技术领域：
本发明涉及白花檵木提取物在制备愈伤药物中的应用。
背景技术：
皮肤创伤是人类常见的健康问题，大致分为开放式和封闭式两类，其中开放式创伤包 括擦伤，撕裂伤，射伤，割伤，切除伤和手术伤等，封闭式创伤包括挫伤、挤压伤、扭伤、 震荡伤、关节脱位和半脱位、闭合性骨折、闭合性内脏伤等。
皮肤最主要功能是作为天然屏障，防止机体外液流失，保护机体免受外界环境干扰和 侵害。皮肤创伤是一种常见的健康问题，自古有之，并且发生率较高，如处理不当，会引 起严重问题甚至死亡。因此，寻找促进伤口愈合的药物，是药物研发领域最古老，也是最 重要的挑战之一。
白花檵木(Loropetalum chinens)又称白花檵木，是檵木的一种，是金缕梅科 (Hamamelidaceae)檵木属的常青灌木植物，具有重要的药用价值。白花檵木始载于《植 物名实图考》，具有“愈合止血、涩肠止泻、生肌、消炎、镇痛”之功效，应用于治疗创 伤出血。尽管白花檵木的历史记载、民间用药及相关研究报道均显示白花檵木止血愈合、 促进伤口愈合效果显著，但其功效的物质基础和作用机制尚不清楚。
未见有报道用白花檵木的提取物制备促进伤口愈合的药物。
因此，对白花檵木进行促皮肤愈合研究，寻找有效成分，对于寻找皮肤创伤治疗药物 有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是开发一种用白花檵木提取物为原料制备具有促进伤口愈合的作用的 药物。
所述白花檵木包括白花檵木植物的花、茎、叶、枝。
所述白花檵木的提取物，是用药物可接受的溶剂对白花檵木进行浸提所得的粗提物。
所述白花檵木提取物优选的提取方法是将白花檵木鲜材料破碎，采用组合菌酶解方法 获得白花檵木生物破壁产物，采用动态温浸法提取16小时，得到提取浸膏；先用醇提水 沉法去除绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，得到白花檵木粗 提物，重量为原料重量的5.5-6％。
所述生物组合菌(名称代号D424)，为景德板鸡(ZL92108674.1)制作时的发酵粉， 来源于江西景德板鸡实业公司保存的原菌种荷兰株芽孢。
本发明人以白花檵木及其分离产物为研究对象，采取国际常用的呋喃西林作为阳性对 照，以大鼠皮肤割伤和切除伤作为研究模型展开实验，观察白花檵木促大鼠皮肤伤口愈合 作用，并对有效组分进行促愈合作用筛选，为白花檵木促皮肤愈合物质基础研究奠定工作 基础。
本发明采用的研究方法是：
1、采用液质联用对白花檵木可能的化学成分进行初步分析；
2、对白花檵木粗提物采用大鼠皮肤割伤模型(incision wound model)和切除伤模型 (excision wound model)两种国际常用体内模型研究其促愈合作用。
割伤模型，是指用锐利刀片将皮肤或其他组织割开，能以最小的并行损伤快速破坏组 织完整性。割伤后伤口大小与多种因素有关，如皮下脂肪，伤口处张力大小以及动物种属 等。通过机械方式使伤口闭合，伤口恢复迅速，并且疤块组织生成最少。处理伤口时无论 是用绷带，缝合还是夹住的方法，主要目的均是为了将组织间缝隙缩小至最小，使伤口边 缘能通过肉芽组织和表皮再生而迅速愈合。因此，这种创伤模型最适合于分析伤口愈合强 度；由于受到伤口愈合时体积或面积的限制，该模型不适合用于组织学检测或生化及表皮 再生的评估。
切除伤模型，这种伤口指的是目标区域中有较大体积的组织被移除掉，根据严重程度， 切除伤又可细分为胶带粘除伤，起泡，撕裂伤，全切除伤等。全切除模型指将表皮和真皮 全部切除，直达皮下脂肪层，出血及体液流失更为严重，而且更易被感染。这种模型具有 多种优势，如伤口体积较大，真皮组分均参与愈合过程，只在伤口边缘开始表皮再生，以 及可以对伤口位置进行生化、组织学及细胞增殖研究等。在这一模型中，以初始伤口面积 或体积为基础的伤口愈合速率也是经常被研究的指标。
3、对白花檵木粗提取进行进一步提取：将上述白花檵木粗提物用乙醇提取，将乙醇 提取物用水分散，再分别用选自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇的有机溶剂萃取。并采用大鼠 皮肤割伤模型对不同溶剂萃取后所得的提取物进行促愈合作用的筛选
