。
试验结果：见下表。
表2：实施例4样品体外释药测定结果 样品 载药 (μg/mg) 累积释放度(％) 实施例4 53.4 1天 4天 7天 10天 13天 16天 19天 22天 25天 10.8 11.9 12.8 14.1 15.0 16.1 17.6 19.0 20.5 28天 33天 38天 43天 49天 56天 61天 65天 20.6 22.0 35.7 45.8 65.9 80.6 85.3 86.1
以累积释放度为纵坐标，释药时间为横坐标，绘制释药曲线，结果见 附图4。
实验例3：胸腺五肽缓释微球形状扫描
实验样品：根据实施例4方法制备的微球。
实验仪器：JSM-3SCF型电子显微镜。
实验方法：略。
实验结果：电镜扫描结果显示，制备的TP-5微球外观圆整，粒径分 布比较均匀，结果见附图5。