技术领域
本发明涉及医药技术领域，确切地说是人参皂苷F1(ginsenoside F1)的医药用途。
人参皂苷F1
分子式：C36H62O9分子量：638.87
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科植物人参的根，分布于黑龙江、吉林、辽宁 和河北北部的深山中。作为常用中草药首载于汉代《神农本草经》，并被列为上品。人参性温、 味甘微苦，具有大补元气、固脱生津、益智安神等功效。用治劳伤虚脱，食少，倦怠，反胃 吐食，大便滑泄，虚咳喘促，自汗暴脱，惊悸，健忘，眩晕头痛，阳萎，尿频，消渴，妇女 崩漏，小儿慢惊，及久虚不复，一切气血津液不足之证。
目前公认人参皂苷是人参的有效部位，其中的Rg1作为有效成分之一，含量较高，活性强， 作用广。但是，天然人参皂苷被肠道吸收的能力极差，难以入血发挥药效作用，从而影响了 人参皂苷的新药开发及产业化。
近年研究表明，人和大鼠口服人参皂苷后，在人肠道内代谢途径为Rg1→Rh1→原人参三醇 (Ppt)，在大鼠肠道内的代谢途径为：Rg1→Rh1/F1(ginsenoside F1)→原人参三醇(Ppt)。 其中F1为Rh1的同分异构体【Kanaoks M，Akao T，Kobashi K.Metabolism of ginseng saponins， ginsenoside，by human intestinal flora.Wakan Iyakugaku Zasshi，1994，11：241；Hideo H，Jong HS，Satoshi M，et al.Main ginsengsaponin metabolites formed by intestinal bacteria.Planta Med，1996，62：453】。说明Rg1经肠内菌代谢后，两个中间产物(Rh1及 F1)被吸收入血产生药理作用。
对于人参单体皂苷的药理作用的研究发现，尽管人参中主要有效成分是人参皂苷，然而 各单体的药理作用并不完全一致，有些甚至截然相反，因此单体皂苷的生物活性研究非常重 要。
近年国内外多侧重于天然人参皂苷的研究，而对于人参皂苷F1的药理活性研究则较少， 已有文献报道的人参皂苷F1药理活性有以下几方面：抗癌【张有为，窦德强，陈英杰，等. 人参皂苷对人体骨肉瘤细胞U2OS增殖的影响.中草药，2001，32(3)：232-236；Hasegawa Hideo，Sung Jong-Hwan，Matsumiya Satoshi，et al.Reversal of daunomycin and vinblastine resistance in multidrug-resistant P388 Leukemia in vitro through enhanced cytotoxicity by triterpenoids.Planta Med，61(5)，409-1】、抗紫外线引起的细 胞凋亡【Lee Enn Hee，Cho Si Young，Kim Su Jong，et al.Ginsenoside F1 protects human HaCaT keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis by maintaining constant levels of Bcl-2.Journal of Investigative Dermatology，121(3)：607-613】、抗HIV 【Hasegawa Hideo，Matsumiya Satoshi，Satoshi Uchiyama Masamori，et al.Inhibitory effect of some triterpenoid saponins on glucose transport in tumor cells and its application to in vitro cytotoxic and antiviral activities.Planta Med，60(3)，240-3】、 调节绵羊红细胞葡萄糖的转运【Hasegawa Hideo，Matsumiya Satoshi，Murakami Chikgar， et al.Interactions of ginseng extract，ginseng separated fractions，and some triterpenoid saponins with glucose transporters in sheep erythrocytes.Planta Med，60(2)，153-7】、诱导细胞与细胞之间通讯的降低【Zhang YW，Dou DQ，Zhang L，et al.Effects of ginsenosides from Panax ginseng on cell-to-cell communication function mediated by gap junctions.Planta Med.2001 Jul；67(5)：417】。关于人参皂苷F1在治疗 贫血方面的活性则未见报道。
再生障碍性贫血(简称再障)是一组由于化学、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓 造血功能衰竭，以造血干细胞损伤，外周血全血细胞减少为特征的疾病。临床常圾现为较严 重的贫血、出血和感染。1986年～1988年我国再障发病情况的调查结果显示，该病年发病率 平均为0.74/10万人口。再障虽属于少见病，但其凶险的表现、严重的并发症及较高的死亡 率所造成的社会影响远远超过其发病率。70年代以来，再障的治疗方法不断改进，如经骨髓 移植、输血、免疫抑制、雄激素，造血细胞因子等方法治疗，再障的预后已有明显提高，但 其治愈率仍较低，而病死率仍较高，因此本病的治疗仍为世界性难题。为此，积极寻找并开 发能有效治疗再障的药物无疑将具有重要的临床价值。
