【技术领域】
本发明属于利用传统中药治疗女性更年期或其他原因造成的卵巢功能衰退引起的类更年期症状的领域，采用的传统中药经方为滋肾凉肝方。
【背景技术】
女性的更年期综合征是指妇女在绝经前后或其他原因造成的卵巢功能衰退、神经内分泌失调，而引起的生殖系统变化和一系列以植物神经功能紊乱为主的症候群，主要表现为潮热汗出、心烦易怒、头晕耳鸣、心悸失眠等。其发病是因为生理变化、神经内分泌以及社会文化因素互相作用的结果。在现在乳腺癌患者经过内分泌治疗以后出现的症状与更年期的症状十分类似。
【发明内容】
女性的更年期综合征按照中医的说法其关键是肾虚，根据祖国医学“乙癸同源”的理论，抓住“肾之阴精亏损，肝之疏泄失调”的发病机理，采用滋肾凉肝方之“滋阴益肾，调肝涵木”为主法，治疗女性更年期综合征，取得了良好的效果。
本发明的技术方案为使用滋肾凉肝方来治疗更年期或类更年期症状，其特征为滋肾凉肝方的原料药组成按重量比为：牡丹皮900份，山栀900份，赤芍1200份，生地黄2400份，当归900份，山茱萸1200份。
【附图说明】
图1大鼠体重变化折线图
图2大鼠总胆固醇水平
图3大鼠甘油三酯水平
图4大鼠高密度脂蛋白水平
图5大鼠甘油三酯水平
图6大鼠血糖图
图7大鼠雌二醇水平
图8大鼠孕酮水平
图9大鼠子宫切片
【具体实施方式】
1实验材料
1.1实验动物 成年未孕雌性SD大鼠50只，平均体重购于上海斯莱克实验动物中心。于动物房适应一周，普通饲料。
1.2实验药物 滋肾凉肝方（牡丹皮9g，山栀9g，赤芍12g，生地黄24g，当归9g，山茱萸12g）购自江苏省中西医结合医院药房。来曲唑（芙瑞）2.5mg/片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号：国药准字H19991001。莉芙敏片028g/片，德国夏菩天然药物制药公司，
1.3主要实验仪器及条件
YP120电子天平购于上海良华仪器仪表有限公司。LD85-2离心机购于北京雷勃尔离心机有限公司、台式低温冷冻离心机购自Eppendorf公司；恒温水浴锅购自PolyScience公司；低温冰箱购自于Thermo公司；PB303-N千分之一电子天平购自于上海；超纯水仪Millipore；倒置显微镜Olympus pusbx45；脱水机为Thermo excelsior Es；切片机为LEICA RM2235；包埋机为Thermo Shanclon Histocentre 2，生化仪为罗氏Modular SWA。
2实验方法
2.1药物制备
将上述9味中药加适量蒸馏水浸泡2小时，大火加热煮沸,之后小火煎煮30分钟,过滤,再用双蒸水按前法重复煎煮一次,过滤,将2次煎煮的滤液混合后按所需浓度进行浓缩,置-80℃冰箱保存备用。替伯龙由南京欧加农制药有限公司生产,用双蒸水溶解为所需浓度,灌胃前，适当摇匀，现场配置。
2.2动物模型建立
随机选取45只大鼠行双侧卵巢摘除术。需去势大鼠10%水合氯醛按照0.3mL·100g-1腹腔麻醉,将大鼠仰卧抓于手心，头部低于尾部向下，于腹股沟上1cm进入腹腔，觉枕头无阻力即可推注注射器。麻醉完全的大鼠为刺激大鼠足底部，大鼠仍无反抗动作，麻醉完全的大鼠仰卧于手术台上,于下腹部正中线皮肤，用外科剪作切口，充分暴露手术视野。剥开肠组织，可见子宫为Y形，为起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支为两侧子宫角，向上横行深入腹腔，可见卵巢，性成熟的雌鼠卵巢呈卵圆形,表面有不规则的结节状卵泡呈粉色,轻轻将之提出腹腔,分离后钳夹、结扎、剪去卵巢,同法处理对侧卵巢。注意止血,确定无渗血以后，将脂肪组织和子宫角送回腹腔内,将肠组织复位，分二层间断缝合,关闭腹腔和缝合皮肤。剩余的5只大鼠只打开腹腔，切除少量脂肪，然后关闭腹腔。碘伏消毒创面,术后肌注 青霉素40万U抗感染,连续3天。
