交叉参考的相关申请
本申请要求：2010年4月6日提交的第12/754,740号美国专利 申请；2010年4月5日提交的第12/754,140号美国专利申请；2010 年4月1日提交的第12/752,649号美国专利申请；2010年3月25日 提交的第12/731,781号美国专利申请；2009年12月22日提交的第 12/644,146号美国专利申请；和2009年8月31日提交的第61/238,473 号美国临时专利申请；2009年12月3日提交的第61/266,305号美 国临时专利申请；2010年3月24日提交的第61/316,996号美国临时 专利申请和2010年4月14日提交的第61/323,960号美国临时专利申 请的优先权。每一个优先权申请通过引用整体并入本文。
政府资助
本工作部分由来自美国国立卫生研究院的美国国家癌症研究所 的基金2R44CA108083-02A2支持。联邦政府可具有本发明的某些权 利。
领域
本发明涉及优选包含豹蛙酶(Rap)的毒素-抗体构建体(免疫毒素) 的组合物和使用方法，虽然本领域技术人员将会了解，许多毒素和其 它细胞毒素剂在本领域内是已知的并且任何此类毒素或细胞毒素剂 可用于要求保护的组合物和方法。在其它优选的实施方案中，所述构 建体包含抗-肿瘤抗体，例如抗-EGP-1(抗-Trop-2)、抗-CD74、抗-CD22 或抗-CD20。然而，所述组合物和方法并不限于此并且所述抗体或抗 体片段可结合任何靶组织(例如癌细胞、B细胞、T细胞、自身免疫性 疾病细胞、病原体或任何其它疾病相关靶细胞)相关的抗原，针对所 述抗原的抗体在本领域是已知的。
在更优选的实施方案中，免疫毒素是停靠-和-加锁(DNL)构建体， 优选包含4个拷贝的连接至抗体或抗体片段的豹蛙酶。甚至更优选， 毒素或其它细胞毒素剂是融合蛋白，各自包含DDD(二聚化和停靠结 构域)部分并且抗体或抗体片段是包含2个AD(锚定结构域)部分的融 合蛋白。DDD部分自发地形成结合AD部分的二聚体，从而产生包 含4个拷贝的缀合至一个抗体或抗体片段的细胞毒素的DNL构建体。 所得的免疫毒素显示高效力的细胞毒活性并且可将其给患病受试者 施用以杀伤疾病相关细胞。所述免疫毒素显示比单独的亲代抗体、单 独的细胞因子、抗体与细胞毒素的非缀合组合或缀合至对照抗体的细 胞毒素更大的抗靶细胞的效力。
背景
核糖核酸酶，具体地Rap(Lee，Exp Opin Biol Ther 2008；8：813-27) 和其更基本的变体amphinase(Ardelt等人，Curr Pharm Biotechnol 2008：9：215-25)，是潜在的抗-肿瘤剂(Lee和Raines，Biodrugs 2008； 22：53-8)。Rap是最初从美洲豹蛙(Rana pipiens)的卵母细胞分离的104 个氨基酸的单链核糖核酸酶。Rap显示对多种肿瘤细胞系的体外细胞 生长抑制和细胞毒性效应以及体内抗肿瘤活性。两栖动物核糖核酸酶 通过受体介导的胞吞进入细胞，并一旦被内化至细胞溶胶中，就选择 性降解tRNA，导致蛋白质合成的抑制和细胞凋亡的诱导。
Rap已完成随机化IIIb期临床试验，该实验比较Rap+多柔比星 与单独的多柔比星在患有不能切除的恶性间皮瘤的患者中的功效，间 断分析显示组合的MST是12个月，而单一疗法的MST为10个月 (Mutti和Gaudino，Oncol Rev 2008；2：61-5)。可给患者重复施用Rap 而无不利的免疫反应，可逆的肾毒性据报导是剂量限制性的(Mikulski 等人，J Clin Oncol 2002；20：274-81；Int J Oncol 1993；3：57-64)。
可将Rap和其它毒素或细胞毒素辍合至抗体或抗体片段以用于 至所选择的疾病相关细胞例如癌细胞或自身免疫性疾病细胞的靶向 递送。示例性肿瘤相关抗原为EGP-1，也称为Trop-2。
Trop-2是I型跨膜蛋白并且已从人(Fornaro等人，Int J Cancer 1995；62：610-8)和小鼠细胞(Sewedy等人，Int J Cancer 1998；75：324-30) 克隆。除了其作为肿瘤相关钙信号转导蛋白(transducer)的功能(Ripani 等人，Int J Cancer 1998；76：671-6)外，已显示人Trop-2的表达是结肠 癌细胞的肿瘤发生和侵袭力所必需的，所述肿瘤发生和侵袭力可被抗 Trop-2的细胞外结构域的多克隆抗体有效减少(Wang等人，Mol Cancer Ther 2008；7：280-5)。
Trop-2作为实体癌的治疗性靶的日益增加的兴趣(Cubas等人， Biochim Biophys Acta 2009；1796：309-14)通过其它报导得以证明，所述 报导记录了过表达的Trop-2在乳腺(Huang等人，Clin Cancer Res 2005；11：4357-64)、结肠直肠(Ohmachi等人，Clin Cancer Res 2006；12：3057-63；Fang等人，Int J Colorectal Dis 2009；24：875-84)和口 腔鳞状细胞(Fong等人，Modern Pathol 2008；21：186-91)癌中的临床意 义。表达高水平的Trop-2的前列腺基底细胞因体外和体内干细胞样 活性而富集的最新证据是特别值得注意的(Goldstein等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008；105：20882-7)。
鼠抗-Trop-2mAb，mRS7通过使用从手术去除的人肺的原发性鳞 状细胞癌产生的粗制膜制剂作为免疫原，利用杂交瘤技术产生(Stein 等人，Cancer Res 1990；50：1330-6)。冷冻组织切片的免疫过氧化物 酶染色显示：由mRS7确定的抗原存在于肺、胃、膀胱、乳腺、卵巢、 子宫和前列腺的肿瘤中，大多数正常人组织是无反应性的(Stein等人， Int J Cancer 1993；55：938-46)。被mRS7识别的抗原后来经显示为 46-48kDa糖蛋白并且称为上皮糖蛋白-1或EGP-1(Stein等人，Int J Cancer 1994；8：98-102)，其在文献也被称为Trop-2(Ripani等人，Int J Cancer 1998；76：671-6)。在结合靶细胞后，mRS7在2小时内被快速 内化(Stein等人，Int J Cancer 1993；55：938-46)。
在几个早期研究中已显示放射性标记的mRS7有效地靶向和治 疗裸小鼠中的异种移植物(Stein等人，Antibody Immunoconj Radiopharm 1991；4：703-12；Stein等人，Cancer 1994；73：816-23； Shih等人，Cancer Res 1995；55：5857s-63s；Stein等人，J Nucl Med 2001；42：967-74；Stein等人，Crit Rev Oncol Hematol 2001；39：173-80)。 然而，本领域存在对可被连接至Rap或其它细胞毒素以为疾病治疗提 供更有效的试剂的RS7或其它疾病靶向抗体的免疫缀合物(“免疫毒 素”)的需要。
概述
本发明涉及包含缀合至疾病靶向抗体或抗原结合抗体片段的豹 蛙酶(Rap)或其它毒素的免疫毒素的组合物和使用方法。在某些优选 的实施方案中，免疫毒素可具有如图1中示例的构建体(称为 2L-Rap(Q)-hRS7或2L-Rap-hRS7)，其包含两个拷贝的连接至人源化 抗-Trop-2抗体(hRS7)的N末端的Rap。然而，本领域技术人员将了 解，所述免疫毒素不限定于此并且可使用本领域已知的抗其它肿瘤相 关或疾病相关抗原的抗体。此类免疫毒素显示有效的细胞毒性和提高 的药代动力学，同时使Rap的毒性副作用降至最低。
在可选择的实施方案中，本发明的免疫毒素可使用停靠-和-加锁 (DNL)技术来制备并且可包含抗体或抗原结合抗体片段与Rap或其它 毒素或细胞毒素的缀合物。如本文下面所使用的，术语“免疫毒素” 可以是指通过DNL技术制备的免疫毒素，或图1中示例的免疫毒素。 在优选的实施方案中，DNL构建体包含缀合至抗-Trop-2抗体例如 hRS7的Rap。然而，本领域技术人员将意识到，DNL构建体不限定 于此并且本发明的DNL构建体可包含缀合至豹蛙酶或本领域已知的 其它毒素或细胞毒素的抗任何疾病相关抗原的抗体或其片段。
在具体的实施方案中，免疫毒素可包含人源化抗-Trop-2抗体或 其片段，例如hRS7抗体，其包含连接至人抗体构架(FR)和恒定区序 列的重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：1)、 CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO：2)和 CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO：3)以及轻链CDR序列 CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO：4)、CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO：5)和CDR3(QQHYITPLT，SEQ ID NO：6)(参见人，例如，第 7,238,785号美国专利，从第34栏第6行至第44栏第37行通过引用 并入本文)。
在其它具体的实施方案中，免疫毒素可包含人源化抗-CD20抗体 或其片段，例如veltuzumab，其包含轻链可变区CDR1(RASSSVSYIH， SEQ ID NO：7)；CDR2(ATSNLAS，SEQ ID NO：8)；和 CDR3(QQWTSNPPT，SEQ ID NO：9)；以及重链可变区 CDR1(SYNMH，SEQ ID NO：10)；CDR2(AIYPGNGDTSYNQKFKG， SEQ ID NO：11)和CDR3(STYYGGDWYFDV或 VVYYSNSYWYFDV，SEQ ID NO：12)(参见，例如，第7,435,803号 美国专利，从第38栏第15行至第46栏第52行通过引用并入本文)。
在更具体的实施方案中，免疫毒素可包含豹蛙酶(Rap)氨基酸序 列，这在本领域是已知的(参见，例如，NCBI蛋白质数据库登录号 1PU3_A，也参见Gorbatyuk等人，J Biol Chem 279：5772-80，2004)。
在各种实施方案中，免疫毒素可包含一种或多种结合除Trop-2 或CD20外的抗原的抗体或其片段。在优选的实施方案中，所述抗原 可选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、 CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、 CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、 CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、 CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、 CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、 AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、 因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因 子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、 IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、 MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、 生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、 PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