结果：
1、白花檵木提取物可显著促进大鼠皮肤愈合速度，缩短伤口愈合时间，增加伤口愈 合强度，促进伤口处细胞及血管新生；
2、白花檵木分离提取组分中，石油醚层，乙酸乙酯层和正丁醇层促皮肤愈合作用较 强，提示白花檵木的促愈合作用物质极性较小。
结论：白花檵木具有明显促愈合作用，促愈合作用物质极性较小，主要分布在石油醚 层，乙酸乙酯层和正丁醇层。
附图说明：
图1是白花檵木提取物紫外检测色谱图，其中：Red 254nm，Blue 285nm，Green 360nm.；
图2是白花檵木提取物的离子色谱图：Black：m/z 191(奎尼酸的母核)；Blue：m/z 285 (山萘酚/木犀草素的母核)；Red：m/z 301(槲皮黄酮的母核)；Green：m/z 316(杨梅酮的母 核).；
图3ELC增加切割伤模型恢复第10日的创面皮肤牵拉张力，*P＜0.05，***P＜0.001， 与空白对照组比较；#P＜0.05，与阳性药组比较.数据表示为均值±标准差.n＝5；
图4ELC缩短切除伤模型的创面完全愈合时间，*P＜0.05，***P＜0.001，与空白对 照组比较；#P＜0.05，与阳性药组比较.数据表示为均值±标准差.n＝5；
图5大鼠切除伤创面恢复过程图像记录；
图6大鼠切除伤模型的新生皮肤组织染色切片，模型组(A)，ECL组(B)(40×)；
图7大鼠切除伤模型的新生皮肤组织CD34免疫组化染色结果，模型组(A)，ECL 组(B)(40×)；
图8切割伤模型恢复第10天的创面皮肤的牵拉张力，*P＜0.05，***P＜0.001，与空 白对照组比较.数据表示为均值±标准差.n＝5；
图9切割伤模型恢复第8日的创面皮肤牵拉张力，*P＜0.05，***P＜0.001，与空白对 照组比较.数据表示为均值±标准差.n＝5。
具体实施方式
实施例1白花檵木粗提物的提取及化学成分分析
1、白花檵木粗提物的提取
将白花檵木鲜材料破碎，采用组合菌酶解方法获得白花檵木生物破壁产物，采用动态 温浸法提取16小时，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水 提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花檵木的粗提物初步分离纯化，得到粗提物，重量 为原料重量的5.5-6％。
所述组合菌酶解所用菌种是荷兰株芽孢，来源于景德板鸡发酵粉，由江西景德板鸡实 业公司生产。
原菌种荷兰株芽孢是唯一不产生肠毒素的菌种，经培养，在二次代谢中分离出D429， 过程是肉汤斜面培养。石腊封存2个月后再次分离菌体，并组扩大培养，然后再分离，最 后经扩群，提取其浮生藻，冻干成活性菌体粉。(菌种培养基为肉汤琼脂等)。
具体方法按中国专利200910242020.9和200910242037.4的方法操作。
2、白花檵木化学成分分析
一、样品制备
精称粗提粉末1.06mg，lmL50％甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，即得。
二、色谱条件
高效液相色谱仪：Agilent 1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)， 包括二极管阵列检测器，四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器。
色谱柱：YMC-Pack Pro C18(150mm×3.0mm ID，5μm)；
流动相：A(甲醇)，B(0.1％甲酸H2O)
梯度洗脱(0→35min，A：10％→98％；35min-40m
in，A：98％→98％；)；
流速0.3mL/min；
紫外扫描范围：200-400nm；
检测波长：200-400nm；柱温：40℃。
三、质谱条件
1、质谱仪：Q TRAPTM型四极杆-线性离子阱串联质谱仪(AppliedBiosystems/MDS SCIEX，USA)，离子源：采用负离子检测模式的ESI源。
