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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680016039.X (22)申请日 2016.02.17 (30)优先权数据 62/117,164 2015.02.17 US (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2017.09.15 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2016/018163 2016.02.17 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2016/133956 EN 2016.08.25 (83)生物保藏信息 PTA-121906 2015.01.14 (71)申请人 凯敏工业公司 地址 美。
2、国衣阿华 (72)发明人 B纳拉辛汗摩尔蒂 J考克斯 J格里夫斯 刘欣 赵柳青 (74)专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人 王健 林晓红 (51)Int.Cl. A01H 5/10(2018.01) A01H 6/14(2018.01) (54)发明名称 称作KI4662的万寿菊雄性近交品系 (57)摘要 一种新的独特的称作KI4662的万寿菊 (Tagentes erecta)近交植物， 其特征在于提高 水平的玉米黄质及很少或者没有叶黄素。 本发明 由通过化学诱导的诱变育种方法而具有改变的 类胡萝 卜素组成的万寿菊父本近交系组成。 在 2010-2012年期间通过所述。
3、诱变程序在一些改变 的类胡萝 卜素突变体中鉴别了三种具有商业用途 的突变体植物， 包括高玉米黄质突变体植物KI- TeM2-4662。 突变体植物KI-TeM204662自交产生 稳定的突变体近交系KI4662。 权利要求书2页 说明书11页 附图2页 CN 107846858 A 2018.03.27 CN 107846858 A 1.称作KI4662的万寿菊近交品系的种子或者其部分， 所述品系的代表性种子已经保藏 在ATCC， 保藏号PTA-121906。 2.权利要求1的万寿菊种子的基本同质组合物。 3.一种产生万寿菊种子的方法， 所述方法包括如下步骤： (a)将权利要求1的种子自身 相。
4、邻种植或者与相同家族或品系的不同种子相邻种植； (b)从所述种子中生长植物； (c)用 来自于其它家族或品系的花粉为权利要求1的种子产生的植物授粉， 或者用来自于权利要 求1的种子产生的植物的花粉为其它家族或品系的种子产生的植物授粉； 及(d)收获获得的 种子。 4.权利要求3的方法产生的万寿菊种子。 5.生长权利要求1的种子产生的万寿菊植物。 6.权利要求5的万寿菊植物的部分， 选自完整植物细胞、 植物原生质体、 胚、 花粉、 胚珠、 花、 种子、 花、 花瓣及叶。 7.权利要求5的植物的花粉。 8.权利要求5的植物的胚珠。 9.万寿菊植物或者其部分， 具有权利要求5的万寿菊植物或其部分的所。
5、有生理学和形 态学特征。 10.权利要求5的万寿菊植物的基本同质群体。 11.一种产生万寿菊植物的方法， 所述方法包括如下步骤： (a)将近交万寿菊植物 KI4662与另一不同的万寿菊植物杂交， 产生后代万寿菊种子， 所述KI4662的代表性种子保 藏在ATCC， 保藏号PTA-121906。 12.权利要求11的方法， 其中所述另一不同的万寿菊植物是近交万寿菊植物。 13.权利要求11的方法， 进一步包括如下步骤： (b)将在步骤(a)的所述后代万寿菊种子 在自花授粉或者近缘授粉条件下生长5-7代； 及(c)收获所得种子。 14.权利要求11的方法， 进一步包括根据期望性状从来自于所述后代万。
6、寿菊种子生长 至少一代而获得的植物中进行选择的步骤。 15.一种引入万寿菊近交系KI4662的期望性状的方法， 所述方法包括如下步骤： (a)将 KI4662植物与包含期望性状的另一万寿菊品系的植物杂交以产生F1后代植物； (b)选择具 有所述期望性状的F1后代植物； (c)将选择的后代植物与所述其它万寿菊品系植物杂交以 产生回交后代植物； (d)选择包含所述期望性状及万寿菊近交系KI4662的生理学和形态学 特征的回交后代植物； 及(e)将步骤(c)和(d)接连进行一或多次， 以产生选择的或更高的回 交后代植物， 在相同环境条件下生长时， 根据5显著水平确定， 所述回交后代植物包含所 述期望。
