技术领域 本发明涉及改变重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)的给药途径，将其与适当基质均匀混合制成外用凝胶剂， 以及这种凝胶剂的制备方法。
背景技术 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由活化的T细 胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞产 生并分泌的一种酸性蛋白。GM-CSF是造血细胞因子家族中的成员，是 一种能在造血干细胞、祖细胞和成熟细胞不同水平上促其生成的多向 性造血因子和内源性调节因子。它可作用于骨髓内造血前体细胞，促 进其增殖、分化，也可诱导成熟细胞及克隆化T细胞的生长和功能， 具有生白细胞作用，是一种调节造血和白细胞功能必须的细胞生长因 子。作为一种重要的信息载体，GM-CSF在机体内广泛参与造血、免疫 及抗感染等过程。
GM-CSF是组织巨噬细胞的强有力的趋化因子，还可活化溃疡局部 的巨噬细胞和中性粒细胞，可有效启动修复过程，全面改善慢性溃疡 的病理特征，促进创伤修复的连锁反应；同时由于大多数创伤很容易 伴有感染，而GM-CSF可增强粒组胞和巨噬细胞的杀菌能力，在机体内 广泛参与了免疫及抗感染过程，对于伤口愈合起着重要作用。在创伤 修复的各阶段GM-CSF均有激活巨噬细胞和中性粒细胞的作用。
近年来，选择以活化巨噬细胞中性粒细胞，内皮细胞和上皮细胞 功能细胞因子GM-CSF促进烧伤愈合，正成为临床研究的热点。
Cioffi WG Jr等(Arch Surg，1991，126(1)：74-79)研究GM-CSF对不 同年龄和烧伤面积烧伤患者的影响，结果表明经过GM-CSF给药后，患 者的白细胞平均数量上升50％，粒细胞胞质氧化功能基线的上升。
Roson M等(Eur J Clin Microbiol Infect Dig，1994，13 Suppl 2：S41-6) 报道，感染后的创面以任何剂量的GM-CSF给药，都会比没有给药的感 染创面对照组的愈合速度要快。GM-CSF给药后创面细菌数量的减少说 明其具有显著的抑菌活性，局部GM-CSF用药能够抑制由于细菌感染而 带来的创面愈合延迟。
Molloy RG等(Br J Surg，1995，82(6)：770-776)验证了GM-CSF给药 的药效，证明GM-CSF在抑制由于烧伤引起的脓血症而引发的死亡方面 具有重要的潜在治疗作用，至少是能够部分修复降低了的T细胞增殖 功能和IL-2的产生。
由此可见，目前GM-CSF用于烧伤的治疗绝大多数的方法是通过注 射方法全身或局部给药，存在的问题是GM-CSF在人体内半衰期较短， 经过体循环后到达烧伤创面的有效药物较少，而且长期的注射会给患 者带来许多痛苦和麻烦，也限制了其临床应用。
Memisoglu E等(Pharm Dev Technol，1997，2(2)：171-180)将rhGM-CSF 与药用辅料混合后外用，以鼠模型来研究其促进创伤愈合的效率。与 对照组的比较结果表明，在所有配方中，加入了rhGM-CSF组的愈合效 果最好。但是此研究并没有对其制剂中rhGM-CSF稳定性进行考察，没 有解决制剂的长期贮存、运输等等问题，也就是说还不能将其作为药 物用于实际的临床应用中。
因此，我公司在原有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)冻干粉针注射剂的基础上，克服上述的缺点，研制了 rhGM-CSF凝胶剂。通过调整凝胶剂中各个组分的比例，使其的作用更 加直接，更有效；对于rhGM-CSF，基质在一定程度上起到缓释作用， 使其作用更加持久；凝胶剂对皮肤无毒、无刺激作用，减轻了患者的 用药痛苦，方便患者使用，为其作为OTC药物的应用提供更广阔的前 景；重要的是，本发明解决了主要活性成分(rhGM-CSF)在凝胶剂中 的长期稳定性问题，能够维持药物在贮存、运输、使用过程中的有效 性，使之成为能够在临床上真正得到应用的药物。
发明内容 本发明目的在于提供重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)凝胶剂及其生产方法，可以被直接均匀的涂抹在因烧伤、 烫伤带来的损伤创面上，使药物蛋白质直接作用于患处，抑制病菌感 染，促进创面组织愈合，缩短愈合时间；同时对皮肤无刺激性，无毒 副作用，而且方便患者使用。
本发明的关键是保持重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物 活性，所以配方的筛选主要以体外生物活性检定为判断依据。专利要 求书中所述及的凝胶剂配方，其组分混合比例的不同，会使rhGM-CSF 保持其生物活性时间不同，从而影响其药效的维持。同时，还要对制 剂进行其它各项检定，以保证其临床用药的可行性。