中医学认为再障的发病机理主要为气血两亏，治法多采用补法，故中医药在再障的治疗 中一直发挥着重要作用。人参为大补元气之品，且众多治疗再障的处方中皆含有人参，从而 提示我们对来源于人参的成分人参皂苷F1是否具有治疗再障的作用进行探索，结果表明：人 参皂苷F1能通过促进骨髓造血细胞增生，从而对再障小鼠具保护作用，从而为人参皂苷F1治 疗再障提供药效学支持。
发明内容
本发明的目的在于提供了人参皂苷F1在制备治疗贫血的药物中的应用。具体为人参皂苷 F1在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
人参皂苷F1是一种已知的具有药物活性的物质，因此，可以按常规制剂方法，将其制备 成临床适用的任何一种药剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体制剂、口服液体制剂、 注射剂等。
在制备上述制剂的过程当中，可以将人参皂苷F1与任何一种适用于制备成临床药剂的赋 型剂混合使用，制备成药物制剂。
通过本发明，人参皂苷F1可有效用于治疗再生障碍性贫血，并且副作用小。
由于人参皂苷F1在制备治疗再生障碍性贫血的药物中的应用是发明人的首次发现，因此， 无论是人参皂苷F1单独使用为活性成分制成的药剂，还是利用人参皂苷F1的抗贫血活性与其 他活性成分配合使用制成的药剂，均在本专利的保护范围之内。
本发明通过下列实施方式证明了人参皂苷F1在治疗贫血方面的用途，但不仅限于这些实 施例。
具体实施方式：
试验例：人参皂苷F1对免疫诱导再生障碍性贫血(AA)小鼠的影响
1试验材料
1.1动物：
Balb/c小鼠、DBA/2小鼠：体重(20±1.5)g。购自中国科学院遗传与发育生物学研究所 试验动物中心，自由饮水进食，实验前在实验环境中适应2-3d，实验室温度控制在(24±1) ℃，相对湿度为40％-80％。
1.2药品与试剂：
人参皂苷F1：按制备例4、5方法制备。
丙酸睾酮注射液：规格，1ml:10mg，福州海王福药制药有限公司。
红霉素片：规格：0.125g(12.5万单位)；新乡制药股份有限公司。
庆大霉素：规格：1ml：4万单位，盐城制药有限公司。
台盼蓝：Sigma公司生产。
大鼠抗小鼠CD34+RPE单克隆抗体：购自深圳晶美公司
FACScalibur流式细胞仪：美国BECTONDICKINSON公司生产。
2分组与给药
将Balb/c小鼠随机分为9组，每组10只，具体如下：(1)正常对照组：即未经照射组， 给予无菌生理盐水灌胃，10ml·kg-1·d-1，每天1次，连续12d。(2)模型对照组：于制模当 天即给予无菌生理盐水灌胃，10ml·kg-1·d-1，每天1次，连续12d。(3)人参皂苷F1低剂量 组(5mg/kg，ig)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg，ig)；(5)人参皂苷F1高剂量组 (20mg/kg，ig)；于制模当天即给予人参皂苷F1灌胃，每天1次，连续12d。(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg，ip)；(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg，ip)；(8)人参皂苷F1高剂量组 (10mg/kg，ip)；于制模当天即给予人参皂苷F1腹腔注射，每天1次，连续12d。(9)丙酸睾酮 组：于制模当天即给予腹腔注射丙酸睾酮，10ml·kg-1·d-1。所有小鼠均给予每升含红霉素 250mg及庆大霉素320万U无菌水喂养。
3试验方法
3.1免疫诱导AA小鼠模型的建立
取DBA/2小鼠，断颈处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠 系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻磨碎后过滤，使成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活 性，活性细胞达98％。计数后配成所需浓度备用。雌性Balb/c小鼠，经60Co6.0Gyγ射线亚致 死量全身照射。4h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴结混合细胞，输细胞量为每只1 ×106/0.2ml。
3.2观察指标与方法：
3.2.1小鼠外周血细胞计数，骨髓有核细胞计数：于制模第12d，每只小鼠经尾静脉采血， 按常规方法计数外周血细胞(白细胞、血小板、血红蛋白、网织红细胞)后，断颈处死，取 右侧股骨，用PBS冲出骨髓细胞，计数，即为1根股骨中的骨髓有核细胞(BMNC)。
3.2.2骨髓CD34+细胞检测：将冲出的BMNC用4％甲醛固定，加入10μlCD34+RPE单抗， 4℃孵育30min，用PBS2ml洗2次后加入1mlPBS，经流式细胞仪检测CD34+细胞。
4.结果
实验各组小鼠血细胞计数、骨髓有核细胞计数均显著低于正常对照组(P＜0.01)，但人参 皂苷F1中、高剂量组(ig与ip)及丙酸睾酮组较模型对照组明显增加(P＜0.01)。模型对照组 BMNC上CD34+细胞抗原的表达水平明显低于正常对照组(P＜0.01)，而人参皂苷F1中、高剂量组 (ig与ip)及丙酸睾酮组较模型对照组明显增加(P＜0.05和P＜0.01)，且与正常对照组之间无显 著性差异(P＞0.05)。但人参皂苷F1小剂量组(ig与ip)与模型对照组比较无显著差异 (P＞0.05)。详见表1-2。