7、性状及所述其它万寿菊近交系的所有生理学和形态学特征。 16.一种产生杂交万寿菊种子的方法， 包括将第一近交亲本万寿菊植物与第二近交亲 本万寿菊植物杂交并收获所得杂交万寿菊种子， 其中所述第一近交万寿菊植物或者所述第 二近交万寿菊植物是权利要求5的万寿菊植物。 17.一种产生杂交万寿菊种子的方法， 所述方法包括： (a)将权利要求5的近交万寿菊植 物的种子与第二不同的近交万寿菊植物的种子以接近授粉的距离种植； (b)将所述种子培 育为开花植物； (c)对至少一些培育的植物进行杂交授粉； 及(d)收获从所述第一或第二近 交万寿菊植物的至少之一产生的种子。 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 。
8、107846858 A 2 18.权利要求17的方法， 其中所述KI4662万寿菊植物是父本。 19.权利要求17的方法， 其中所述KI4662万寿菊植物是母本。 20.通过权利要求17的方法产生的杂交万寿菊种子。 21.通过生长权利要求20的杂交万寿菊种子产生的杂交万寿菊植物或者其部分。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107846858 A 3 称作KI4662的万寿菊雄性近交品系 0001 相关申请 0002 本申请要求2015年2月17日提交的美国专利申请系列号62/117,164的优先权。 发明领域 0003 本发明一般地涉及万寿菊(Tagetes erecta L.)， 。
9、以及更具体地涉及称作KI4662 的新型万寿菊父本近交系， 其具有高水平的玉米黄质及很少或者没有叶黄素。 0004 发明背景 0005 叶黄素类(Xanthophylls)是形成类胡萝 卜素的两个主要部分之一的黄色色素。 其 分子结构与组成另一主要类胡萝 卜素部分的胡萝 卜素相似， 但是叶黄素类含有氧原子， 而胡 萝 卜素是不含氧的纯碳氢化合物。 叶黄素类含有的氧是羟基形式和/或由氧原子取代氢原子 对作为桥的形式(环氧化物)。 0006 与其它类胡萝 卜素相同， 叶黄素类被发现在大多数绿色植物的叶和/或花中数量最 多， 叶黄素类在此调节光能。 在动物体内及食用动物产品中发现的叶黄素类最终是衍生。
10、自 其饮食中的植物来源。 例如， 鸡蛋黄、 脂肪和皮肤的黄色来自摄入的叶黄素类(主要是叶黄 素(lutein)， 为此目的通常将其加入鸡饲料中)。 0007 人眼视网膜中的黄斑的黄色来自叶黄素及其含有的玉米黄质， 这两种叶黄素类也 需要人饮食中的外源性来源以在眼中存在。 这些叶黄素类保护眼睛免于其吸收的电离蓝光 伤害。 0008 叶黄素类包括(在许多其他化合物中)叶黄素、 玉米黄质、 新叶黄素、 紫黄素及 -和 -隐黄素。 0009 令人感兴趣的是开发具有高水平叶黄素类的产品。 例如， 已知叶黄素类具有抗氧 化性质并且已经显示出预防年龄相关黄斑变性(AMD)。 0010 万寿菊的花是叶黄素类的。
11、最具有商业意义的来源。 一家叶黄素色素的主要供应商 从商用万寿菊杂种(Hybrid 50011， 美国专利号6,894,208)中提取该色素， 该杂种典型具有 94叶黄素(L)和6玉米黄质(Z)的总叶黄素类组成； 平均L:Z比率范围为15:1。 产生玉米 黄质作为主要叶黄素类及具有最低叶黄素的万寿菊杂种提供了农艺学可行的玉米黄质来 源， 用于人类饮食补充剂工业。 Chrysantis公司(West Chicago,Illinois)已经通过诱变开 发了高玉米黄质万寿菊杂种。 0011 发明概述 0012 本发明由通过化学诱导的突变育种方法而具有改变的类胡萝 卜素组成的万寿菊父 本近交系组成。 。
12、在2010-2012年期间， 所述诱变程序在一些改变的类胡萝 卜素突变体中鉴别 了三种具有商业用途的突变体植物， 包括高玉米黄质突变体植物KI-TeM2-4662。 突变体植 物KI-TeM204662自交产生稳定的突变体近交系KI4662。 从KI4662开发具有累积3mg/g玉米 黄质及很少或没有叶黄素的专有高花产量高玉米黄质万寿菊杂种对于开发改良的更高产 万寿菊玉米黄质来源具有很高价值。 0013 使突变体KI-TeM204662自交以固定表型及同时与雌性品系杂交以产生杂合突变 说 明 书 1/11 页 4 CN 107846858 A 4 杂交体种子。 KI-TeM204662中表型的。
