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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510110246.9 (22)申请日 2015.03.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104826141 A (43)申请公布日 2015.08.12 (73)专利权人 上海交通大学医学院附属瑞金医 院 地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号 (72)发明人 李培勇 曹妍 (74)专利代理机构 上海翼胜专利商标事务所 (普通合伙) 31218 代理人 翟羽 (51)Int.Cl. A61K 51/06(2006.01) A61K 47/59。
2、(2017.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 101/02(2006.01) (56)对比文件 CN 103142649 A,2013.06.12, 刘辉.乙酰化介导合成树状大分子稳定化的 纳米银颗粒及其性能表征. 中国优秀硕士学位 论文全文数据库 工程科技I辑 .2012, (第02 期), 樊怿辉等.人钠/碘同向转运体基因转染肺 癌A549细胞介导放射性碘摄取实验研究. 交通 医学 .2010,第24卷(第6期), 审查员 张丽芳 (54)发明名称 纳米银在制备增加肿瘤细胞内放射性碘的 滞留药物中的应用 (57)摘要 本发明公开提供纳米银在制备增加肿瘤细 胞内放射性。
3、碘的滞留药物中的应用， 以及纳米银 和碘联合用药在制备放射性治疗肿瘤药物中的 应用。 本发明的优点在于： 通过增加肿瘤细胞内， 包括低分化的甲状腺癌细胞或转染了NIS基因， 有NIS蛋白表达的非甲状腺肿瘤细胞中放射性碘 的滞留， 提高放射性碘靶向治疗的效率。 放射性 碘在细胞内和银离子-纳米形成纳米-碘化银不 溶物， 阻滞了放射性碘的细胞外流， 提高了肿瘤 放射性治疗的作用。 权利要求书1页 说明书3页 附图4页 CN 104826141 B 2017.12.05 CN 104826141 B 1.纳米银在制备增加肿瘤细胞内放射性碘的滞留药物中的应用， 其特征在于， 所述纳 米银是指带有大量氨。
4、基基团-NH2， 以聚酰胺-胺PAMAM为代表的树形分子或以聚乙酰亚胺 PEI为代表的树枝状聚合物， 或带有羧基基团-COOCH3， 以聚羟基己酸酯PHH为代表的树形分 子， 与硝酸银反应后形成PAMAM -Ag+ ， PEI- Ag+或 PHH-Ag+。 2.纳米银和碘联合用药在制备放射性治疗肿瘤药物中的应用， 其特征在于， 所述纳米 银是指带有大量氨基基团-NH2， 以聚酰胺-胺PAMAM为代表的树形分子或以聚乙酰亚胺PEI 为代表的树枝状聚合物， 或带有羧基基团-COOCH3， 以聚羟基己酸酯PHH为代表的树形分子， 与硝酸银反应后形成PAMAM -Ag+ ， PEI- Ag+或 PHH。
5、-Ag+。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104826141 B 2 纳米银在制备增加肿瘤细胞内放射性碘的滞留药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 更具体地讲， 涉及纳米银在制备增加肿瘤细胞内放射性碘 的滞留药物中的应用。 背景技术 0002 目前增加放射性碘在细胞内滞留的方法主要是通过调节细胞内钠碘转运蛋白 （NIS） 的量来增加细胞对碘的摄取或加强碘在细胞内的有机化来减少碘的外流。 0003 目前的技术均不能有效增加碘在细胞内的滞留， 放射性碘的抗癌效果不显著， 使 得放射性碘在抗癌药领域的发展受限。 如果能有效阻滞碘的细胞外流， 就能大大增加放射 性碘对肿瘤。