可利用的示例性抗体包括但不限于hR1(抗-IGF-1R，2010年12 月3日提交的第12/722,645号美国专利申请)、hPAM4(抗-粘蛋白，第 7,282,567号美国专利)、hA20(抗-CD20，第7,251,164号美国专利)、 hA19(抗-CD19，第7,109,304号美国专利)、hIMMU31(抗-AFP，第 7,300,655号美国专利)、hLL1(抗-CD74，第7,312,318号美国专利)、 hLL2(抗-CD22，第7,074,403号美国专利)、hMu-9(抗-CSAp，第 7,387,773号美国专利)、hL243(抗-HLA-DR，第7,612,180号美国专利)、 hMN-14(抗-CEACAM5，第6,676,924号美国专利)、hMN-15(抗 -CEACAM6，第7,541,440号美国专利)、hRS7(抗-EGP-1，第7,238,785 号美国专利)和hMN-3(抗-CEACAM6，第7,541,440号美国专利申请)， 每一个引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。本领域技 术人员将了解，该列表不是限制性的并且可使用任何已知的抗体，如 在下面更详细地论述的。
可被整合入免疫毒素的示例性毒素包括但不限于细菌毒素、植物 毒素、蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA 酶)、DNA酶I、葡萄球菌属肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、 白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞杆菌内毒素、豹蛙酶(Rap)和 Rap(N69Q)。每一个引用的毒素的序列在本领域内是已知的(参见例如 NCBI数据库)并且编码许多示例性毒素的克隆可从Invitrogen、美国 典型培养物保藏中心和本领域内已知的其它来源商购获得。
多种实施方案可涉及本发明的免疫毒素用于治疗或诊断疾病的 用途，所述疾病包括但不限于非-何杰金氏淋巴瘤、B细胞急性和慢 性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛细胞白血病， 急性和慢性髓样白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神 经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌症、黑素瘤、肉瘤、神经 胶质瘤和皮肤癌。癌症可选自口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺 道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫 颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸 癌。此外，本发明的免疫毒素可用于治疗自身免疫性疾病例如急性特 发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西 登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、 狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨 -舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后的肾炎 (post-streptococcal nephritis)、结节性红斑、高安(氏)动脉炎(Takayasu′s arteritis)、艾迪生病(Addison′s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、 结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、 关节强硬性脊椎炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s syndrome)、血 栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiteran)、斯耶格伦综合征、原发性胆 汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺毒症、 硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱 疮、韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatisis)、膜性肾病、肌萎缩侧 索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小 球肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。在某些实施方案中，受试抗体可用 于治疗白血病例如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性 髓样白血病或急性髓样白血病。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有代谢疾 病例如淀粉样变性或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的受试者。此 外，本发明的药物组合物可用于治疗患有免疫失调障碍的受试者。
本发明的组合物还可用于感染的治疗性治疗，其中免疫毒素的免 疫球蛋白组分特异性结合致病微生物。在本发明的说明书中，致病微 生物包括致病菌、病毒、真菌和各种寄生虫，并且抗体可靶向这些微 生物、它们的与它们的损伤相关的产物或抗原。微生物的实例包括但 不限于：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟 氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、B型流感 嗜血杆菌(Hemophilis influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、 莱姆病螺旋菌(Lyme disease spirochetes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌 (Brucella abortus)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、破伤风毒 素(Tetanus toxin)、HIV-1、-2、-3、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、 丁型肝炎、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型 和II型、人血清parvo样病毒(Human serum parvo-like virus)、乳头瘤 病毒、多瘤病毒、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)、水痘- 带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、乳头瘤病毒(Papilloma virus)、麻疹病 毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、鼠 白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、 辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)、疣病毒(Wart virus)、蓝舌病毒(Blue tongue virus)、仙台病毒、猫白血病病毒(Feline leukemia virus)、Reo病毒、 脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40(Simian virus 40)、鼠乳房瘤病毒、登 革热病毒、风疹病毒、原生动物、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、 间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、让 氏锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、罗德西 亚锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、 曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japanicum)、牛巴贝虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美耳球虫(Elmeria tenella)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、热带利什曼原虫 (Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、小泰勒虫(Theileria parva)、泡状带绦虫(Taenia hydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛肉绦 虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中 殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、 猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M. arginini)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M. salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。结合这些病原性微生物的 单克隆抗体在本领域是熟知的。
附图简述
下列附图形成本说明书的部分并且被包括以用于进一步说明本 发明的某些实施方案。通过参考与本文中提供的具体实施方案的详细 描述结合的这些附图的一个或多个，可更好地理解所述实施方案。
图1.(Q)-hRS7的分子设计和大小。2L-Rap-X的示意性结构，其 中X是IgG并且Rap可以是Rap(Q)。
图2.使用鲁米诺底物通过ELISA获得的PC-3(A)、Calu-3(B)和 22Rv1(C)的细胞结合曲线。将平均荧光单位对浓度作图，利用Prism 软件分析所得的数据以获得KD的值。
图3.IVTT测定(A)的代表性数据显示(Q)-hRS7和rRap具有相当 的RNA酶活性；且(B)将rRap(左)和(Q)-hRS7(右)活性的初始速率对 酵母tRNA的浓度作图以确定kcat/Km。
图4.通过MTS测定证明的(Q)-hRS7对ME-180(A)和T-47D(B) 显示的体外细胞毒性，以及通过集落形成测定证明的(Q)-hRS7对 (C)DU-145和(D)PC-3显示的体外细胞毒性。利用Prism软件分析(A) 和(B)中的数据以获得EC50的值。
图5.Calu-3人异种移植物模型中证明的(Q)-hRS7抑制肿瘤生长 (A)和增加MST(B)的治疗功效。用1×107C alu-3细胞皮下接种裸小鼠。 当肿瘤达到约0.15cm3时，用50μg的单次静脉内剂量或两次间隔7 天施用的25μg的注射处理小鼠。对照动物接受盐水。