13、稳定通过使选择的个体(具有3mg/g玉米黄质)自交6 代而实现。 通过自交的近交(inbreeding)还显著降低后代中不期望的弱表型的频率。 在自 交世代内的所有个体均表现出突变体化学型， 平均玉米黄质含量为3.44mg/g。 KI4662代 表一种独特的遍及基因组的纯合等位基因组装(assemblage)， 这是单籽传代自交至近交状 态的结果。 遗传分析表明在KI4662中针对高玉米黄质的突变是隐性的且在杂合杂种组合中 不完全表达。 野生型起源种质Scarletade(后文称作SCR)在杂种组合中也显示出类胡萝 卜素 表达的部分显性。 高玉米黄质万寿菊杂种的开发需要突变等位基因存在于父本和。
14、母本品系 中。 一种分子标记辅助的渐渗程序导致突变等位基因从父本转移至母本中。 0014 近交系KI4662植物尚未在所有可能的环境条件下被观测到。 表型可能随着环境和 培养条件如温度、 光强度、 白昼时长、 水分状态和/或施肥量或类型的不同而略有变化， 然而 无任何基因型变化。 0015 本发明的一个目的是具有高水平玉米黄质及很少或没有叶黄素的万寿菊植物， 在 人和动物食物、 饮料以及个人护理产品中用作抗氧化剂。 0016 本发明的另一目的是万寿菊(Tagetes erecta)近交系， 其是新型的、 稳定的及一 致性的， 且具有良好的农艺学特征赋予其后代高积累玉米黄质及很少或者没有叶黄素的。
15、性 状。 0017 附图简述 0018 图1是SCR(左侧)和突变体KI4662(右侧)的色谱图。 0019 图2是开发突变体植物KI4662的高世代以产生近交系KI4662的图解。 0020 发明描述 0021 如本文所用， 术语 “M” 世代是暴露于诱变剂的种子(及所得植物)，“M2” 是自花授粉 的M1植物的后代，“M3” 是所选择的单一自花授粉的M2植物的后代等等。 术语 “后代” 是指得自 前一世代的自交植物的所有随后世代的植物和种子。 0022 非洲万寿菊(Tagetes erecta L.)花经商业提取并用作叶黄素类色素的天然来 源， 用于家禽和人饮食补充剂工业。 叶黄素类色素的。
16、主要供应商从商业万寿菊杂种(Hybrid 50011， 美国专利号6,894,208)中提取该色素， 所述杂种典型具有94叶黄素(L)和6玉米 黄质(Z)的总叶黄素类组成； 平均L:Z比率范围为15:1。 产生玉米黄质作为主要叶黄素类及 具有最低叶黄素的万寿菊杂种将提供农艺学可行的玉米黄质来源， 用于人饮食补充剂工 业。 Chrysantis公司(West Chicago,Illinois)已经通过诱变开发了高玉米黄质万寿菊杂 种。 该杂种要求突变体等位基因存在于双亲本中。 使用标记辅助的渐渗和回交技术， 将本发 明的突变等位基因小心地渐渗双亲本品系中， 将促进开发更高花产量高玉米黄质万寿菊杂。
17、 种。 0023 在寻求本发明中， 使用乙基甲烷磺酸酯(EMS)作为诱变剂在可公开获得的良种万 寿菊自由授粉变种(Scarletade)背景下进行大规模化学诱变程序。 在该程序的前两年期间 产生超过4000个第一代(M1)突变体植物。 随后， 在此程序期间， 筛选衍生自1500个M1家族的 大约9000个第二代突变体(M2)的L:Z比率及其类胡萝 卜素分布图。 称作 “No Yield Incomplete Saponification” (NYIS)方法的优化快速方案用于快速筛选这9000个M2植物 的L:Z比率。 使每个M2种子生长产生M2开花植物。 收集每个M2植物的花、 冻干并使用基于。
18、HPLC 的工业标准AOAC方法量化类胡萝 卜素水平。 简而言之， 萃取0.5-1g研磨花瓣样品并使用30mL 说 明 书 2/11 页 5 CN 107846858 A 5 HEAT萃取溶剂(己烷、 乙醇、 丙酮和甲苯， 体积比为10:6:7:7)和2mL 40甲醇氢氧化钾(w/ v)在56水浴中以120rpm摇动20分钟进行皂化。 使用Waters Sphersorb CN柱(504.6mm， 3 m)在HPLC中分析萃取物。 以1.000mL/分钟的流速使用己烷(74.6)、 二氯甲烷(24.9)、 甲醇(0.4)、 n,n-二异丙基乙胺(0.1)的流动相进行等度洗脱。 柱温度保持在25。