6、细胞的治疗作用。 发明内容 0004 本发明的第一个目的在于提供纳米银在制备增加肿瘤细胞内放射性碘的滞留药 物中的应用。 0005 作为一个优选方案， 所述纳米银是指带有大量氨基基团-NH2， 以聚酰胺-胺PAMAM 为代表的树形分子或以聚乙酰亚胺PEI为代表的树枝状聚合物， 或带有羧基基团-COOCH3， 以聚羟基己酸酯PHH为代表的树形分子， 与硝酸银反应后形成PAMAM -Ag+ ， PEI- Ag+或 PHH-Ag+。 0006 本发明的第二个目的在于提供纳米银和碘联合用药在制备放射性治疗肿瘤药物 中的应用。 0007 作为一个优选方案， 所述纳米银是指带有大量氨基基团-NH2， 以聚。
7、酰胺-胺PAMAM 为代表的树形分子或以聚乙酰亚胺PEI为代表的树枝状聚合物， 或带有羧基基团-COOCH3， 以聚羟基己酸酯PHH为代表的树形分子， 与硝酸银反应后形成PAMAM -Ag+ ， PEI- Ag+或 PHH-Ag+。 0008 纳米银是指某些高分子化合物含有大量可与银离子形成络合物基团， 二者反应后 形成的银离子纳米颗粒， 如带有大量氨基基团-NH2， 以聚酰胺-胺PAMAM为代表的树形分子 或以聚乙酰亚胺PEI为代表的树枝状聚合物， 或带有羧基基团-COOCH3， 以聚羟基己酸酯PHH 为代表的树形分子， 与硝酸银反应后形成PAMAM -Ag+ ， PEI- Ag+或 PHH。
8、-Ag+， 其进入细胞内 和胞内碘离子， 包括放射碘 （I-） 反应， 生成AgI， 阻滞碘的细胞外流， 增加放射性碘的细胞 内治疗作用。 0009 本发明的优点在于： 通过增加肿瘤细胞内， 包括低分化的甲状腺癌细胞或转染了 NIS 基因， 有NIS蛋白表达的非甲状腺肿瘤细胞中放射性碘的滞留， 提高放射性碘靶向治疗 的效率。 放射性碘在细胞内和银离子-纳米形成纳米-碘化银不溶物， 阻滞了放射性碘的细 胞外流， 提高了肿瘤放射性治疗的作用。 附图说明 说 明 书 1/3 页 3 CN 104826141 B 3 0010 图1为PAMAM-Ag+的紫外光谱， PAMAM携带银离子进入细胞反应后5。
9、分钟紫外图， 在 430nm波长处可见一明显的吸收峰。 0011 图2为PAMAM与硝酸银反应后形成的PAMAM-Ag+的扫描电镜。 0012 图3为PAMAM-Ag+进入肺癌细胞 （A549-NIS转染细胞） 后的透视电镜。 0013 图4 为ICP元素测定肺癌细胞细胞内PEI-Ag+的浓度。 0014 图5为用荧光显微镜观察FICT-PAMAM-Ag+在胞内的位置。 0015 图6 为PAMAM-Ag+对细胞内125I的滞留作用。 0016 图7为PEI-Ag+对K1细胞内125I的滞留作用。 具体实施方式 0017 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 下述实施例中所使用的实验方法如。
10、无 特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途 径得到。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 0018 实施例1. 0019 （1） 聚酰胺-胺(PAMAM)-银离子的制备 0020 PAMAM 10*-5mol/L硝酸银浓度0.01mol/L， 按照PAMAM与硝酸银摩尔比为1:30加入 到离心管中避光， 室温， 摇床上反应5分钟； 溶液颜色由黄变成褐色， 进行紫外光谱的分析和 扫描电镜 （图1， 2） 。 0021 （2） 胺-胺(PAMAM)-银离子入细胞内 0022 将已合成好的PAMAM-Ag+溶液加入到孵。