2.3分组与给药
将手术14天后大鼠随机分为5组，假手术组，模型组，滋肾凉肝方高剂量组（高剂量组），滋肾凉肝方低剂量组（低剂量组），莉芙敏组。除了假手术组以外，每组每天同时给来曲唑0.23mg·kg-1灌胃，2周后其余各组低剂量按照11.3g生药·kg-1，高剂量组按照45.1g生药·kg-1，莉芙敏组按照0.23mg·kg-1给药。给药6周。
2.4统计学处理
实验数据以均数加减标准差 表示，统计学处理方法采用SPSS17.0软件，One-Way ANOVA分析，P<0.05为结果有统计学意义。
3实验结果
3.1大鼠体重
女性更年期卵巢功能衰竭，体内雌激素水平显著下降，雌激素能降低脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性从而抑制脂肪的形成；诱导激素敏感性脂肪酶活性，或通过增加肾上腺素脂解作用间接地增加脂肪的分解；能使脂肪酸的β氧化增加，减少脂质在脂肪组织中的沉积。此外，雌激素可直接影响下丘脑来减少进食，减少能量的摄入。Heine PA等报道雌激素受体α敲除小鼠能量消耗减少。围绝经期的妇女，由于体内雌激素水平降低，故易出现肥胖或有肥胖倾向。
表1大鼠体重表 （单位g） 0day 7day 14day 21day 28day 35day 42day 正常组 230.5 242.8 261.0 285.5 287.0 292.0 309.0 模型组 223.8 229.7 258.7 277.7 300.0 317.0 332.0 低剂量组 224.8 243.2 250.0 279.3 288.8 304.75 315.0 高剂量组 226.4 232.1 248.1 277.9 289.5 293.0 310.0 莉芙敏组 228.4 241.0 257.9 286.6 297.25 305.25 318.8
去卵巢大鼠经内分泌治疗后，体重的明显增加，特别是21天以后，模型组的大鼠的体重与其他各组相比增长的速率明显增快（P＜0.01），而中药组和莉芙敏组在21天以后体重的增长速率趋于平缓，特别是中药高剂量组，基本趋于正常组的体重增长速率（P＞0.05），实验结束时，模型组大鼠体重（332g）比中药高低剂量组（310g和315g）以及莉芙敏组（318g）明显偏重，见图1。
3.2大鼠血脂
在更年期，LPL，总胆固醇，低密度脂蛋白（LDL）胆固醇，载脂蛋白B增加，雌激素在更能年期或者老年的妇女的血脂方面的有益影响可以防止动脉粥样硬化。此外，载脂蛋白E增加老年斑，老年痴呆症，阿尔茨海默氏症类型。表3为各组大鼠饿血脂四项的指标。
表3大鼠血脂四项
总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和.人群总胆固醇水平主要取决于遗传因素和生活方式.总胆固醇包括游离胆固醇和胆固醇酯，肝脏是合成和贮存的主要器官。胆固醇是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分，其血清浓度可作为脂代谢的指标。如图2所示，模型组大鼠总胆固醇（2.33mmol/L）比正常组(2.14mmol/L)升高有统计学意义（P＜0.05），高剂量组和低剂量组滋肾凉肝方治疗后总胆固醇（1.79mmol/L和1.32mmol/L），比模型组显著降低（P＜0.01），见图2。