2、LC-MS测定条件：
液质联用对白花檵木样品进行检测。
白花檵木化学成分初步分析
根据白花檵木样品的紫外色谱图和提取子离子色谱图，白花檵木可能含有的化学成分 推测如下：
表1白花檵木主要化学成分
以下实施例2～4中，实验以白花檵木及其分离产物为研究对象，以大鼠皮肤割伤和 切除伤作为研究模型展开实验，为白花檵木促皮肤愈合物质基础研究奠定工作基础。实验 中所用的材料、设备、实验动物来源如下
1.受试药品
白花檵木粗提物：棕褐色粉末，由江西德宇集团提供(按实施例1方法提供)。
2.阳性对照药
呋喃西林原料药：购自枫柃实验用品专卖店。
3.主要试剂、药品
4.主要设备仪器
5.试剂配制
2％海藻酸钠：称取20g海藻酸钠，分次加入1000ml蒸馏水中并加热，待其溶胀后搅 拌至全溶；
1％呋喃西林：称取0.5g呋喃西林溶于50ml的2％海藻酸钠中，充分搅拌，每隔4天 重新配制；
1％受试物：称取0.5g受试物(如白花檵木，1号组分、2号组分等)溶于50ml的2％ 海藻酸钠中，充分搅拌，每隔4天重新配制。
磷酸盐缓冲液(0.01mol/L PBS)：准确称量8.00g NaCl、0.20g KCl、1.56g Na2HPO4·H2O、0.20g KH2PO4，依次逐个溶解于800ml无菌三蒸水中，磁力搅拌使之完 全溶解；调pH值为7.2～7.4，加无菌三蒸水至1000ml混匀；分装盐水瓶中，8磅15～ 20min高压蒸汽消毒灭菌，4℃贮存备用。
0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0)：称取柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g，溶于 1000mL蒸馏水中，搅拌至全溶，盐酸调pH至6.0。
6动物
Wistar大鼠，雄性，150g-200g，购自中国药品生物制品检定所实验动物资源中心，许 可证号为：SCXK-(京)2009-0017。
实施例2白花檵木促大鼠皮肤割伤模型愈合作用评价
目前国际上常见的用于评价促皮肤愈合效果的体内模型主要有大鼠皮肤割伤模型，切 除伤模型，死腔创面模型(dead space wound model)和烧伤模型四种
本发明以白花檵木及其分离产物为研究对象，以大鼠皮肤割伤和切除伤作为研究模型 展开实验，为白花檵木促皮肤愈合物质基础研究奠定工作基础。
实验方法：
1)15只大鼠，随机分成3组，分别为空白组，呋喃西林组和白花檵木组，每只大鼠 单笼饲养，以防其互相撕咬伤口；
2)适应性饲养三天后，3％戊巴比妥钠麻醉，背部去毛，在每只大鼠背部距中线约 1.5cm处用手术刀划开一条长6cm的伤口，深达皮下(未损伤其筋膜层)，每隔1cm手术 线缝合以防伤口裂开；
3)对各组的伤口涂药：空白组伤口处涂2％海藻酸钠，呋喃西林对照组伤口处涂1％ 呋喃西林，白花檵木组伤口处涂1％白花檵木，每只动物均在头部套上自制的项圈(与宠 物的伊丽莎白项圈类似)，以防其舔舐伤口；
4)每日在3％异氟烷气体麻醉状态下涂药，术后第8天拆除缝合线，术后第10天处 死大鼠，将伤口附近1.5cm范围的皮肤剪下，于中间处分割出伤口长1cm的皮肤3份，用 拉力计(带峰值保存)测将愈合伤口拉开所需的最小拉力，将这3份数据取平均值作为该 只动物伤口的最终拉力。
实验结果：白花檵木促进大鼠皮肤割伤模型伤口愈合
在割伤模型中，我们采用伤口撕裂张力这一指标来评价各组伤口恢复情况。结果显示， 呋喃西林组作为阳性对照，在术后第10天伤口撕裂张力与空白组相比有明显提升，证明 该模型建立成功；白花檵木组(ELC)伤口撕裂张力与空白组相比有极其显著性增加，同 时与呋喃西林组相比，也有明显增加(图3)，表明在相同时间里白花檵木具有促伤口愈合 作用，并且比同浓度下的呋喃西林效果更好。
实施例3白花檵木促大鼠皮肤切除伤模型愈合作用评价
操作方法：
1)15只大鼠，随机分成3组，分别为空白组，呋喃西林组和白花檵木组，每只大鼠 单笼饲养，以防其互相撕咬伤口；