19、， 每个 测定注入10 L样品运行13分钟。 二极管阵列检测器(DAD)设定为446nm。 使用标准方法量化 叶黄素和玉米黄质。 0024 大规模筛选M2植物鉴别了具有改变的类胡萝 卜素谱的25个突变体， 其中5个突变体 (KI132、 KI935、 KI4656、 KI4662和KI4871)具有潜在有价值的改变的L:Z比率。 KI132是具有 6:1的L:Z比率的突变体， 接近于潜在有价值的AREDS2目标5:1。 KI935、 KI4656和KI4662是玉 米黄质富集的(高玉米黄质)突变体， 在类胡萝 卜素谱中几乎没有叶黄素至存在极低量的叶 黄素。 突变体KI935和KI4656由于花。
20、不育的问题导致无进一步发展。 如图2所示， 使用单籽传 法将KI4662从M2发展至M7阶段。 简而言之， 将鉴别为单一M2植物的KI4662单独地天然自花授 粉以产生M3种子。 从M3种子产生80个M3植物， 使用AOAC方法量化花中叶黄素和玉米黄质含 量。 基于类胡萝 卜素谱， 选择具有最高玉米黄质含量的2-3个M3植物并单独地天然自花授粉 以产生M4种子。 使用相同方法， 将KI4662从M2发展至产生M7种子的M6世代。 0025 关于叶黄素的益处、 尤其对眼睛健康的益处已经充分研究了几十年。 研究表明玉 米黄质与叶黄素一起在维持最佳眼睛健康方面还发挥独特的不同作用。 此外， 人体研究。
21、已 经证实叶黄素和玉米黄质均存在于皮肤中。 动物研究提供了叶黄素和玉米黄质保护皮肤免 于光诱导的皮肤损伤、 尤其是紫外线波长的作用证据。 在人类饮食需求中除了叶黄素之外 的玉米黄质的独特作用已经广泛研究。 在本发明中， 具有积累直至3.40.2mg/g玉米黄质 而很少至没有叶黄素潜力的高玉米黄质突变品系如KI4662具有重大价值。 0026 典型的万寿菊花的类胡萝 卜素组成含有85叶黄素和5玉米黄质。 目前在商业 上主要的叶黄素万寿菊杂种-按干物质计算平均产生比玉米黄质(1.5mg/g)更多的叶黄素 (18mg/g)。 已经开发了一些高玉米黄质杂种， 但是其含有可测量含量的叶黄素。 在本发明 。
22、中， 利用突变近交系KI4662作为父本品系开发高玉米黄质杂种， 将在开发基于玉米黄质的 产物中带来巨大经济价值， 因为按干物质计算所得杂种具有更高的整体花产量、 相当的玉 米黄质及几乎没有叶黄素。 以杂交形式生长突变体变种KI4662相对于近交系本身将显著增 加花产量， 同时相对于野生型亲本还具有改变的类胡萝 卜素分布图。 0027 在温室条件下， SCR的花中平均叶黄素和玉米黄质含量分别为大约22.22.3mg/g 和1.660.3mg/g。 在温室条件下， 突变体KI4662中玉米黄质含量与野生型SCR相比几乎是 双倍的。 相反， 突变体品系KI4662中叶黄素含量与野生型SCR中存在的。
23、22.2mg/g含量相比几 乎是微不足道(0.05mg/g)(图1)。 Ball Horticultural公司已经开发了高玉米黄质突变 体， 并且已经表明高玉米黄质突变是在lut2基因上， 该基因编码番茄红素 -环化酶(个人论 述)导致组成性整个植物叶黄素缺陷。 突变体KI4662的突变可能是lut2突变(叶黄素缺陷突 变体)， 其特征在于在整个植物的叶和花中极低水平的叶黄素。 研究表明lut2突变消除了叶 黄素产生且与破坏编码番茄红素-环化酶的基因在生物化学和遗传学方面是一致的 (Pogson BJ,McDonal KA,Truong M,Britton G and DellaPenna 。
24、D.1996.Arabidopsis carotenoid mutants demonstrate that lutein is not essential for photosynthesis in higher plants.The Plant Cell,Vol.8,1627-1639； Pogson BJ, 说 明 书 3/11 页 6 CN 107846858 A 6 Niyogi KK,Bjorkman O,DellaPenna D.1998.Altered xanthophyll compositions adversely affect chlorophyll accumulat。