甘油三酯（Triglyceride，缩写TG）是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存。模型组的甘油三酯(0.29mmol/L)高于正常组（0.22mmol/L），滋肾凉肝方高剂量（0.12mmol/L）和低剂量（0.12mmol/L）组虽然没有莉芙敏组（0.06mmol/L）水平低但是与模型组相比明显降低，见图3。
高密度脂蛋白在生理上起着将肝外组织的胆固醇运送到肝脏的运载工具的作用，高密度脂蛋白因而可以防止游离胆固醇在肝外组织细胞上的沉积。高密度脂蛋白胆固醇对冠心病的临床诊断是一个重要的参考指标。它的降低是临床冠心病的危险因子之一。
如图4所示对高密度脂蛋白的影响上，内分泌治疗后的去卵巢大鼠的高密度脂蛋白(1.14ummol/L)明显降低（P＜0.01)，滋肾凉肝方和莉芙敏均能提高高密度脂蛋白的含量，其中低剂量的滋肾凉肝方(1.42ummol/L)与莉芙敏(1.66ummol/L)无统计学意义（P＞0.05），高剂量滋肾凉肝方(2.0ummol/L)与莉芙敏有显著的差异（P＜0.01），高剂量滋肾凉肝方与正常组(1.95ummol/L)无明显差别（P＞0.05），见图4。
低密度脂蛋白（LDL）是由极低密度脂蛋白（VLDL）转变而来。主要功能是把胆固醇运输到全身各处细胞，运输到肝脏合成胆酸。每种脂蛋白都携带有一定的胆固醇，携带胆固醇最多的脂蛋白是LDL。体内2/3的LDL是通过受体介导途径吸收入肝和肝外组织，经 代谢而清除的。LDL能够进人动脉壁细胞，并带人胆固醇。LDL水平过高能致动脉粥样硬化，使个体处于易患冠心病的危险。
如图5，模型组的低密度脂蛋白的含量（0.40ummol/L）高于其余任何各组（P＜0.05），滋肾凉肝方高剂量组（0.34ummol/L）、低剂量组（0.35ummol/L）和莉芙敏组（0.32ummol/L）均能降低低密度脂蛋白的含量，但是这三组之间无统计学意义（P＞0.05）。虽然这三组的低密度脂蛋白的含量比正常组（0.25ummol/L）高，见图5。
3.3血糖
测定葡萄糖耐量减低（IGT）的更年期患者雌二醇含量明显低于正常水平，并与血脂含量呈负相关关系雌二醇含量降低可引起血糖及血脂代谢改变可导致IGT、糖尿病及高脂血症发生。潮热症状是更年期最常见的症状，其发生与因为卵巢功能衰退而引起的雌激素水平的降低有关。虽然大多数（80%）的更年期的女性会经历潮热症状，但是其发生的直接原因仍然需要进一步确定。为了确定潮热症状与血糖的关系，在一项对采用雌激素替代治疗（hormone therapy HT)的更年期女性的临床研究发现，与血糖水平低状态(<6.07mol/L)相比，当血糖含量保持在较高的水平的时候(7.18to7.73mol/L)，潮热的发生率将出现明显降低。
去卵巢大鼠的血糖水平明显高于正常组的平均水平，滋肾凉肝方的的高低剂量组和莉芙敏组均能控制去卵巢大鼠的血糖的升高，控制糖代谢的紊乱。经内分泌治疗去卵巢大鼠的血糖（7.54mol/L），比正常组的血糖水平（6.88mol/L）明显提高，有显著的统计学意义（P＜0.01)，各个给药组的血糖水平介于正常组和模型组之间。具体为低剂量组（7.16mol/L），高剂量组（7.36mol/L），莉芙敏组（7.03mol/L）。
表8大鼠血糖表 血糖mol/L 正常组 6.88±1.04 模型组 7.54±0.97 低剂量组 7.16±1.96 高剂量组 7.36±0.79 莉芙敏组 7.03±0.51
