所属技术领域
本发明属于中药制药领域，具体涉及一种白花蛇舌草粉针剂及其制备方法。
技术背景
白花蛇舌草又名蛇舌草、蛇利草、蛇总管等，为茜草科耳草属植物白花蛇舌 草的干燥全草，具有清热解毒、活血化淤、利湿通淋等作用，用于肝炎、肠炎、 肺炎、肿瘤等疾病的治疗，其制剂白花蛇舌草具有清热解毒、利湿消肿的功效， 用于湿热所致的呼吸道等的感染及手术后感染，也可用于癌症的辅助治疗。
白花蛇舌草含有蒽醌类、黄酮类、环烯醚苷萜类、甾醇类、烷烃类、多糖类 等有效成分，查阅文献，我们得知白花蛇舌草脂溶性成分在水溶液中具有不稳定 性，因此白花蛇舌草注射液在保存过程中，对环境要求很高，不利于白花蛇舌草 注射液的运输和应用，并且随时间延长导致药效下降；白花蛇舌草注射液可用于 癌症的辅助治疗，白花蛇舌草中脂溶性成分具有一定的抗肿瘤活性，但其主要抗 肿瘤活性成分是水溶性成分，而从水溶性成分中分离出多糖组分具有很好的抗肿 瘤活性(《白花蛇舌草不同提取工艺对抗肿瘤活性的影响》，中国药科大学学报， 2002，33(6)：510-513)，因此，制剂中应保留这一活性成分，而标准号 为WS3-B-3176-98白花蛇舌草注射液的制备方法中应用80％乙醇渗漉提取等方 法，不仅耗费了大量的乙醇和时间，而且导致抗肿瘤活性很好的多糖成分的丢失， 造成资源浪费。因此，研究发明含有白花蛇舌草多糖、脂溶性等有效成分的注射 制剂是很多医药工作者的希望。
查阅文献和专利，未检索到以白花蛇舌草为原料制备的粉针剂。
发明内容
基于上述原因，本发明采用超声醇提取、碱性乙醇沉淀、盐酸调节PH值的方法 得到醇提物，提取的残渣水提取、超滤的方法得到多糖，加入药用辅料，制备成 粉针剂，控制粉针剂中总黄酮(以芦丁计)不得少于0.60mg/瓶，控制多糖含量不 低于16.0mg/瓶；本发明采用超声提取的方法，缩短了提取时间，减少了乙醇的用 量，该方法在保留了脂溶性成分的基础上，提取出抗肿瘤活性很好的多糖组分； 药理实验结果表明，与市售同类品种比较，具有更好的药理作用。 本发明通过以下技术方案实现的。
一.工艺制法
(1)取白花蛇舌草，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为70％-90％的乙醇提 取10-15分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生 药量4-6倍的1％氢氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐 酸调节pH值至5，离心，取上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度30- 40℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取2-4次，每次2-4小时，合并提取液， 过滤，浓缩到50℃时相对密度为1.05-1.10，用0.1um的滤芯粗滤，滤 液先用截留分子量为100000的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留 分子量为3000的超滤膜包超滤，保留循环液，循环液干燥，得到白花蛇 舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物40-60重量份，白花蛇舌草多糖16-23重量份，药用辅 料为重量份117-144；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入 药用辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂。
二.检测分析实验
1.总黄酮的检测分析
对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50ml 量瓶中，加适量70％乙醇，置水浴上微热使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀， 即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0ml， 分别置25ml量瓶中，各加70％乙醇至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6 分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加乙 醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(附录VB)，在507nm的波长处测 定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法：精密称取本发明粉针剂100mg，加于已处理好的聚酰胺柱(50目，2g，内 径12～15mm，湿法装柱)上，用50ml水洗脱，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱，收 集洗脱液约25ml，置25ml量瓶中，加70％的乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量 取5ml，置甲、乙两个25ml量瓶中，甲瓶中加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置 6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，在甲、乙两瓶中各加氢氧化 钠试液10ml，再加乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法，以乙瓶 为空白，在507nm的波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的 量，计算，即得，计算结果见表1：