本发明所研制的是重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶剂， 主要由重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和基质两部分组成。其重 组人中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是利用基因工程方法表达后纯化 得到的。其中基质部分是由人血白蛋白、增稠剂、稳定剂、防腐剂、 湿润剂、和溶解水按照一定的比例混合而成，其中人血白蛋白的浓度 是0.1～10％；其中增稠剂的种类以及各自的浓度分别为：羧甲基纤维 素钠(0.1％～10％)，甲基纤维素(0.1％～10％)；其中稳定剂的种类以 及各自的浓度分别为：十二烷基硫酸钠(0.1％～10％)，吐温(0.1％～ 10％)；其中防腐剂的种类以及各自的浓度分别为：尼泊金甲酯(0.1％～ 5％)，尼泊金乙酯(0.1％～5％)，苯酚(0.1％～5％)；其中湿润剂的种类 以及各自的浓度分别为：甘油(0.1％～10％)，丙二醇(0.1％～10％)。
本发明所述凝胶剂的制备过程是：将增稠剂、稳定剂、防腐剂、 润滑剂、溶解水以一定的比例混合并且搅拌均匀制成凝胶状基质，然 后在0.1～0.15MPa压力，120～126℃条件下，高压灭菌15～30分钟， 自然冷却到室温，再加入一定浓度的人血白蛋白和rhGM-CSF溶液，缓 慢混合均匀，制成外用制剂。
本发明所述外用凝胶剂主要活性成分rhGM-CSF是一种药物蛋白 质，在水溶液或其他制品中缺乏稳定性，很容易发生脱氨作用、氧化 作用、水解作用、二硫键的错配、消旋化作用、β-消除作用及变性、 聚集、沉淀等现象，限制了它的稳定性及临床应用。
所以，本发明外用制剂制备工艺的关键在于：
1.增强主要活性成分rhGM-CSF的稳定性。也就是说通过调整各 种组分的比例，将rhGM-CSF在制剂中所能发生的上述的有害变化降低 至最低限度，甚至是完全避免，只有这样才能保证凝胶剂在制备、贮 存、运输和病人使用中的药物有效性。
2.rhGM-CSF是分子量较大的蛋白质分子，并且有一定的空间结 构，与其他化学药品或者分子量较小、结构相对简单的物质相比，在 由基质到患处的释放过程中，更加容易受到空间位阻效应的影响。所 以要调整制剂中各个组分的比例，使rhGM-CSF的持续释放更加有效。
3.制剂中使用的基质不能对皮肤有刺激作用和毒副作用。
4.各成分之间不应该发生对人体和对rhGM-CSF活性有害的反应。
本发明的制备工艺是：
1.制备基质：
将符合药典标准的增稠剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂、缓冲液和 溶解水按照一定比例混合，搅拌均匀，在0.1～0.15MPa压力，120～ 126℃条件下，高压灭菌15～30分钟，自然冷却到室温，得到无菌的 基质待用。
2.制备rhGM-CSF稳定溶液：
在rhGM-CSF原料药溶液中加入人血白蛋白，然后用溶解水把二者 稀释到一定的浓度，混合均匀，得到稳定的rhGM-CSF溶液待用。
3.制备rhGM-CSF凝胶剂：
将rhGM-CSF稳定溶液缓慢加入基质中，同时慢慢搅拌均匀。在此 过程中要尽量避免气泡产生，防止因气泡的表面张力引起的rhGM-CSF 变性失活。
4.分装，保存：
在无菌条件下，将制备好的rhGM-CSF凝胶剂按照一定量分装，然 后于4℃保存。
本发明所涉及到检定实验和相关实验包括：
1.稳定性实验：
用TF-l依赖细胞株/MTT比色法，对分别在4℃、25℃、37℃存放 的条件下，以凝胶剂中rhGM-CSF的体外活性1.0×107IU/Mg以上为合 格标准，连续考察三批依照以上方法制备的rhGM-CSF凝胶剂的稳定 性。结果如下：
于4℃存放 时间(月) 样品 0 2 4 6 8 10 12 第一批 1.8×107 1.8×107 1.8×107 1.7×107 1.7×107 1.6×107 1.5×107 第二批 1.6×107 1.5×107 1.6×107 1.5×107 1.5×107 1.5×107 1.4×107 第三批 1.5×107 1.5×107 1.5×107 1.3×107 1.3×107 1.2×107 1.2×107
于22℃存放 时间(月) 样品 0 2 4 6 8 10 12 第一批 1.7×107 1.7×107 1.5×107 1.2×107 0.9×107 0.9×107 第二批 1.8×107 1.8×107 1.6×107 1.1×107 0.8×107 0.8×107 第三批 1.6×107 1.6×107 1.5×107 1.2×107 0.8×107 0.8×107
于37℃存放 时间(月) 样品 0 1 2 3 4 5 6 第一批 1.8×107 1.5×107 l.4×107 1.2×107 0.9×107 第二批 1.2×107 1.2×107 1.3×107 1.2×107 0.8×107 第三批 1.5×107 1.4×107 1.5×107 1.3×107 0.8×107