图6显示通过体外转录翻译测定法测定的RNA酶活性。
图7显示竞争性结合测定，该测定证明hLL1和rap-hLL1融合蛋 白对WP，hLL1的抗-独特型抗体具有相同的亲和力。
图8显示融合蛋白在Daudi细胞中的体外细胞毒性：(A)通过MTS 测定法测量的细胞毒性；(B)通过BRdU测定法测量的细胞毒性。
图9显示通过MTS测定法测定的融合蛋白在MC/CAR细胞中的 体外细胞毒性。
图10显示2L-Rap-hLL1-γ4P在初次接受实验的SCID小鼠中的 血液清除。用88Y-DTPA-hLL1(O)和111In-DTPA-2L-Rap-hLL1-γ4P(□) 静脉内共注射初次接受实验的SCID小鼠。在给药后选择的时间上， 通过心脏穿刺使小鼠出血，计数血液样品的放射性。数据表示血液中 注射的剂量的平均±S.D.(n＝3)。
图11显示利用2L-Rap-hLL1-γ4P或组成蛋白质对侵袭性最小的 Daudi淋巴瘤的治疗。用1.5×107个Daudi细胞静脉内接种SCID小鼠 (8-10只小鼠/组)。1天后，以指定的剂量通过2L-Rap-hLL1-γ4P的单 次快速静脉注射治疗小鼠。对照组用相当于50μg免疫毒素的组成蛋 白质或仅用PBS注射。
图12显示通过体外转录/翻译测定法测量的RNA酶活性。将 rRap(■)、2L-Rap-hLL1-γ4P(▲)和hLL1-γ4P(◆)的浓度对相对发光单位 (RLU)作图。
图13显示利用免疫毒素连续处理的或在1小时处理后通过洗涤 处理的DNL-Rap免疫毒素构建体的体外细胞毒性。
图14显示DNL-Rap免疫毒素构建体在所有细胞系中的体外细胞 毒性。
详述
定义
除非另外明确地指出，否则″一″或″一个″可指“一个或多个”。
本文所使用的术语“和”与“或”可用于合取(conjunctive)或析取 (disjunctive)。也就是说，除非另有说明，否则这两个术语应当理解为 等同于“和/或”，除非另有说明。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实 例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫 调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、 光敏剂、染料和放射性同位素。
“诊断剂”是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断 剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如带有生物素-链霉抗生物素 蛋白复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI) 的增强剂(例如顺磁离子)。
本文所使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或经标准免疫球 蛋白基因片段重组方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或 免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗 体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、 鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。 完整裸抗体的Fc部分可提供效应子功能，例如补体结合和ADCC(参 见，例如，Markrides，Pharmacol Rev 50：59-87，1998)。裸抗体籍以 诱导细胞死亡的其它机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton，Ann Allergy Asthma Immunol 81：105-119，1998.)。
“抗体片段”是完整抗体的部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、 Fv、sFv、scFv、dAb等。无论其结构如何，抗体片段所结合的抗原 与完整抗体所识别的抗原相同。抗体片段包括由可变区组成的分离的 片段(例如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段)或重组单链多肽分子 (其中轻链和重链可变区由肽连接体连接(“scFv蛋白”))。“单链抗 体”(通常缩写为“scFv”)由包含相互作用以形成抗原结合部位的VH和 VL结构域的多肽链组成。VH和VL结构域通常由1至25个氨基酸残 基的肽连接。抗体片段还包括双链抗体、三链抗体和单结构域抗体 (dAb)。
如果所施用的剂量具有生理上的意义时，就可以说是以“治疗有 效量”施用抗体或免疫毒素制剂或本文所述的组合物。如果试剂的存 在导致受体受试者的生理状态的可检测的变化，则该试剂就具有生理 上的意义。在具体的实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗肿瘤反 应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和症状时，该抗体制剂就具有生 理上的意义。生理意义的效果也可以是诱发受体受试者的体液和/或 细胞免疫反应，导致靶细胞的生长抑制或死亡。
抗体和抗体片段
用于制备实际上抗任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域是 公知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和 Coligan等人(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1 卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)。简而言之，可通过如 下获得单克隆抗体：用包含抗原的组合物注射小鼠，取出脾脏以获得 B淋巴细胞，将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克 隆杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的克隆，培养产生针对所述 抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物分离抗体。
可利用多种完善的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类 分离技术包括利用蛋白A琼脂糖的亲和层析、大小排阻层析和离子 交换层析。参见，例如，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页的Coligan。 此外，参见Baines等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG)，”in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)。
在初始产生针对免疫原的抗体后，可测定抗体的序列，随后通过 重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和表征对于本领域技 术人员来说是公知的。衍生自人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的抗体 成分的使用排除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体为重组蛋白质，其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗 体的互补性决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区取代。当给受试者施用 时，嵌合抗体显示出免疫原性降低而稳定性增加。用于克隆鼠免疫球 蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad. Sci.USA 86：3833(1989)中。用于构建嵌抗体的技术对于本领域技术 人员来说是公知的。作为例子，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994) 通过将编码鼠LL2(抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA 序列与分别的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合抗体。
人源化抗体
用于产生人源化MAb的技术在本领域内是公知的(参见，例如， Jones等人，Nature 321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332： 323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人， Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech. 12：437(1992)和Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。可通过将 小鼠CDR自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移入人抗体的 相应可变结构域来人源化嵌合或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的 小鼠构架区(FR)也用人FR序列取代。由于简单地将小鼠CDR转移 入人FR中通常导致抗体亲和力的减少或甚至丧失，因此为了恢复鼠 抗体的原始亲和力可能需要额外的修饰。这可通过将FR区中的一个 或多个人残基用它们的鼠对应物替代以获得对其表位具有良好结合 亲和力的抗体来实现。参见，例如Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。通常，与 它们的鼠对应物不同并且紧位于或接触一个或多个CDR氨基酸残基 的那些人FR氨基酸残基可以是替代的候选者。
人抗体
用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生 完整人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等人，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin. Phamacol.3：544-50)。还可利用基因或染色体转染法以及噬菌体显示 技术(所有所述技术在本领域内都是已知的)构建完整人抗体。参见例 如McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)。这样的完整人抗体预 期表现出比嵌合抗体或人源化抗体更少的副作用并且如基本上内源 的人抗体一样在体内起作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和 过程可使用通过此类技术而产生的人抗体。