25、ion and nonphotochemical quenching in Arabidopsis mutants.PNAS.95； 13324-13329)。 0028 根据本发明的一方面， 提供了称作KI4662的近交系万寿菊种子及其植物。 本发明 还涉及一种产生近交系万寿菊种子的方法， 包括但不限于如下步骤： 将近交系万寿菊 KI4662的种子与其自身相邻种植或者与相同家族或品系的不同种子相邻种植， 生长所得万 寿菊植物， 将所得万寿菊植物异花授粉， 使用农业领域标准技术(例如积累种子如用于杂种 生产所需的技术)收获得自这种近交植物的所得种子。 本发明还涉及通过这种方法产生的 近交系种子。
26、。 0029 在近交系万寿菊植物KI4662与另一近交系万寿菊植物之间的任何杂交， KI4662可 以指定为是父本(花粉亲本)或者母本(种子亲本)。 本发明还涉及表达近交系万寿菊植物 KI4662的基本上全部生理学和形态学特征的万寿菊植物， 及涉及基本均一的具有近交系万 寿菊植物KI4662的所有生理学和形态学特征的万寿菊植物群体。 从近交系万寿菊植物 KI4662中产生的任何万寿菊植物均预计在本发明内， 也因此在本发明范围内。 关于万寿菊 植物KI4662的生理学和形态学特征的描述在表2中呈现。 0030 本领域普通技术人员应意识到， 对于在表2中鉴定的数量特征而言， 呈现的数值是 典型值。。
27、 这些数值由于环境因素而可以变化， 相应地， 与其基本相当的其它数值也在本发明 范围内。 0031 如表2所述， 近交万寿菊品系KI4662展示出对于性状在环境影响的限制内的一致 性和稳定性。 将近交系KI4662自花传粉足够数目的世代， 小心注意植物类型的一致性以保 证用于大规模商业化生产所需的纯合性和表型稳定性。 该品系已经在分离的田中人工增加 并持续观测一致性。 在KI4662中没有观测到变化的性状或者正如所预期的那样。 0032 本发明的植物分类学描述是万寿菊属(Tagetes)、 万寿菊种(erecta)、 菊科 (Asteraceae)和通用名万寿菊。 表2列出KI4662的特征性。
28、状， 表3列出表2所述性状的定义。 0033 表2： KI4662在营养生长和开花阶段的特征 说 明 书 4/11 页 7 CN 107846858 A 7 0034 0035 0036 表3： 营养生长和开花特征的描述 说 明 书 5/11 页 8 CN 107846858 A 8 0037 0038 0039 在一个实施方案中， 植物KI4662产生玉米黄质， 其包含高于2mg/g干重的玉米黄 质， 及优选高于3mg/g干重的玉米黄质， 以及很少或者没有(0.05mg/g干重)叶黄素。 0040 本发明涉及一种新型的稳定的近交系万寿菊(Tagetes erecta)的开发。 这个品系 是独。
29、特的且与现有所有其它万寿菊(Tagetes erecta)变种均明显不同。 品系KI4662具有能 育的雄性花， 及特别适于用作雄性近交系， 其与雌株杂交产生杂交种子， 这样将获得具有高 玉米黄质及很少或没有叶黄素的植物组织、 特别是花瓣的植物。 KI4662中存在的突变是隐 性的。 为了该隐性突变在杂交组合中完全表达， 父本和母本均应携带该突变。 在这种情况 下， 杂种将具有来自每个亲本的一个等位基因， 该隐性突变在杂种中这两个等位基因上均 出现。 对于携带该突变的母本， 应将突变体KI4662与母本回交以产生携带该突变的雌株。 分 说 明 书 6/11 页 9 CN 107846858 A。
30、 9 子标记有助于将高玉米黄质突变从KI4662经 “手术” 转移和渐渗至雌性品系中， 以产生具有 该突变的雌性品系。 0041 各种培育方案可用于从KI4662中产生新的近交万寿菊品系。 在通常称作谱系法的 一种方法中， 可以将KI4662与另一不同的万寿菊植物如第二近交系亲本万寿菊植物杂交， 其自身呈现出一种或多种所选择的期望性状或者赋予杂交组合所选择的期望性状。 潜在的 期望性状例如包括更大的花产量、 更高的叶黄素类含量、 降低的作物成熟时间、 更好的农艺 学品质、 对杀虫剂、 除草剂、 害虫、 热和干旱及疾病的抗性和/或耐受性， 以及发芽时间、 成苗 (stand establishm。