2)适应性饲养三天后，3％戊巴比妥钠麻醉，背部去毛，在每只大鼠背部脊柱单侧稍 靠上部进行约400mm2大小的全皮肤切除(不损伤筋膜层)，在伤口同一平面处放一把尺 子以作为实际大小的参照物，数码相机拍摄，记录伤口初始面积大小；
3)术后伤口处涂药：空白组伤口处涂2％海藻酸钠，呋喃西林组伤口处涂1％呋喃西 林，白花檵木组伤口处涂1％白花檵木，每只动物均在头部套上自制项圈(与宠物的伊丽 莎白项圈类似)，以防其舔舐伤口；
4)每日在3％异氟烷气体麻醉状态下涂药，每隔三天按上述方法对伤口进行拍摄以跟 踪其愈合程度，直至术后15天，坚持每天涂药直至伤口处无任何结疤残留，记录其伤口 愈合天数；
5)在术后第18天将新生皮肤组织剪下，4％多聚甲醛固定，留做染色用。
HE染色观察白花檵木促大鼠皮肤切除伤模型愈合作用
1)脱水：蒸馏水洗3次；70％乙醇2h或过夜；80％乙醇2h或过夜；95％乙醇1h； 100％乙醇1h；二甲苯20min；
2)浸蜡20min；
3)切片至8μm；
4)脱蜡：二甲苯10min；100％乙醇5min；95％乙醇5min；80％乙醇5min；70％乙 醇5min；蒸馏水5min；
5)苏木素染色5-6min蒸馏水过一遍；盐酸水(100ml水加4-5滴浓HCl)过一遍； 自来水冲洗10min以上；蒸馏水过一遍；70％乙醇5-10min；80％乙醇5-10min；
6)伊红染色12min(0.5％用80％乙醇配制)95％乙醇5min×2；100％乙醇5min×2； 二甲苯10min×2；
7)中性树胶封片；
8)正置显微镜下观察。
IHC染色观察白花檵木促大鼠皮肤切除伤模型愈合作用
1)脱蜡：60℃20min；二甲苯I10min、二甲苯II10min。
2)梯度酒精脱水：100％酒精I 5min、100％酒精II 5min、95％酒精3min、80％酒精 3min、70％酒精3min。
3)灭活内源性过氧化物酶：3％H2O2常温下避光孵育10min，PBS冲洗3次×3min；
4)抗原修复：置0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)中煮沸，自然冷却30min以上， 至室温后PBS冲洗3次×3min。
5)封闭：用封闭液(一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液)封闭，常温下 10～30min，倾去勿洗。
6)一抗孵育：滴加适宜浓度的一抗4℃冰箱孵育过夜，37℃复温45min，PBS冲洗 5次×3min；
7)二抗孵育：滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗5次×3min；
8)SP反应：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30min，PBS 冲洗5次×3min；
9)DAB显色：配置DAB/H2O2反应液孵育组织切片，镜下控制染色，一般3～10min， 自来水充分冲洗；
10)常规脱水：50％酒精1-2min、70％酒精1-2min、95％酒精1-2min、95％酒精1-2min、 100％酒精：1-2min、100％酒精：1-2min；
11)透明：二甲苯1×(1-2)min→二甲苯2×(1-2)min；
12)封片：中性树胶；
13)正置显微镜下观察。
实验结果：白花檵木促进大鼠皮肤切除伤模型伤口愈合
由表2可见，白花檵木可显著加速切除伤伤口愈合速度，涂药3天后，白花檵木组伤 口已经愈合了32％，而同期的空白组伤口只愈合了14.5％；在随后的给药时间内，白花檵 木组伤口愈合速度一直快于空白组，第15天时已基本愈合完毕，而同期的空白组愈合达 到94％。呋喃西林作为阳性对照，也表现出明显的促伤口愈合作用，但效果略逊于白花檵 木组。同时我们也可发现，伤口在创伤前期愈合速度较快，在愈合达到90％以后，愈合速 度便明显下降。
表2大鼠皮肤切除伤模型伤口愈合百分百分率
*P＜0.05，***P＜0.001，vs control.Data are expressed as mean±SD.n＝5.