在一个替代实施方案中，噬菌体显示技术可用于产生人抗体(例 如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可 从正常人或表现出特定疾病状态如癌症的人中制备(Dantas-Barbosa 等，2005)。从患病个体中构建人抗体的有利方面在于循环抗体全库 可能对针对疾病相关抗原的抗体具有偏好性。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建 了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体显示文库。一般而言， 总RNA获自循环血淋巴细胞(Id.)。从μ、γ和κ链抗体全库中克隆重 组Fab，并将其插入噬菌体显示文库(Id.)。RNA可通过使用对重链和 轻链免疫球蛋白序列特异的引物转化为cDNA，并用于制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。文库构建按 Andris-Widhopf等(2000，在Phage Display Laboratory Manual，Barbas 等(编)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY pp.9.1至9.22中)进行。最终的Fab片段用限制性核酸内 切酶消化，然后插入噬菌体基因组以制备所述噬菌体显示文库。此类 文库可使用本领域已知的标准噬菌体显示方法进行筛选(参见，例如， Pasqualini and Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999， The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
可以以多种形式实施噬菌体显示，关于它们的综述，参见例如 Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。还可利用体外活化的B细胞产生人抗体。参见， 第5,567,610号和第5,229,275号美国专利，将所述专利通过引用整体 并入本文。本领域技术人员将会了解，这些技术是示例性的并且可利 用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一替代实施方案中，使用标准的免疫实验方案，经过基因工 程改造以产生人抗体的转基因动物可用于产生针对基本上任何免疫 靶的抗体。用于从转基因动物获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)和Taylor等人， Int.Immun.6：579(1994)公开。此系统的非限制性示例为 Abgenix(Fremont，CA)的(例如，Green等人，1999，J. Immunol.Methods 231：11-23)。在和相似动物中，小鼠抗 体基因已被失活，并替换为功能性人抗体基因，但是鼠免疫系统的剩 余部分仍保持完整。
已转化了种系配置的YAC(酵母人工染色体)，该 YAC包含部分人IgH和IgK基因座，包括可变区序列的大部分区域， 以及辅助基因和调控序列。人可变区库可用于制备产生抗体的B细 胞，而B细胞可通过已知技术融合至杂交瘤。用靶抗原免疫的 将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过 上述标准技术进行收获和/或产生。有多个种系的可用， 每个种系均能产生不同类别的抗体。转基因产生的人抗体已显示出治 疗潜力，并保留了正常人抗体的药代动力学特性(Green等，1999)。 本领域技术人员将会了解，要求保护的组合物和方法并不限于使用 系统，而是可以使用已经过基因工程改造来产生人抗体 的任何转基因动物。
抗体片段
可利用已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体 的抗原结合部分例如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。可通 过胃蛋白酶降解抗体分子来产生F(ab’)2片段，并且可通过还原 F(ab’)2片段的二硫桥来产生Fab′片段。可选择地，可构建Fab′表达文 库(Huse等人，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速且容易地鉴 定具有期望的特异性的单克隆Fab′片段。可通过木瓜蛋白酶消化抗 体来产生F(ab)2片段，并且通过二硫化物还原来获得Fab片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结 构域缔合以形成靶结合部位。这两个结构域通过肽连接体(L)进一步 共价连接。用于制备scFv分子和设计适当的肽连接体的方法公开于 第4,704,692号美国专利，第4,946,778号美国专利，R.Raag和M. Whitlow，“Single Chain Fvs.”FASEB第9卷：73-80(1995)以及R.E. Bird和B.W.Walker，“Single Chain Antibody Variable Regions，” TIBTECH，第9卷：132-137(1991)中。
用于产生单结构域抗体(DAB)的技术在本领域也是已知的，如例 如Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51：253-259)(通过引用并入本 文)中公开的。
可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E.coli)或另一种宿 组中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可利用常规方法通 过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解全长抗体来获得抗体片段。此类方法由 例如Goldenberg，第4,036,945号和第4,331,647号美国专利以及本文 中包括的参考资料描述。此外，参见Nisonoff等人，Arch Biochem. Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman 等人，in METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)和第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页的Coligan。
已知的抗体
使用的抗体可从许多已知的来源商购获得。例如，多个抗体分泌 型杂交瘤品系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas， VA)。大量抗不同疾病靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏 在ATCC和/或具有公布的可变区序列，并且可获得用于要求保护的 方法和组合物。参见，例如，第7,312,318；7,282,567；7,151,164； 7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803； 7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598； 6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018； 6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244； 6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533； 6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625； 6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580； 6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226； 6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206； 6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681； 6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,15；6,716,966； 6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355； 6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852； 6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279； 6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618； 6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227； 6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408； 6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356； 6,455,044；6,455,040，6,451,310；6,444,206’6,441,143；6,432,404； 6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091； 6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654； 6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244； 6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393； 6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289； 6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554； 5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953， 5,525,338号美国专利，其实施例部分通过引用并入本文。这些仅是 示例性的并且许多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域是已知的。本 领域技术人员将会了解，抗几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体 分泌型杂交瘤可通过就抗所选择的疾病相关目标靶的抗体简单地搜 索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库来获得。可使用本领域公知的 标准技术扩增克隆的抗体的抗原结合结构域，将其切割，然后连接入 表达载体，转移入适当的宿主细胞，并且用于蛋白质生产。
免疫缀合物
在某些实施方案中，可将抗体或其片段缀合至一种或多种治疗剂 或诊断剂。治疗剂不必相同而是可以不同，例如药物和放射性同位素。 例如，可将131I掺入抗体或融合蛋白的酪氨酸和连接至赖氨酸残基的 ε氨基的药物。还可将治疗剂和诊断剂连接至例如还原型SH基团和/ 或糖类侧链。用于制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非 共价缀合物的许多方法在本领域是已知的并且可利用任何这样已知 的方法。