31、ent)、 生长速度、 成熟和花大小的一致性。 如果两个原始亲本万寿菊植 物不能提供所有期望性状， 则可以在育种群体中包含其它来源。 良种近交系， 即纯种繁殖纯 合子近交系， 也可以用作培育的起始材料或者用作可以产生近交系的来源群体。 0042 之后， 收获所得种子， 选择所得优异的后代植物并在随后世代中自交或者同胞交 配， 如大约5到大约7或更多个世代， 直至产生基本上所有不同于近交亲本的因素不再分离 的世代， 从而提供大量独特的纯种繁殖的近交系。 0043 在通常称为回交的用于产生新的近交万寿菊植物的另一个实施方案中， 通过将作 为非回归供体父本的KI4662植物与携带编码特定的一或多种感。
32、兴趣性状的一或多种基因 的另一种万寿菊植物(称为受体或回归亲本)杂交产生F1代后代植物， 从而将一或多种期望 性状引入近交母本万寿菊植物(回归亲本)。 显性和隐性等位基因均可以通过回交而转移。 供体植物也可以是近交品种， 但是在最广义上可以是任何与回归亲本杂交可育的植物品种 或群体的成员。 接下来， 选择具有期望性状的F1代后代植物。 然后， 选择的后代植物与 KI4662杂交产生回交后代植物。 之后， 选择包含期望性状和万寿菊近交系KI4662的生理学 和形态学特征的回交后代植物。 重复此循环大约1到大约8个循环， 优选接连重复大约3或更 多次， 产生包含如表2所列的万寿菊近交系KI4662。
33、的期望性状和所有期望的生理学和形态 学特征的所选择的更高的回交后代植物， 在相同环境条件下由5显著水平确定。 举例的期 望性状包括昆虫抗性、 除草剂抗性、 产量稳定性、 产量提高及对细菌、 真菌和病毒性疾病的 抗性。 植物育种领域普通技术人员理解育种者使用各种方法以辅助确定应该从分离群体中 选择哪些植物， 以及最终哪些近交系会被用于开发商业化杂种。 除了种质知识及育种者使 用的其他技能， 选择过程一部分依赖于实验设计和使用统计学分析的结合。 实验设计和统 计学分析用于辅助确定哪些植物、 哪些植物家族及最终哪些近交系和杂交组合针对一或多 个感兴趣的性状是显著更好或不同的。 实验设计方法用于评估错。
34、误， 以便可以更精确地确 定两个近交系或两个杂交系的差异。 统计学分析包括计算平均值、 确定变异来源的统计学 显著性以及计算合适的方差分量。 常规使用5或1显著水平确定一给定性状发生的差异 是否是真的还是由于环境或实验误差导致的。 植物育种领域普通技术人员了解如何评价两 个植物品种的性状从而确定这些品种表现的两个性状之间是否没有显著差异。 平均性状值 可以用于确定性状差异是否显著， 优选地所述性状在相同环境条件下生长的植物上测量。 0044 当然， 另一万寿菊植物可以是回归亲本， 由此KI4662中与高玉米黄质值和很少或 没有叶黄素相关的突变在前述过程之后转移到回归亲本中。 预期使用这种近交系。
35、与KI4662 杂交会产生具有按干物质计算高于3mg/g玉米黄质及很少或没有叶黄素的杂交万寿菊植 物。 0045 该方法导致产生具有回归亲本的基本上所有期望的形态学和生理学特征及感兴 说 明 书 7/11 页 10 CN 107846858 A 10 趣的特定转移的一或多种性状的近交万寿菊植物。 因为这种近交万寿菊植物的控制感兴趣 的转移的一或多种性状的基因座是杂合的， 因此最后的回交世代随后自交以提供所述转移 的一或多种性状的纯育种后代。 0046 本领域普通技术人员理解回交可以与谱系育种组合， 就像近交KI4662与另一种万 寿菊植物杂交， 所得后代与近交KI4662回交， 之后， 这个单。
36、回交的所得后代随后近交以产生 新的近交系。 这种回交和谱系育种组合可以在期望恢复少于常规回交获得的全部KI4662特 征的情况下有用。 0047 一旦创建近交系， 下一步是确定近交系是否具有任何价值。 这通过测量新的近交 植物的组合能力以及品系自身性能的技术实现。 组合能力是指当与其它品系杂交形成杂种 时作为亲本的品系的贡献。 特异性组合能力(SCA)是指品系与另一种特异性近交系杂交形 成杂种的能力。 通用组合能力(GCA)是指品系与广泛范围的品系杂交形成杂种的能力。 为了 选择优异品系的目的而形成杂种以评估近交系作为亲本的贡献的方法学可互换地称为实 验杂交、 顶交或测交。 0048 根据本发。
37、明方法， 具有近交KI4662作为亲本的杂交植物自交或者与任何不同的万 寿菊植物例如近交万寿菊植物或杂交万寿菊植物杂交， 以开发新的近交系。 例如， 具有近交 万寿菊植物KI4662作为亲本的杂交万寿菊植物可以近交， 即自交或者近缘授粉， 所得后代 各自自交大约5至大约7代或更多代， 由此提供一系列独特的、 纯育种近交系， 其中每个品系 从具有近交万寿菊植物KI4662作为亲本的杂交万寿菊植物接受其全部等位基因。 在其它实 施方案中， 具有近交万寿菊植物KI4662作为亲本的杂交万寿菊植物与一种不同的万寿菊植 物杂交， 所述不同的万寿菊植物可以包括不是近交万寿菊植物KI4662的任何近交万寿菊。