2.多糖检测分析
标准曲线绘制：电子天平精密称取100.0mg无水葡萄糖，用蒸馏水溶解后置500mL 容量瓶中，加双蒸水定容，摇匀，即得0.2mg·mL-1的标准液，用移液管分别吸取 0.0mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL葡萄糖标准溶液至50mL容量瓶 中，加双蒸水定容至20mL。用移液枪分别吸取1.0mL至试管中，加入6％苯酚溶液 1.0mL，95.5％浓硫酸5.0mL，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测吸光度， 根据实验结果得到标准曲线。
换算因素测定：精确称取本发明粉针剂20.0mg，置于50mL容量瓶中，加双蒸水稀释 定容至刻度，摇匀，准确吸取1.0mL溶液于试管中，加入6％的苯酚溶液1.0mL，95.5％ 的浓硫酸5.0mL，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测吸光度，代入标准 曲线方程得多糖中游离葡萄糖浓度，按下式计算换算因素f：f＝W/(C×D)，式中W为 本发明粉针剂重量，C为葡萄糖浓度，D为多糖稀倍数。测得f＝2.134。
多糖含量测定：精密称取本发明粉针剂20.0mg，用蒸馏水溶解，至50mL容量瓶中， 加蒸馏水定容。用移液管精确吸取1.0mL多糖溶液于试管中，加入6％的苯酚溶液 1.0mL，立即加入95.5％的浓硫酸5.0mL，摇匀，置40℃水浴加热10min，室温静置 20min后于490nm处测光密度值。将所得的数据代入葡萄糖溶液的标准曲线中计算 多糖样品经浓硫酸水解后产生的葡萄糖含量。按下式计算样品中的多糖含量：多糖 含量(％)＝C×D×fW×100，式中C为供试样品中葡萄糖浓度(mg·mL-1)，D为供试液 的稀释倍数，f为换算因素，W为供试样品重量(mg)。实验结果见表1：
表1本发明粉针制剂有效成分含量检测 组别 总黄酮含量(以芦丁计) mg/瓶 多糖含量 mg/瓶 1 2 3 平均值 0.72 0.75 0.72 0.73 20.16 20.87 20.45 20.49
按照上述同样的方法，对市售白花蛇舌草注射液(三九企业集团安徽三九药业有 限公司)进行检测分析，结果见表2：
表2市售白花蛇舌草注射液有效成分含量检测 组别 总黄酮含量(以芦丁计) mg/瓶 多糖含量 mg/瓶 1 2 3 平均值 0.58 0.57 0.55 0.57 - - - -
注：-表中代表未检出
结论：通过上述检测分析实验，表明本发明工艺使制剂中醇提有效成分提高了20 ％多，保留了抗肿瘤活性成分较好的多糖成分，充分说明本发明工艺具有实际意 义。
三.制剂稳定性考察
实验药物：本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供) 白花蛇舌草注射液(三九企业集团安徽三九药业有限公司)
实验方法：将两种制剂在湿度为45％-55％，温度为18-25℃的外界环境下储存 18个月，避免日光照射，分别在0、3、6、12、18个月取出两种制剂进 行检测分析(检测方法同上)，考察制剂稳定性，实验结果见表3：
表3制剂的稳定性考察 组别 0个月总黄酮含 量 mg/瓶 3个月总黄酮含 量 mg/瓶 6个月总黄酮含 量 mg/瓶 12个月总黄酮 含量 mg/瓶 18个月总黄酮 含量 mg/瓶 市售白花蛇舌草 注射液 本发明粉针剂 0.56 0.74 0.50 0.73 0.39 0.68 0.31 0.65 0.29 0.61
结论：通过上述稳定性考察，我们可以分析到，市售白花蛇舌草注射液18个月时 有效成分损失了近50％，而本发明粉针剂有效成分保留了80％以上，因此，充分 说明本发明制剂具有很好的稳定性。
四.工艺方法的比较
实验工艺：一组：按照本发明工艺方法进行。
二组：按照标准号为WS3-B-3176-98白花蛇舌草注射液的制备方法进 行。
实验方法：按照上述方法，取相同质量的白花蛇舌草，进行提取分离后，干燥， 考察乙醇用量、提取时间、有效成分的提取率，实验结果见表4：
表4实验工艺比较 组别 提取时间 小时 乙醇用量 升 总黄酮提取率 ％ 多糖提取率 ％ 一组 二组 3.5 28.5 10 89 85.2 74.3 86.4 -
注：-代表未检出
结论：通过上述实验，进一步表明本发明工艺具有实际意义。
三.药理实施例
实施例1
对二甲苯引起小鼠耳壳炎症的影响
实验药物：本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供) 白花蛇舌草注射液(三九企业集团安徽三九药业有限公司)
生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
实验动物：昆明种小鼠(20±2)g，雌雄兼用。