可通过二硫键的形成在还原型抗体成分的铰链区上连接治疗剂 或诊断剂。可选择地，可使用异双功能交联剂例如N-琥珀酰基3-(2- 吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)连接此类试剂。Yu等人，Int.J.Cancer 56： 244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是公知的。参见， 例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，“Modification of Antibodies by Chemical Methods，”in MONOCLONAL ANTIBODIES： PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编)，第187-230页 (Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，”in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。可选择地，可通过抗体的Fc区中的糖类部分缀合治疗 剂或诊断剂。糖基可用于增加与巯基结合的相同试剂的装载，或糖类 部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
用于将肽经由抗体的糖类部分缀合至抗体成分的方法对于本领 域技术人员来说是公知的。参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41： 832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)和Shih等人， U.S.Patent No.5,057,313，将所述文献通过引用整体并入本文。一般 方法包括使具有氧化型糖类部分的抗体组分与具有至少一个游离胺 功能的载体聚合物反应。该反应导致产生最初的希夫碱(亚胺)键合， 其可通过还原成仲胺以形成最终的缀合物来获得稳定。
如果用作免疫缀合物的抗体成分的抗体是抗体片段，那么Fc区 可以不存在。然而，可能将糖类部分引入全长抗体或抗体片段的轻链 可变区。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)； Hansen等人，U.S.Patent No.5,443,953(1995)，Leung等人，第6,254,868 号美国专利，将所述文献和专利通过引用整体并入本文。将基因工程 改造的糖类部分用于连接治疗剂或诊断剂。
在某些实施方案中，可将螯合剂连接至抗体、抗体片段或融合蛋 白，然后用于螯合治疗剂或诊断剂例如放射性核素。示例性螯合剂包 括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。 用于螯合剂的缀合和使用其将金属或其它配体连接至蛋白质的方法 在本领域是公知的(参见，例如，例如第7,563,433号美国专利，其实 施例部分通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，可通过与具有长尾的试剂反应来将放射性金 属或顺磁离子连接至蛋白质或肽，可将多个用于结合离子的螯合基团 连接至所述长尾。这样的尾可以是聚合物例如多聚赖氨酸、多糖或其 它具有侧基的衍生多聚物或可衍生链，所述侧基可结合已知可用于此 用途的螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等。
可将螯合剂直接连接至抗体或肽，例如如第4,824,659号美国专 利(其通过引用并入本文)中公开的。特别有用的金属-螯合剂组合包括 与在60至4,000keV的一般能量范围内的用于放射性成像 (radioimaging)的诊断同位素(例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、 18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br )一起使用 的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与非放射性金属例 如锰、铁和钆络合时，相同螯合剂可用于MRI。大环螯合剂，如NOTA、 DOTA和TETA，可用于多种金属和射电金属，特别是分别用于镓、 钇和铜放射性核素。通过根据目标金属调节环的大小，可使此类金属 -螯合剂络合物非常稳定。可包括其它环类型的螯合剂，例如大环聚 酯，其被关注用于稳定地结合核素例如223Ra(对于RAIT)。
最近，已公开了用于PET扫描技术的18F-标记的方法，例如通过 F-18与金属或其它原子例如铝的反应来进行。可将18F-Al缀合物与 螯合基团例如DOTA、NOTA或NETA络合，所述螯合基被直接连接 至抗体或在预靶向方法中被用于标记可靶向的构建体。这样的F-18 标记技术公开于第7,563,433号美国专利中，将其实施例部分通过引 用并入本文。
包含豹蛙酶(Rap)的免疫毒素
Rap至肿瘤靶向抗体或抗体片段的缀合或融合是有前景的增强 其效力的方法，如首先对于LL2-豹蛙酶(Newton等人，Blood 2001；97：528-35)(包含Rap和鼠抗-CD22单克隆抗体(mAb)的化学缀合 物)和随后对于2L-Rap-hLL1-γ4P(参见，例如，下文中的实施例2)(包 含Rap和人源化抗-CD74mAb的融合蛋白(Stein等人，Blood 2004；104：3705-11))所证明的。
用于产生2L-Rap-hLL1-γ4P的方法允许我们开发一系列结构相 似的免疫毒素(通常称为2L-Rap-X)，其全部都由两个Rap分子组成， 每一个分子通过柔性连接体连接至目的抗体(X)中的一个L链的N 端。我们也已通过用其Rap的非糖基化形式(称为Rap(Q)，以表示 Asn69上的潜在糖基化位点被改变成Gln(或Q，单字母代码))替代Rap 产生相同设计的另一系列免疫毒素(称为2LRap(Q)-X)。对于该两个系 列，我们将IgG制备为IgG1(γ1)或IgG4(γ4)，并且使其阻止IgG4半 分子的形成(Aalberse和Schuurman，Immunology 2002；105：9-19)，我 们将IgG4的铰链区(S228)中的丝氨酸残基转换成脯氨酸(γ4P)。 2L-Rap-X或52L-Rap(Q)-X的示意性结果示于图1中。该设计取决于 对Rap的N端上的焦谷氨酸残基(该残基对于RNA酶要具有完全功 能是必需的)的需要(Liao等人，Nucleic Acids Res 2003；31：5247-55)。
为了开发mRS7作为表达Trop-2的实体癌的潜在治疗剂的功用， 通过将mRS7的互补决定区移植至人IgG1构架上(Qu等人，Methods 2005；36：84-95)和融合至Rap(Q)，从而导致在下文中缩写为(Q)-hRS7 的2L-Rap(Q)-hRS7来制备人源化RS7(hRS7)。
在下文实施例中描述的工作中，我们通过显示(Q)-hRS7(i)可在哺 乳动物宿主中产生并且可被纯化至均质，(ii)保持hRS7的结合特异 性和亲和力以及Rap的RNA酶活性，(iii)在纳摩尔浓度上体外抑制 多种表达Trop-2的癌细胞系的增殖和(iv)体内抑制人肺肿瘤异种移植 物的生长来显示：Rap或Rap(Q)至肿瘤靶向mAb的N末端融合是被 证明是有效的且多能的产生新型免疫毒素的方法。
本领域技术人员将承认，适合用于本发明的细胞毒性RNA酶部 分包括具有天然豹蛙酶结构的多肽和其所有酶促活性变体。此类分子 有利地具有对于RNA酶活性似乎是必需的N末端焦谷氨酸残基并且 基本上不被哺乳动物RNA酶抑制剂抑制。编码天然细胞毒性RNA 酶的核酸可通过适当序列的克隆和限制，或使用利用聚合酶链式反应 (PCR)的DNA扩增来制备。美洲豹蛙豹蛙酶的氨基酸序列可获自 Ardelt等人，J.Biol.Chem.，256：245(1991)，并且编码天然豹蛙酶 或其保守修饰的变异的cDNA序列可通过与用于hLL2人源化的en bloc V-基因装配法相似的方法来基因合成。(Leung等人，Mol. Immunol.，32：1413，1995)。制备细胞毒性RNA酶变体的方法在本 领域是已知的并且在本领域技术人员的能力之内。
可选择地，编码细胞毒性RNA酶或其变体的核酸可在体外合成。 化学合成法产生单链寡核苷酸。可通过与互补序列杂交，或通过使用 短引物和以所述单链作为模板，利用DNA聚合酶的聚合作用将该单 链寡核苷酸转化成双链DNA。虽然化学合成最适合于约100个碱基 的序列，但可通过连接更短的序列来获得更长的序列。下文中的实施 例2提供了用于获得细胞毒性RNA酶基因的一个示例性方法。
停靠和加锁(DNL)法
“停靠-和-加锁”(DNL)法利用cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的调 节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的 特定的蛋白质间相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264. Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA(在被最 详尽研究的通过第二信使cAMP与R亚基的结合触发的信号传导途 径之一中起着中心作用)于1968年首次从兔子分离(Walsh等人，J.Biol. Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由两个催化亚基组成，这两个亚 基通过R亚基维持无活性形式(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。 发现PKA的同功酶类具有两类R亚基(RI和RII)，并且每一类具有α 和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。R亚基只以稳定的 二聚体被分离，而且已显示二聚化结构域由前44个氨基端残基组成 (Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚基的结合 导致用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述 释放通过PKA经由其与AKAP的停靠的区室化被定向至所选择的底 物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
由于第一AKAP，微管结合蛋白2，于1984年得以表征(Lohmann 等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，在酵母至人类的物种 范围中已鉴定出了超过50种具有不同结构的定位至不同亚细胞位置 (包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网)的 AKAP(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA的 AKAP的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem. 1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个体AKAP中是相当多变的， 所报道的对RII二聚体的结合亲和力范围为2至90nM(Alto等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。有趣地，AKAP将只结合二聚 R亚基。对于人RII，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面 (Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的 二聚化结构域和AKAP结合结构域都位于相同的N末端44个氨基酸 序列中(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人， EMBO J.2001；20：1651)，所述氨基酸序列在本文中称为DDD。
作为连接模块(Linker Modules)的人RIIα的DDD和AKAP的AD