根据上述的研究发现，滋肾凉肝方不仅能够降低因为更年期雌激素降低带来的血糖代谢紊乱带来的血糖的升高，而且不会将更年期大鼠的血糖水平降到很低，保持在一个比正常稍高的水平，这可能是滋肾凉肝方控制类更年期患者潮热症状的原因。见图6大鼠血糖图。
3.4血清雌二醇和孕酮
绝经后的女性，体内的雌激素主要来源与脂肪等组织的胆固醇的转化，其中芳香化酶是该转化过程中的关键酶，抑制了该酶的活性即可减少体内雌激素的合成。来曲唑是新一代芳香化酶抑制剂，为人工合成的苄三唑类衍生物，通过与细胞色素P450酶亚单位的血色素竞争性 地结合，有效抑制雄激素向雌激素转化，降低体内雌激素水平。来曲唑对芳香化酶的抑制率是99.1%。中药方剂在合理的配伍之后也能降低血清雌二醇的水平，研究研究发现自拟方剂疏肝凉血方和加减二仙汤均有减低血清雌二醇的作用。
表10大鼠雌激素 E2(pmol/L) PRO(nmol/L) 正常组 149.82±55.44 0.42±0.06 模型组 37.10±12.22 0.20±0.09 低剂量组 34.51±14.63 0.25±0.05 高剂量组 21.23±6.35 0.11±0.04 莉芙敏组 11.23±4.62 0.14±0.02
去卵巢大鼠进行内分泌治疗后（模型组），血清内的雌二醇水平处于一个很低的状态37.10pmol/L，远远低于正常大鼠的血清内的雌激素的水平149.82pmol/L（P＜0.01）。滋肾凉肝方低剂量组治疗后雌二醇（34.51pmol/L）虽然没有统计学的差异但是还是体现了雌二醇有下降的趋势，这种趋势在滋肾凉肝方的高剂量组（21.23pmol/L）虽不及莉芙敏（11.23pmol/L）的疗效明显，但是仍然能降低血清雌二醇的水平（与模型组相比P＜0.05），见图7。
去卵巢大鼠内分泌治疗以后（模型组）血清孕酮（0.20nmol/L）与正常大鼠（0.42nmol/L）相比明显降低（P＜0.01），其余给药的各组，滋肾凉肝方低剂量组的孕酮含量（0.20nmol/L）与模型组无统计学意义（P＞0.05），滋肾凉肝方高剂量组（0.11nmol/L）和莉芙敏组（0.14nmol/L）均比模型组的孕酮含量降低，并且有统计学意义（P＜0.05），见图8。
3.5大鼠子宫切片
女性的子宫内膜在女性绝经以前随着女性的月经周期出现周期性变化，子宫内膜成持续增厚，直到月经期子宫内膜脱落，但是随着女性绝经期的到来，子宫内膜因为体内雌激素的降低而萎缩，其周期性变化消失，如果体内的雌激素由于某种原因再次升高，有可能导致子宫内膜的再次增厚。所以子宫内膜是否增厚间接反映了体内雌激素的水平。绝经前出现月经紊乱，亦可有规律的月经；其子宫内膜形态在增殖期可出现腺体轻度扩张，在分泌期可有少数腺体弯曲，腺上皮分泌状态发育较差。子宫内膜大部分由一薄层的小腺体和致密间质细胞取代，这种形态被称为单纯萎缩。从病理切片可以看出，与正常组的子宫比较起来，模型组的子宫有以下的变化，子宫内膜的柱状上皮细胞减少，子宫间质甚至至肌层都有不同程度的萎缩。滋肾凉肝方高低剂量组以及莉芙敏组的子宫切片和模型组并没有明显的差别。具体见图9。
4讨论
女性的更年期综合征是指妇女在绝经前后或其他原因造成的卵巢功能衰退、神经内分泌失调，而引起的生殖系统变化和一系列以植物神经功能紊乱为主的症候群，主要表现为潮热汗出、心烦易怒、头晕耳鸣、心悸失眠等。其发病是因为生理变化、神经内分泌以及社会文化因素互相作用的结果。在现在乳腺癌患者经过内分泌治疗以后出现的症状与更年期的症状十分类似。按照中医的说法其关键是肾虚，根据祖国医学“乙癸同源”的理论，抓住“肾之阴精亏损，肝之疏泄失调”的发病机理，采用滋肾凉肝方之“滋阴益肾，调肝涵木”为主法，治疗女性更年期综合征，取得了良好的效果。