38、植 物、 不具有KI4662作为亲本的任何杂交万寿菊植物、 另一种种质来源、 突变诱导原种或者性 状供体植物， 由此提供一系列独特的纯育种近交系。 所得近交系可以随后与其他近交或非 近交系杂交， 并且分析所得近交后代的有益特征。 以此方式， 可以鉴别赋予期望特征的新近 交系。 0049 在本发明另一方面， 提供了产生万寿菊种子或植物的方法， 该方法一般包括将第 一亲本万寿菊植物与第二亲本万寿菊植物杂交， 其中第一亲本万寿菊植物或第二亲本万寿 菊植物的至少一种是近交亲本万寿菊植物KI4662。 在本发明一些实施方案中， 第一近交万 寿菊植物是KI4662并且是雌性， 在其它实施方案中第一近交万寿。
39、菊植物是KI4662并且是雄 性。 这些方法可以进一步例示为制备杂交万寿菊种子或植物的方法， 其中第一近交万寿菊 植物与不同的独特品种的第二万寿菊植物杂交以提供杂种， 所得杂种亲本之一是近交万寿 菊植物品种KI4662。 在这种情况中， 选择第二近交品种， 其与第一近交系杂交组合时赋予期 望特征。 在这些方法中， 杂交产生种子。 无论是否采集种子， 都会发生种子生成。 0050 任何时候近交万寿菊植物KI4662与另一种不同的近交万寿菊植物杂交时， 均产生 第一代(F1)万寿菊杂交植物。 由此， F1杂交万寿菊植物可以通过将KI4662与任何第二近交万 寿菊植物杂交而产生。 因此， 以KI46。
40、62作为亲本产生的任何F1杂交万寿菊植物或万寿菊种 子均是本发明的一部分。 0051 当近交万寿菊植物KI4662与另一种近交植物杂交产生杂种时， 原始的近交植物可 以作为父本植物， 贡献给杂种一些特征。 父本和母本遗传特征均可以在杂种中不同地表现。 但是， 通常父本植物之一由于其雄性不育而优选作为母本植物。 通常优选的是使用KI4662 说 明 书 8/11 页 11 CN 107846858 A 11 作为父本。 0052 对于发展杂种的决定， 该杂种无需比所有其它杂种好。 而是必须在至少一些性状 上显示出显著改进， 以便产生对于一些应用或市场的价值。 一些测交杂种尽管与目前商业 杂种有类。
41、似竞争性但是也被放弃， 因为将新杂种引入市场的成本是需要新产品对于现存产 品供应有显著改进。 0053 使用近交万寿菊植物KI4662作为亲本所产生的所有植物均在本发明范围内， 包括 衍生自近交万寿菊植物KI4662的植物。 这包括实质性衍生自近交KI4662的植物， 术语 “实质 性衍生品种” 具有引入本文参考的PlantVariety Protection Act的7U.S.C. 2104(a)(3) 中该术语的含义。 这还包括后代植物及其部分具有至少一个祖先是近交万寿菊植物 KI4662， 更具体地， 其中这个后代的谱系包括近交万寿菊植物KI4662的1、 2、 3、 4和/或5次或 杂。
42、交授粉， 或者具有KI4662作为祖先的植物。 所有本领域普通技术育种者均保留他们育种 计划的谱系记录。 这些谱系记录含有育种过程的详细描述， 包括育种过程中使用的所有亲 本品系的列表及如何使用这种品系的信息。 因此， 育种者了解KI4662是否用于开发后代品 系， 也了解在任何后代品系开发中进行了与KI4662以外的品系的多少次育种杂交。 如此开 发的后代品系可以然后用于与其它不同的万寿菊近交系杂交以产生具有优异特征的第一 代F1万寿菊杂交种子和植物。 0054 因此， 本发明的另一方面是用于产生近交万寿菊品系KI4662衍生的万寿菊植物的 方法。 该用于产生KI4662衍生的万寿菊植物的方。
43、法包括： (a)将近交万寿菊植物KI4662与第 二万寿菊植物杂交以产生后代万寿菊种子； 和(b)生长所述后代万寿菊种子(在植物生长条 件下)， 以产生KI4662衍生的万寿菊植物。 这类方法可以进一步包括如下步骤： (c)将所述 KI4662衍生的万寿菊植物自交或者与另一万寿菊植物杂交以产生另外的KI4662衍生的后 代万寿菊种子； (d)生长步骤(c)的后代万寿菊种子(在植物生长条件下)， 以产生另外的 KI4662衍生的万寿菊植物； 和(e)重复步骤(c)和(d)的杂交和生长步骤0至7次， 以产生进一 步的KI4662衍生的万寿菊植物。 进一步地， 这可以包括使用单倍体育种方法和植物组织。