我们已开发了这样的平台技术，其利用人PKA RIIα的DDD和 AKAP蛋白的AD作为一对优良的连接模块以用于将在下文中称为A 和B的实体的任何组合停靠至非共价复合物中，非共价复合物可通 过将半胱氨酸残基引入DDD和AD两者的战略位置上以促进二硫键 的形成而进一步锁入稳定束缚的结构中。“停靠-和-加锁”法的一般方 法如下。通过将DDD序列与A的前体连接(结果产生在下文中称为a 的第一组分)来构建的实体A。因为DDD序列可引起二聚体的自发形 成，因此A可由a2组成。可通过将AD序列与B的前体连接(结果产 生在下文中称为b的第二组分)来构建实体B。a2中包含的DDD的 二聚基元可产生用于与b中包含的AD序列结合的停靠位点，从而促 进a2与b的容易缔合以形成由a2b组成的三聚复合物。这样的结合 事件因后续反应而不可逆地进行，所述后续反应通过二硫桥共价保护 了所述两个实体，所述反应基于有效的局部浓缩的原理非常有效地发 生，因为起始结合相互作用应当使置于DDD和AD上的反应性硫醇 基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以便进 行位点特异性连接。在某些实施方案中，a2亚单位可包含2个相同的 效应物部分，例如抗体、抗体片段或细胞毒素，各自连接至相同的 DDD序列。三聚a2b复合物可包含两个拷贝的第一效应物部分和一 个拷贝的第二效应物部分。
通过连接远离前体的官能团的DDD和AD，此类位点特异性连 接预期保持前体的原始活性。该方法本质上是模块并且潜在地可用于 位点特异性和共价地连接许多种物质。DNL法公开于第7,550,143号； 第7,521,056号；第76,534,866号；第7,527,787号和第7,666,400号 美国专利中，每一个专利的实施例部分通过引用并入本文。虽然在优 选的实施方案中DNL复合物可包含三聚体结构，但在可选择的实施 方案中，其它化学计量也是可能的，例如4个拷贝的毒素部分和1个 拷贝的抗体或抗体片段。
在优选的实施方案中，效应物部分是可与DDD或AD部分连接 与形成融合蛋白或肽的蛋白质或肽，更优选抗体、抗体片段或毒素。 用于制备融合蛋白的多种方法是已知的，包括核酸合成、杂交和/或 扩增以产生编码目的融合蛋白的合成双链核酸。可利用标准分子生物 学技术(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)将此类双链核酸插入用于融合蛋白产生的表 达载体。在此类优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分与效应 蛋白或肽的N末端或C末端连接。然而，本领域技术人员将会知道， AD或DDD部分至效应物部分的连接的位点可取决于效应物部分的 化学性质而变化，并且效应物部分的部分牵涉其生理活性。在最优选 的实施方案中，AD或DDD部分至抗体或抗体片段的连接可在重链 亚单位的C末端、来自抗原结合部位的分子的相对末端上发生。然 而，如下文中所论述的，也可使用至抗体或抗体片段的N末端连接， 同时保持抗原结合活性。可使用本领域已知的技术例如使用二价交联 试剂和/或其它化学缀合技术来进行多种效应物部分的位点特异性连 接。
DDD和AD序列变体
在某些实施方案中，整合入免疫毒素DNL构建体的AD和DDD 序列包含下文中的DDD1和AD1的氨基酸序列。在更优选的实施方 案中，AD和DDD序列包含DDD2和AD2的氨基酸序列，所述序列 经设计促进DDD与AD部分之间二硫键的形成。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREAR A(SEQ ID NO：13)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREA RA(SEQ ID NO：14)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：16)
本领域技术人员将会了解，DDD1和DDD2包含蛋白激酶A的 人RIIα形式的DDD序列。然而，在可选择的实施方案中，DDD和 AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP 序列，如下文中的DDD3、DDD3C和AD3中所举例说明的。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFER LEKEEAK(SEQ ID NO：17)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFL REYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：18)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：19)
还可设计和利用基于已知的人RIβ和RIIβ氨基酸序列的其它可 选择的DDD部分(参见，例如，NCBI登录号NP_001158233和 NP_002727，下文中的序列)。
人PKA RIβ氨基酸序列
MASPPACPSE EDESLKGCEL YVQLHGIQQV LKDCIVHLCI SKPERPMKFL
REHFEKLEKE ENRQILARQK SNSQSDSHDE EVSPTPPNPV VKARRRRGGV
SAEVYTEEDA VSYVRKVIPK DYKTMTALAK AISKNVLFAH LDDNERSDIF
DAMFPVTHIA GETVIQQGNE GDNFYVVDQG EVDVYVNGEW VTNISEGGSF
GELALIYGTP RAATVKAKTD LKLWGIDRDS YRRILMGSTL RKRKMYEEFL
SKVSILESLE KWERLTVADA LEPVQFEDGE KIVVQGEPGD DFYIITEGTA
SVLQRRSPNE EYVEVGRLGP SDYFGEIALL LNRPRAATVV ARGPLKCVKL
DRPRFERVLG PCSEILKRNI QRYNSFISLT V(SEQ ID NO：20)
人PKA RIβ氨基酸序列
MSIEIPAGLT ELLQGFTVEV LRHQPADLLE FALQHFTRLQ QENERKGTAR
FGHEGRTWGD LGAAAGGGTP SKGVNFAEEP MQSDSEDGEE EEAAPADAGA
FNAPVINRFT RRASVCAEAY NPDEEEDDAE SRIIHPKTDD QRNRLQEACK
DILLFKNLDP EQMSQVLDAM FEKLVKDGEH VIDQGDDGDN FYVIDRGTFD
IYVKCDGVGR CVGNYDNRGS FGELALMYNT PRAATITATS PGALWGLDRV
TFRRIIVKNN AKKRKMYESF IESLPFLKSL EFSERLKVVD VIGTKVYNDG
EQIIAQGDSA DSFFIVESGE VKITMKRKGK SEVEENGAVE IARCSRGQYF
GELALVTNKP RAASAHAIGT VKCLAMDVQA FERLLGPCME IMKRNIATYE
EQLVALFGTN MDIVEPTA(SEQ ID NO：21)
在其它可选择的实施方案中，AD和/或DDD部分的不同序列变 体可用于免疫毒素DNL构建体的构建。AD与DDD结构域的结构- 功能关系一直是调查研究的主题。(参见，例如，Burns-Hamuro等人， 2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001，J Biol Chem 276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50； Hundsrucker等人，2006，Biochem J 396：297-306；Stokka等人，2006， Biochem J 400：493-99；Gold等人，2006，Mol Cell 24：383-95； Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408，每一个文献的完整文 本通过引用并入本文)。
例如，Kinderman等人(2006)检验了AD-DDD结合相互作用的晶 体结构并且得出人DDD序列包含许多保守氨基酸残基，所述氨基酸 残基在二聚体形成和AKAP结合中特别重要，在下列的序列中加下 划线。(参见Kinderman等人，2006的图1，所述文献通过引用并入 本文)。本领域技术人员将理解在设计DDD序列的序列变体中，期望 地避免改变任何加下划线的残基，然而可对对于二聚化和AKAP结 合不太紧要的残基进行保守氨基酸替代。因此，用于构建DNL构建 体的潜在可选择的DDD序列示于SEQ ID NO：22中，其中“X”表示保 守氨基酸替代。保守氨基酸序列替代在下文中进行更详细的论述，但 可包括例如天冬氨酸残基替代谷氨酸残基或者亮氨酸或缬氨酸残基 替代异亮氨酸残基等。此类保守氨基酸替代在本领域是公知的。
来自蛋白激酶A的人DDD序列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREAR A(SEQ ID NO：13)
XXIXIXXXLXXLLXXYXVXVLXXXXXXLVXFXVXYFXXLX XXXX(SEQ ID NO：22)
Alto等人(2003)进行了多种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学 分析以设计下文中显示的称为AKAP-IS的RII选择性AD序列，其 具有0.4nM的对DDD的结合常数。AKAP-IS序列被设计为结合PKA 的AKAP的肽拮抗剂。其中替代倾向于减少与DDD的结合的 AKAP-IS序列中的残基在下列的序列中加下划线。因此，本领域技 术人员将会了解，可发挥DNL构建体的功能的变体由SEQ ID NO：23 指示，其中“X”是保守氨基酸替代。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
XXXXXAXXIVXXAIXXX(SEQ ID NO：23)
类似地，Gold(2006)利用晶体学和肽筛选来开发下文中显示的 SuperAKAP-IS序列，其显示对PKA的RII同种型的选择性高出对 RI同种型的选择性5个数量级。加下划线的残基表示相对于AKAP-IS 序列的氨基酸替代的位置，所述替代增加与RIIα的DDD部分的结合。 在该序列中，N末端Q残基被编号为残基4并且C末端A残基是残 基号20。其中可进行替代以影响对RIIα的亲和力的残基为残基8、 11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些可选择的 实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列替代AKAP-IS AD部分序列以 制备细胞毒性DNL构建体。可被用于替代AKAP-IS AD序列的其它 可选择的序列示于下文中。加下划线标示相对于AKAP-IS序列的替 代。预期，关于AKAP-IS序列，AD部分还可包括额外的N末端残 基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：24)
可选择的AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：25)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：26)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：27)
Gold等人的图2公开了下文中显示的来自多种AKAP蛋白的额 外DDD-结合序列。
RII-特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：28)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：29)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：30)