本实验证明虽然对于去卵巢大鼠，滋肾凉肝方可以提高其血清的雌二醇和孕酮的水平，但是对于经内分泌治疗的去卵巢大鼠，经滋肾凉肝方治疗以后，体内的雌二醇水平的与模型组相比更低，说明滋肾凉肝方与来曲唑联合使用能够更好的降低雌二醇的水平，降低雌激素对乳腺癌的复发转移的这一风险，证明了滋肾凉肝方对乳腺癌患者的安全性及有效性。这一相反的结论证明了滋肾凉肝方对于接受内分泌治疗和不接受内分泌治疗的去卵巢大鼠，有着双向调节的作用，即，对于去卵巢大鼠，其机体内类似于人类的更年期，其产生原因是体内的雌激素比绝经前大幅度下降，此时的治疗方法是有节奏的补充雌激素，减轻更年期症状，例如补充雌二醇，尼尔雌醇等，此时予以滋肾凉肝方可以提高体内的血清雌二醇的水平，但是对于接受内分泌治疗的去卵巢大鼠，滋肾凉肝方的作用却是可以降低其血清雌二醇和孕酮的含量，其效果和内分泌治疗的效果是一致的。不论是他莫昔芬还是来曲唑，不管是与雌激素受体的竞争性结合还是阻断雌激素的生成通路，各种不同的内分泌治疗的机理都是尽可能的降低体内的雌激素的水平。
卵巢功能衰竭的最早的变化是FSH升高，垂体FSH的释放受卵巢负反馈抑制较LH更加敏感。卵巢功能下降，垂体FSH分泌增多。有文献报道，FSH基础值>10IU／L是巢功能开始衰竭的激素特征。FSH对卵巢功能的早期变化较敏感，随着年龄的增长，到56～60岁FSH及LH均升至最高，分别是31岁一组的13.6倍和5.7倍。而雌激素水平降至最低。在以后的临床实践中，可以对进行内分泌治疗的患者在监测血清雌激素的同时，监测FSH水平以便尽早发现患者体内激素水平可能发生的变化，采取适当措施，提高患者的生活质量。同时，在使用内分泌的治疗可以联合滋肾凉肝方来进一步降低体内的雌激素的水平。
内分泌治疗后患者容易出脂代谢的紊乱出现体重增加，脂肪肝等副作用，但是从本实验的结果看出来，虽然在短期内滋肾凉肝方在控制患者体重增加上面没有优势，但是从长期来看，滋肾凉肝方控制经过内分泌治疗的去卵巢大鼠的体重还是受到明显的疗效的。这一点也可以性血生化指标的血脂四项看出来，经过内分泌治疗的去卵巢大鼠的总胆固醇，甘油 三酯以及低密度脂蛋白这些可能引起患者脂代谢异常的不良因素，在经过滋肾凉肝方的治疗以后，这些不良指标的水平都受到了不同程度的降低，相反的是对于高密度脂蛋白，滋肾凉肝方治疗以后此项指标都有了提高，高密度脂蛋白是血脂中唯一一项对改善脂代谢异常起积极作用的一项指标。这说明滋肾凉肝方控制内分泌治疗后的去卵巢大鼠的体重的机理很可能是改善其脂代谢的异常。
结论
乳腺癌是危害女性健康的主要肿瘤，随着经济的发展，人民生活方式的转变我国的发病率在上升。乳腺癌内分泌治疗引起的类更年期症状迫使很多患者放弃内分泌的治疗，影响患者的预后。因此,寻找有效治疗内分泌治疗引起的类更年期症状的药物和方法是目前抗肿瘤研究的一个重要课题。中医药疗法作为乳腺癌综合治疗中的一个重要组成部分，对于降低术后复发率、减轻放化疗不良反应、延长患者生存期、改善患者的生存质量具有重要意义。滋肾凉肝方是我们在临床使用的经验方，临床疗效较好，特别是在改善更年期症状方面取得良好的疗效。为探索滋肾凉肝方改善经过内分泌治疗产生类更年期症状的乳腺癌患者的治疗效果及可能的作用途径，我们进行了以上研究。
上述实验中，我们通过动物发现滋肾凉肝方可以降低经过内分泌治疗引起去卵巢大鼠的雌激素水平，可以降低大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白的含量，有效控制去卵巢大鼠的体重增加，并对大鼠子宫内膜无刺激增厚作用。说明滋肾凉肝方可以改善乳腺癌患者内分泌治疗引起的类更年期的症状，不引起体内雌激素的升高，用于乳腺癌患者具有安全性。