伤口处结疤完全脱落，可被认为伤口已经完全愈合，因此结疤脱落天数是伤口恢复情 况的重要指标。白花檵木组在第13天时出现首只大鼠结疤完全脱落，第15天时已全部脱 落完毕，说明涂药15天后，大鼠伤口已完全愈合；呋喃西林组在第14天时出现首只大鼠 结疤完全脱落，到第16天时已全部脱落完毕；空白组伤口的愈合就明显滞后，在第17天 时出现第一只大鼠伤口结疤完全脱落，到第20天时最后一只大鼠才结疤脱落，说明白花 檵木和呋喃西林确能明显加速伤口愈合速度(图4)。
由图5可见，空白组，呋喃西林组和白花檵木组手术制造的伤口面积基本相同，随着 涂药的时间延长，各组的伤口恢复情况出现了明显不同：第8天时，呋喃西林组和白花檵 木组伤口面积与空白组相比已有明显缩小，在第15天时，呋喃西林组伤口已基本愈合， 白花檵木组伤口已完全愈合，而空白组伤口只愈合了约90％，完全愈合仍需时间。
大鼠伤口新生皮肤组织HE染色结果(图6)显示，空白组新生组织细胞排列较疏松， 胶原纤维生成不明显，上皮生成不完全，表明伤口没有完全愈合；白花檵木组新生组织细 胞排列致密，胶原纤维沉积明显增多，上皮生成完全，成纤维细胞也有明显增加，说明组 织生成比较完全，伤口愈合情况更好。
IHC染色结果(图7)显示，空白组新生皮肤的新生血管较少，炎症细胞仍有大量堆 积，而白花檵木组皮肤新生血管较多，炎症细胞明显减少，表明其伤口恢复情况较空白组 更好。
实验结论
白花檵木粗提取在大鼠割伤模型实验中，涂药10天后：
1、伤口撕裂张力较空白组有明显增加(p＜0.001)，愈合机械强度变大，说明胶原组 织增生，胶原纤维之间交联增多，伤口愈合更充分；
2、与阳性对照呋喃西林组相比，白花檵木抗菌活性有显著性增加，表明同等条件下 白花檵木促愈合作用强于呋喃西林；
白花檵木粗提取在大鼠切除伤模型实验中：
1、伤口愈合速度明显加快，疤块脱落时间明显减小，表明伤口愈合更快；
2、同时新生皮肤HE染色和CD34新生血管IHC染色结果表明，白花檵木组胶原纤 维沉积增多，上皮生成完全，成纤维细胞明显增加，新生血管增多，炎症细胞减少，伤口 愈合更充分。
这两种模型的结果说明白花檵木可显著加速伤口愈合。
实施例4不同溶剂对白花檵木粗提取进一步提取，各提取物促愈合作用研究
将白花檵木粗提物按照如下步骤进行分离提取：
1、白花檵木粉末481.3g，95％乙醇提取2次，溶剂用量分别为3600ml，3000ml，提 取时间均为1h。得170g，得率35.3％。该部分留样9.8g。
2、将95％乙醇提取物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
3、剩余残渣继续用80％乙醇提取1次，所得提取物用水分散，分别用乙酸乙酯、正 丁醇萃取。上述步骤2、3见如下图示。
剩余残渣继续用80％乙醇提取1次，溶剂用量3000ml，提取时间1h，留样9.9g。
选用大鼠割伤模型来筛选白花檵木的提取物的促愈合作用，具体操作步骤同3中所述 的方法，先研究1号及6号受试组分，再根据实验结果，对有促愈合作用的1号组分的进 一步分离提取产物2、3、4、5号组分进行促愈合作用筛选。
筛选方法：