RI-特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：31)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：32)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：33)
Dual-特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：34)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：35)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：36)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：37)
Stokka等人(2006)还开发了下文中显示的结合PKA的AKAP的 肽竞争剂。所述肽拮抗剂被命名为Ht31、RIAD和PV-38。Ht-31肽 显示更大的对PKA的RII同种型的亲和力，而RIAD和V-38显示更 大的对RI的亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：38)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：39)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：40)
Hundsrucker等人(2006)还开发了结合PKA的AKAP的其它肽竞 争剂，具有低至0.4nM的对PKA的RII形式的DDD的结合常数。多 种AKAP拮抗性肽的序列提供于下文中复制的Hundsrucker等人的表 1中。
表1AKAP肽序列
AKAPIS表示合成RII亚基结合肽。所有其它肽衍生自所示 AKAP的RII结合结构域。
肽序列
AKAPIS QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
AKAPIS-P QIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQ ID NO：41)
Ht31 KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQ ID NO：42)
Ht31-P KGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQ ID NO：43)
AKAP7δ-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：44)
AKAP7δ-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：45)
AKAP7δ-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：46)
AKAP7δ-P-pep PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：47)
AKAP7δ-PP-pep PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQ ID NO：48)
AKAP7δ-L314E-pep PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQ ID NO：49)
AKAP1-pep EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQ ID NO：50)
AKAP2-pep LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQ ID NO：51)
AKAP5-pep QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQ ID NO：52)
AKAP9-pep LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQ ID NO：53)
AKAP10-pep NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQ ID NO：54)
AKAP11-pep VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQ ID NO：55)
AKAP12-pep NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQ ID NO：56)
AKAP14-pep TQDKNYEDETQVALALVEDVINYA(SEQ ID NO：57)
Rab32-pep ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQ ID NO：58)
在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基通过参考下 列AKAP IS序列在下文中加下划线标示。除了C末端丙氨酸残基的 添加外，所述残基与由Alto等人(2003)观察到的相同。(参见 Hundsrucker等人(2006)的图4，将所述文献通过引用并入本文)。具有 特别高的对RII DDD序列的亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、 AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
Carr等人(2001)检验了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合 DDD序列之间的序列同源性程度并且鉴定了DDD序列中似乎在不 同DDD部分中最高度保守的残基。这些可通过参考人PKA RIIα DDD 序列在下文中加下划线标示。特别保守的残基进一步由斜体字标示。 所述残基与由Kinderman等人(2006)提出的对于结合AKAP蛋白重要 的那些残基重叠，但不与其相同。因此，在SEQ ID NO：59中指示潜 在的DDD序列，其中“X”表示保守氨基酸替代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREAR A(SEQ ID NO：13)
XHIXIPXGLXELLQGYTXEVLRXQPXDLVEFAXXYFXXLXEX RX(SEQ ID NO：59)
本领域技术人员将会了解，一般而言，这些在来自不同蛋白质的 DDD和AD序列中高度保守的氨基酸残基是可以优选在产生氨基酸 替代中保持恒定的残基，然而不太高度保守的残基可以被更容易改变 以产生本文中描述的AD和/或DDD序列的序列变体。
除了DDD和/或AD部分的序列变体外，在某些实施方案中，可 以优选在抗体部分或连接抗体与AD序列的连接体肽序列中引入序 列变异。在一个举例说明性实例中，融合蛋白序列的3个可能变体示 于下面。
(L)
QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：60)
(A)
QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：61)
(-)
QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：62)
氨基酸替代
在某些实施方案中，所公开的方法和组合物可包括具有一个或多 个替代的氨基酸残基的蛋白质或肽的产生和使用。可通过取代一个或 多个氨基酸残基来最优化天然抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体 或AD或DDD序列的结构、物理和/或治疗特征。例如，众所周知可 通过用亲代鼠抗体的相应FR氨基酸替代有限数目的人构架区(FR)氨 基酸来改善人源化抗体的功能特征。当构架区氨基酸残基与CDR残 基十分靠近时，这种情况尤其正确。
在其它情况下，可通过有限数目的氨基酸替代最优化抗体的治疗 特性，例如对靶抗原的结合亲和力、抗体与其靶抗原的离解或解离速 率或甚至抗体对CDC(补体依赖细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞 毒性)的诱导的效率。
在可选择的实施方案中，可进一步最优化用于产生本发明的 DNL构建体的DDD和/或AD序列，例如以增加DDD-AD结合亲和 力。上文中论述了DDD或AD序列中的潜在序列变异。
本领域技术人员将会意识到，一般而言，氨基酸替代通常包括用 具有相对相似的性质的另一种氨基酸替代氨基酸(即，保守氨基酸替 代)。不同氨基酸的性质和氨基酸替代对蛋白质结构和功能的影响一 直以来是本领域内广泛研究和知识的主题。
例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte & Doolittle，1982，J.Mol. Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成了所得蛋白质的二 级结构，这反过来确定了蛋白质与其它分子的相互作用。每一种氨基 酸基于其疏水性和电荷特征被赋予亲水指数(Kyte & Doolittle，1982)， 这些氨基酸是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙 氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)； 甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)； 脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸 (-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在产生保守替 代中，其亲水性指数在±2内的氨基酸的使用是优选的，其亲水性指 数在±1内的是更优选的，其亲水性指数在±0.5内的是进一步更优选 的。
氨基酸替代也可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，第4,554,101号 美国专利)。亲水性值已被赋予给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸 (+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)； 谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨 酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)； 亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸 (-3.4)。用具有相似亲水性的其它氨基酸来替代氨基酸是优选的。
其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有体积大的侧链的 氨基酸例如色氨酸或酪氨酸替代具有紧凑侧链的氨基酸例如甘氨酸 或丝氨酸通常不是优选的。也要考虑不同氨基酸残基对蛋白质二级结 构的影响。通过经验研究，不同氨基酸残基对蛋白质结构域采取α- 螺旋、β-折叠片或反转二级结构的倾向的影响已被确定并且在本领域 内是已知的(参见，例如，Chou & Fasman，1974，Biochemistry， 13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys. J.，26：367-384)。