11、育有肺癌细胞A549-NIS转染细胞的24孔培 养皿中， 使培养皿中PAMAM终浓度为10-7mol/L； 将培养皿在37摄氏度培养箱中孵育24小时， 作为实验组； 同时， 肺癌细胞A549 作为对照组2。 以透射电镜的方法观测PAMAM-Ag+进入细 胞 （图3） ； 以 电感耦合等离子体 （ICP） 测定胞内银离子的含量 （图4） 。 0023 （3） 转染了NIS基因并有NIS蛋白表达的非甲状腺肿瘤细胞通过NIS摄取放射性碘 入细胞 0024 将细胞培养皿中溶液抽出后用pbs缓冲液洗涤细胞两次， 每孔加入含0.1uCi125碘 的Hbss缓冲液0.5ml； 同时， 未加入PAMAM-Ag。
12、+溶液的A549-NIS转染细胞为对照组1； 37摄氏 度培养箱中孵育1小时； 抽出胞外液， 并用4摄氏度Hbss缓冲液洗涤两次， 加入Hbss缓冲液孵 育细胞， 每5分钟更换胞外Hbss溶液至1小时后用氢氧化钠将细胞裂解。 0025 （4） 放射性碘和PAMAM-Ag+在细胞内形成纳米-碘化银 0026 将PAMAM标记上绿色荧光蛋白 （FICT） 后同样形成PAMAM-Ag+后入A549-NIS转染细 胞， 加入碘后1小时用荧光显微镜观察PAMAM在胞内位置； 用白光观察AgI再胞内的位置， 并 和PAMAM的位置进行图像重叠 （图5） 。 0027 （5） PAMAM-Ag+沉淀在细胞内。
13、， 阻滞放射性碘的外流 0028 根据hbss缓冲液及细胞裂解液中cpm值推算各时间点细胞内125I cpm值， 对比实验 组与对照组的碘流出情况， 判断PAMAM-Ag+对细胞内125碘的滞留作用 （图6） 。 0029 实施例2. 0030 （1） 聚乙酰亚胺(PEI)-银离子的制备 0031 PEI浓度为1.5X10*-4mol/L硝酸银浓度0.01mol/L， PEI与硝酸银体积比为1:1加入 说 明 书 2/3 页 4 CN 104826141 B 4 到离心管中室温反应5分钟。 0032 （2） 聚乙酰亚胺(PEI)-银离子入细胞内 0033 将已合成好的PEI-Ag+溶液加入到孵。
14、育有甲状腺癌细胞K1-NIS转染细胞的24孔培 养皿中， 使培养皿中PEI终浓度为10-7mol/L； 将培养皿在37摄氏度培养箱中孵育24小时， 作 为实验组； 同时， 相同方式处理甲状腺癌细胞K1作为对照组1。 0034 （3） 转染了NIS基因并有NIS蛋白表达的甲状腺乳头状癌细胞K1通过NIS摄取放射 性碘入细胞 0035 将细胞培养皿中溶液抽出后用pbs缓冲液洗涤细胞两次， 每孔加入含0.1uCi125碘 的Hbss缓冲液0.5ml； 同时， 未加入PEI-Ag+溶液的K1-NIS转染细胞为对照组2； 37摄氏度培 养箱中孵育1小时； 抽出胞外液， 并用4摄氏度Hbss缓冲液洗涤两次。
15、， 加入Hbss缓冲液孵育细 胞， 每10分钟更换胞外Hbss溶液至40分钟后用氢氧化钠将细胞裂解。 0036 （4） 放射性碘和PEI-Ag+在细胞内形成纳米-碘化银 0037 （5） PEI-Ag+沉淀在细胞内， 阻滞放射性碘的外流 0038 根据Hbss缓冲液及细胞裂解液中cpm值推算各时间点细胞内125I cpm值， 对比实验 组与对照组的碘流出情况， 判断PEI-Ag+对细胞内125碘的滞留作用 （图7） 。 0039 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 3/3 页 5 CN 104826141 B 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 6 CN 104826141 B 6 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 7 CN 104826141 B 7 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 8 CN 104826141 B 8 图7 说 明 书 附 图 4/4 页 9 CN 104826141 B 9 。