实验方法：小鼠30只，分为3组，每组10只，将本发明粉针剂用注射用水溶解 与白花蛇舌草注射液相同生药量的溶液，按照0.3g生药/kg给药剂量给 小鼠尾静脉给药，每天1次，给药3天，生理盐水组给药容量0.5ml/ 只，每天1次，给药3天，于末次给药后1h，取二甲苯0.05ml/只均匀涂 于左耳前后两面致炎，15min后，处死动物，剪下耳壳，两耳重叠，用直径为 8mm打孔器取圆片，称量，左右耳重之差作为肿胀度，求出给药组的肿胀 抑制率。结果见表5：
表5对二甲苯引起小鼠耳壳炎症的影响 组别 动物数 (只) 肿胀度 (mg) 抑制率 (％) 生理盐水 白花蛇舌草注射液 本发明粉针剂 10 10 10 21.63±6.3 16.24±5.2** 10.22±4.1**[*] - 24.9 52.8[*]
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，与阳性对照组比较[*]P＜0.05
实施例2
对小鼠淋巴细胞增殖和抗体产生的影响
实验动物：昆明小鼠24只，体重18～22g，雌雄不限。
实验药物：本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
白花蛇舌草注射液(三九企业集团安徽三九药业有限公司)
生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
实验方法：取小鼠，随机分组，每组12只。给药组尾静脉给药，给药量为0.3g生 药/kg，对照组给予生理盐水0.5ml/次；实验第5d分别将5％的绵羊红细胞0.2ml 注入各组小鼠腹腔内，第11d眼球放血，颈椎脱臼处死，常规取脾脏，然后进行脾细 胞计数，调细胞浓度至1×107/ml，取脾细胞1ml，1∶10新鲜豚鼠血清(补体)1ml， 0.2％绵羊红细胞1ml，混匀，37℃水浴1h，1500rpm离心10min，取上清液用96 孔细胞培养板于全自动酶标仪450nm波长处测A值，作为QHS反应值，实验结 果见表6：
表6不同制剂对小鼠淋巴细胞增殖和抗体产生的影响 组别 动物数 只 脾淋巴细胞增殖 QHS 生理盐水 白花蛇舌草注射液 本发明粉针剂 12 12 12 0.137±0.011 0.455±0.035* 0.512±0.024** 0.137±0.033 0.077±0.006* 0.051±0.004**
注：**P＜0.01，*P＜0.05
实施例3
对小鼠S180肿瘤生长抑制作用
实验动物：健康小鼠，体重16-20g，雌雄各办。
瘤株：小鼠S180
实验药物：本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
白花蛇舌草注射液(三九企业集团安徽三九药业有限公司)
生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供) 实验方法：取接种传代小鼠S180，在匀浆器中加入生理盐水，制成小鼠S180瘤匀浆 液，再以生理盐水1∶3稀释，然后取0.2ml注入小鼠左腋下皮下，24 小时称重，小鼠每日尾静脉给药一次，给药量为0.3g生药/kg，共14 天。停药次日处死小鼠，称体重并细心剥离皮下瘤块，于EM50电子 天平称取瘤重，并计算抑瘤率，见表7：
表7两种制剂对小鼠S180肿瘤生长抑制作用 组别 动物数 只 瘤体重量 mg 抑瘤率 ％ 生理盐水 白花蛇舌草注射液 本发明粉针剂 10 10 10 1.4123 1.2355 0.9975 100 12.5 29.4*
注：与生理盐水组比较*P＜0.05
结论：通过以上药理实验表明，本发明冻干粉针剂具有更好的药理作用。
四.制备实施例
实施例1
(1)取白花蛇舌草2000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为70％的乙醇提取 10分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量4倍的1％氢 氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节PH值至5，离心，取 上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度30℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.05，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物40克，白花蛇舌草多糖16克，药用辅料乳糖为144克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂1000瓶。(本发明粉针剂 总黄酮(以芦丁计)含量0.60mg/瓶，多糖含量16.0mg/瓶。)
实施例2
(1)取白花蛇舌草2000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为90％的乙醇提取 15分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量6倍的1％氢 氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节pH值至5，离心，取 上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度40℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取4次，每次4小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.10，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物60克，白花蛇舌草多糖23克，药用辅料蔗糖为117克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂1000瓶。(本发明粉针剂 总黄酮(以芦丁计)含量0.81mg/瓶，多糖含量23.0mg/瓶。)