44、培 养方法以衍生KI4662衍生的万寿菊植物的后代。 0055 随着允许分离和鉴定编码特异性蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现， 植 物生物学领域的科学家们表现出强烈兴趣， 对植物基因组进行工程化以使之含有和表达外 源基因或者额外的或修饰版本的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)， 以便以特异性 方式改变植物性状。 这种外源、 额外和/或修饰的基因在本文中统称 “转基因” 。 本发明在特 定实施方案中也涉及所要求的近交万寿菊品系KI4662的转化版本， 其含有一或多个转基 因、 特别是编码除草剂抗性的基因。 0056 已经开发了许多植物转化方法， 包括生物学和物理学植物转化方案。 参见例。
45、如 Miki et al.,“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants“in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pages 67-88。 另外， 可以利用用于植物细胞或组织转化和 植物再生的表达载体和体外培养方法。 参见例如Gruber et al.,“Vectors for Plant Transformation“in Methods 。
46、in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick, B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pages 89-119。 0057 上述转化方法典型地用于产生转基因近交系。 转基因近交系之后可以与另一(非 说 明 书 9/11 页 12 CN 107846858 A 12 转化或转化的)近交系杂交， 以产生转基因杂交万寿菊植物。 或者， 已经使用上述转化技术 工程化到特定万寿菊品系中的遗传性状可以使用植物育种领域公知的传统回交技术转移 到另一品系中。 例如， 可以使用回交。
47、方法将工程化性状从公开的非良种品系转移到良种品 系中， 或者从基因组中含有外源基因的杂种万寿菊植物中转移到不含该基因的一或多个品 系中。 0058 除了表型观察以外， 植物也可以通过其基因型来描述。 植物的基因型可以通过遗 传标记谱描述， 该遗传标记谱可以鉴别相同品种、 相关品种的植物或者用于确定或验证谱 系。 遗传标记谱可以通过例如如下技术获得： 限制性片段长度多态性(RFLP)、 随机扩增多态 性DNA(RAPD)、 任意引物聚合链反应(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP-PCR)、 DNA扩增指纹(DAF)、 序列特异性扩增区。
48、(SCAR)、 扩增片段长度多态性(AFLP)、 也称 为微卫星(Microsatellite)的简单序列重复(SSR)、 和单核苷酸多态性(SNP)、 同工酶电泳 和等电聚焦。 0059 用于这些目的的特定标记不限于本文公开的标记， 而是包括任何类型的提供区分 品种的手段的遗传学稳定的标记和标记谱。 除了被用于鉴别近交亲本、 通过使用KI4662或 其亲本产生杂种、 以及鉴别或验证通过使用KI4662产生的后代植物的谱系， 遗传标记谱也 可以用于育种和开发回交转化(backcross conversion)。 0060 保藏信息 0061 申请人已将至少2500粒近交万寿菊(Tagetes 。
49、erecta)植物KI4662的种子保藏在 美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110USA， ATCC保藏号为PTA-121906。 ATCC于2015年1月14日接受的种子是从本申请申请日之前保存 在Kemin Industries,Inc.的保藏物取出的。 在本申请存续期间保藏物可以应请求提供给 Commissioner of Patents and Trademarks和Commissioner确定的有权获得的人。 在本申 请任何权利要求授权时， 申请人将根据37C.F.R. 1.808使保藏物可公共获得。 万寿菊近交 系KI4662保藏物将在公共保藏机构ATCC保存30年， 或者最近请求。