根据上述分离提取方法，1号组分为白花檵木第一步提取物，2-9号组分均是在1号 组分基础上提取分离而来，其中2-5号为1号组分进行水分散萃取后所得到的极性和溶解 性不同的组分，在该步萃取结束后所得残渣继续提纯得到6号组分，6号组分再一次分 离萃取得到7-9号组分。采用大鼠皮肤割伤模型对分离组分进行促愈合作用筛选，由于2-5 号为1号组分的提取物，7-9号组分为6号组分的提取物，故首先对1号、6号进行研究。
筛选结果：
1号组分可明显提高大鼠伤口撕裂张力，显示出促愈合作用；
6号组分也可以提高伤口撕裂张力，但效果不明显，提示促愈合有效成分并没有在提 取1号组分时分离完全，仍有部分残留在6号组分中，但由于其含量很小，所以促愈合作 用不强(图8)。因此，白花檵木促愈合作用成分的寻找可集中于2-5号，而7-9号不需要 进行后续筛选工作。
采用大鼠皮肤割伤模型对2、3、4、5号组分进行促愈合作用筛选，结果表明，2号 石油醚层，3号乙酸乙酯层以及4号正丁醇层伤口撕裂张力较空白组有明显提升，而5号 水层伤口撕裂张力略有上升，但不具有显著性差异，说明促愈合作用成分极性较小，主要 集中于石油醚层，乙酸乙酯层和正丁醇层，由于分离不彻底，在水层略有残余，含量不足 以产生显著性差异(图9)。故后续分离提取可围绕2、3、4号展开。
实验结论
本研究主要采用大鼠皮肤割伤模型和切除伤模型两种国际上常用模型研究白花檵木 促皮肤愈合作用，并采用割伤模型对白花檵木分离物进行促皮肤伤口愈合作用筛选。
对于割伤模型，在涂药10天后即可测其伤口撕裂张力。伤口撕裂张力即将已部分愈 合的伤口完全拉开所需的最小拉力。在伤口愈合之初，撕裂张力较小，伤口两侧只有很小 的力使各自聚合在一起；此后随着胶原生成增多和胶原纤维直接交联形成增加，伤口撕裂 张力迅速增加，胶原生成越多，交联越密，说明伤口恢复越好。
对于切除伤模型，伤口愈合过程伴随着肉芽组织增生及伤口面积缩小，肉芽组织中含 量最多的是肌成纤维细胞，富含肌动蛋白，这些蛋白在收缩时产生机械拉力，将伤口边缘 向中心牵拉，伤口面积逐渐缩小。在组织重建阶段，伤口不断收缩，进而会形成一些表面 疤块组织，如果皮肤组织重建完成，疤块组织即脱落。伤口愈合速度，疤块组织脱落时间 都可作为大鼠皮肤切除伤模型的评价指标。胶原纤维，上皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞 在伤口修复过程中均有重要作用，伤口处血管再生能为组织修复提供营养物质，因此采用 苏木素伊红染色法和CD34新生血管免疫组化染色法观察新生组织中胶原纤维的堆积，上 皮细胞、成纤维细胞的生成及血管新生情况，这些均可反映受损组织的恢复情况。
白花檵木粗提取用不同溶剂进行分离后，在大鼠割伤模型实验中，对各组分进行筛选， 发现：
2号提取物(石油醚层)、3号提取物(乙酸乙酯层)、4号提取物(正丁醇层)对于 提升大鼠伤口撕裂张力均有明显促进作用，提示白花檵木促皮肤愈合的有效成分应该分布 在这三层中；
而5号(水层)组分则无明显效果。
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水，这四者极性由小到大，根据相似相溶原理，白花檵 木中促愈合作用成分应属于极性较小的物质。