表1各组小鼠血细胞计数(x±s) 组别 n 白细胞 (×109·L-1) 血红蛋白 (g·L-1) 血小板 (×109·L-1) 网织红细胞 (个/1000个RBC) 正常对照组 10 6.8±0.6** 147.6±17.6** 230.1±31.3** 10.1±1.4** 模型对照组 10 0.8±0.4 69.9±23.3 153.7±18.1 4.2±1.1 人参皂苷F15mg/kg组(ig) 10 1.2±0.7 74.5±20.3 170.5±42.9 5.1±0.9 人参皂苷F110mg/kg组(ig) 10 2.5±0.8#* 102.6±21.7#* 186.6±46.3#* 7.6±1.0#* 人参皂苷F120mg/kg组(ig) 10 3.9±0.9##** 131.7±18.4##** 202.5±51.6##** 8.9±1.2##** 人参皂苷F12.5mg/kg组(ip) 10 1.6±0.6 74.7±20.4 170.9±41.9 5.2±0.8 人参皂苷F15mg/kg组(ip) 10 2.9±0.9#* 105.6±20.8#* 188.4±43.3#* 7.9±1.1#* 人参皂苷F110mg/kg组(ip) 10 4.3±0.8##** 133.6±17.3##** 208.7±50.4##** 8.9±1.0##** 丙酸睾酮组 10 4.8±0.9** 140.5±17.0** 214.9±50.2** 9.2±1.2**
注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与丙酸睾酮组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
表2小鼠骨髓有核细胞数及CD34+抗原表达的变化(x±s) 组别 n 骨髓单个核细胞计数 (×106/根股骨) CD34+(％) 正常对照组 10 7.8±1.1** 71.2±2.7** 模型对照组 10 1.8±1.0 52.8±4.6 人参皂苷F15mg/kg组(ig) 10 2.0±0.9 49.4±3.8 人参皂苷F110mg/kg组(ig) 10 3.6±0.9#* 59.9±5.4#* 人参皂苷F120mg/kg组(ig) 10 4.5±1.1##** 64.0±5.3##* 人参皂苷F12.5mg/kg组(ip) 10 2.9±0.8 51.4±3.7 人参皂苷F15mg/kg组(ip) 10 4.0±0.7#* 61.6±5.3#* 人参皂苷F110mg/kg组(ip) 10 5.5±1.2##** 68.2±5.0##* 丙酸睾酮组 10 5.5±0.9** 68.7±5.9**
注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与丙酸睾酮组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
5.结论
人参皂苷F1无论注射或口服皆可通过促进骨髓造血细胞增生，从而对再障小鼠具保护作 用。
制备例中所述的人参皂苷Re、人参皂苷Rg1采用云南植物药业有限公司生产的市售品； 柚皮苷酶采用上海宝丰生化有限公司生产的市售品；二甲亚砜采用盘锦兴海制药有限公司生 产的市售品；甲酰胺采用淄博市博山华耀试剂厂生产的市售品；羧甲基纤维素钠采用上海邦 成化工有限公司生产的市售品。
制备例1人参皂苷F1的制备
500mg人参皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5，离子强度为 0.01M，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗 涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗 涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1 301mg。HPLC 法测定人参皂苷F1含量为63％。
制备例2人参皂苷F1的制备
500mg人参皂苷Rg1，150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl缓冲液(pH 4.5，离子强度 为0.01M，含10％的二甲亚砜)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml 水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙 醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1 325mg。 HPLC法测定人参皂苷F1含量为84％。
制备例3人参皂苷F1的制备
500mg人参皂苷Re和Rg1混合物，150mg柚皮苷酶溶于50ml为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5， 离子强度为0.01M，含10％的甲酰胺)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀； 用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用 10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1 310mg。 HPLC法测定人参皂苷F1含量为69％。
制备例4人参皂苷F1注射药物的制备
取制备例2的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入0.1g吐温80，充分溶解，0.22μm微孔 滤膜滤过，分装，121℃灭菌15min，即得。
制备例5动物试验灌胃药物的制备
取制备例1的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入1g助悬剂羧甲基纤维素钠，充分混悬， 即得。