实施例3
(1)取白花蛇舌草2000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为75％的乙醇提取 12分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量5倍的1％氢 氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节pH值至5，离心，取 上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度35℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.08，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物45克，白花蛇舌草多糖18克，药用辅料甘露醇为137克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂1000瓶。(本发明粉针剂 总黄酮(以芦丁计)含量0.68mg/瓶，多糖含量17.3mg/瓶。)
实施例4
(1)取白花蛇舌草2000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为80％的乙醇提取 14分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量5倍的1％氢 氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节pH值至5，离心，取 上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度38℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.09，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物50克，白花蛇舌草多糖20.5克，药用辅料甘露醇、乳糖129.5 克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂1000瓶。(本发明粉针剂 总黄酮(以芦丁计)含量0.71mg/瓶，多糖含量18.4mg/瓶。)
实施例5
(1)取白花蛇舌草2000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为85％的乙醇提取 14分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量6倍的1％氢 氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节pH值至5，离心，取 上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度38℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物；
(2)取上述残渣，干燥，加水提取4次，每次4小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.07，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物55克，白花蛇舌草多糖22.8克，药用辅料甘露醇、蔗糖、乳糖 为122.2克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂1000瓶。(本发明粉针剂 总黄酮(以芦丁计)含量0.79mg/瓶，多糖含量21.4mg/瓶。)
实施例6
(1)取白花蛇舌草20000克，粉碎，放入超声提取罐中，用浓度为80％的乙醇提 取14分钟，提取液过滤，残渣备用，滤液回收乙醇至尽，加入生药量5倍的1％ 氢氧化钾—乙醇溶液，静置，离心，取上清液，加盐酸调节pH值至5，离心， 取上清液，旋转蒸发仪浓缩，控制温度35℃，低温干燥，得到白花蛇舌草醇提物； (2)取上述残渣，干燥，加水提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，浓缩 到50℃时相对密度为1.08，用0.1um的滤芯粗滤，滤液先用截留分子量为100000 的中空纤维柱超滤，保留透过液，再用截留分子量为3000的超滤膜包超滤，保留 循环液，循环液干燥，得到白花蛇舌草多糖；
(3)本发明制剂处方为：
白花蛇舌草醇提物508克，白花蛇舌草多糖204克，药用辅料甘露醇、乳糖1288 克；
(4)将白花蛇舌草醇提物、多糖，加入注射用水溶解完全，过滤，滤液加入药用 辅料，，过滤，灭菌，干燥，得到白花蛇舌草粉针剂10000瓶。(本发明粉针 剂总黄酮(以芦丁计)含量0.74mg/瓶，多糖含量19.4mg/瓶。)