结果表明，本发明所述凝胶剂在37℃条件下，可保存三个月；在 22℃条件下，可保存六个月；而在4℃条件下，放置一年后仍保持活 性。
同时，对本发明所述凝胶剂的外观、PH值、失水、均匀性作长期 观察，均无明显变化，说明其具有良好的稳定性。
2.微生物限度实验：
按照《中华人民共和国药典》二部附录XIJ检验绿脓杆菌和金黄 色葡萄球菌，结果符合要求。
3.皮肤刺激实验
在豚鼠皮肤刺激实验中，分别单次、多次以本发明所述凝胶剂涂 抹于脱毛区后观察，皮肤无发红、发疹、水泡等现象，结果表明本发 明所述凝胶剂无刺激反应。
4.皮肤过敏实验
在豚鼠皮肤刺激实验中，将本发明所述凝胶剂涂抹于脱毛区，间 隔1周连续三次，最后一次致敏后14天，将制剂涂抹于激发区，观察 到无发红、发疹、水泡等现象，结果表明本发明所述凝胶剂无过敏反 应。
具体实施方式 实施例1：取羧甲基纤维素钠1g，甘油2g，尼泊金乙酯 1g，十二烷基硫酸钠1g，加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.1MPa， 121℃条件下，高压灭菌15分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基 质中加入人血白蛋白1g，rhGM-CSF 1000μg，同时缓慢搅拌均匀，制 成rhGM-CSF凝胶剂。
实施例2：取甲基纤维素3g，丙二醇2g，尼泊金甲酯1g，吐温1g， 加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.15MPa，126℃条件下，高压 灭菌25分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加入人血白蛋白 5g，rhGM-CSF 5000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成rhGM-CSF凝胶剂。
实施例3：取羧甲基纤维素钠5g，甘油5g，尼泊金乙酯3g，十二烷基 硫酸钠3g，加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.1MPa，121℃条 件下，高压灭菌25分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加入 人血白蛋白1g，GM-CSF 5000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成rhGM-CSF 凝胶剂。
实施例4：取甲基纤维素5g，丙二醇5g，尼泊金甲酯3g，吐温3g， 加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.1MPa，121℃条件下，高压 灭菌15分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加入人血白蛋白 1g，rhGM-CSF 5000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成rhGM-CSF凝胶剂。
实施例5：取羧甲基纤维素钠1g，甘油2g，尼泊金甲酯1g，十二烷 基硫酸钠1g，加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.1MPa，121℃ 条件下，高压灭菌15分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加 入人血白蛋白1g，rhGM-CSF 1000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成 rhGM-CSF凝胶剂。
实施例6：取羧甲基纤维素钠1g，丙二醇5g，苯酚0.2g，吐温5g， 加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.1MPa，121℃条件下，高压 灭菌25分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加入人血白蛋白 5g，rhGM-CSF 1000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成rhGM-CSF凝胶剂。
实施例7：取甲基纤维素5g，甘油5g，苯酚0.5g，十二烷基硫酸钠 1g，加入溶解水至100g，混合均匀，然后在0.15MPa，126℃条件下， 高压灭菌15分钟，冷却到室温，制成基质部分。在基质中加入人血白 蛋白5g，rhGM-CSF 5000μg，同时缓慢搅拌均匀，制成rhGM-CSF凝 胶剂。