基于这样的考虑和广泛的经验研究，保守氨基酸替代的表达已被 构建并且在本领域内是已知的。例如，精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天 冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸。可选择地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys； Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser； Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、 arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile； Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、 tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、 phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
对于氨基酸替代的其它考虑包括残基是否位于蛋白质的内部或 是否暴露于溶剂。对于内部残基，保守替代可包括：Asp和Asn；Ser 和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu； Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp.(参见，例如，rockefeller.edu 上的PROWL网站)。对于暴露于溶剂的残基，保守替代可包括：Asp 和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro； Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和 Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr.(Id.)。已构建多种矩阵来帮助 选择氨基酸替代，例如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham 矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、 Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同前)。
在测定氨基酸替代中，也可考虑分子间或分子内键的存在，例如 带正电荷的残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷的残基(例如，Asp、 Glu)之间离子键的形成或附近半胱氨酸残基之间二硫键的形成。
用任何氨基酸替代编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸的方 法是公知的并且对于本领域技术人员来说只不过是常规实验，例如通 过定点诱变的技术或通过合成和装配编码氨基酸替代的寡核苷酸，然 后将其拼接入表达载体构建体来进行。
治疗剂
在可选择的实施方案中，可使用治疗剂，将其缀合至本发明的免 疫毒素，或在免疫毒素施用之前、同时或之后分开地施用其，所述治 疗剂是例如细胞毒素剂、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、 激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体药物、毒素、酶或其它试 剂。使用的药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶、烷化剂、抗代谢 物、抗生素、生物碱、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合的药 物特性。
使用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那 曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素1、白 消安、加利车霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西 乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、 SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、 多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星 (2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表 柔比星、雌莫司汀、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、 葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基 -FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转化酶抑制剂、 吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天门冬酰胺酶、来那 度胺、亚叶酸钙、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、6-巯基嘌呤、 甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、硝基 脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、 雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬、泰素、替莫 唑胺(DTIC的含水形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、 塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春瑞滨、长春碱、长 春新碱和长春花生物碱。
使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核 糖核酸酶(RNA酶)，例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商 陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内 毒素。
使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和 IP-10。
在某些实施方案中，可使用抗-血管生成剂例如血管生长抑素 (angiostatin)，baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、 抗VEGF抗体、抗-PlGF肽和抗体、抗-血管生长因子抗体、抗Flk-1 抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF(巨 噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原 激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、 IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋 白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他 (Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素α、除莠霉 素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide(利诺胺)、沙利度 胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、 accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、 AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、 造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小 板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、 造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞-集落刺激因 子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如 干扰素-α、-β或-γ以及干细胞生长因子例如命名为“S1因子”的干细胞 生长因子。细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人 生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素 原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺 刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤 维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β； 苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相关肽； 抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)； 神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例 如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EP0)； 骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如 巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或 FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因 子和LT。
使用的放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、 62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、 161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、 75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、 199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选具有在60至6,000keV范围内 的衰变能，俄歇发射体的衰变能优选为60至200keV范围内，β发 射体的衰变能优选为100-2,500keV，α发射体的衰变能优选为 4,000-6,000keV。有用的β粒子辐射核素的最大衰变能优选为 20-5,000keV，更优选地为100-4,000keV，最优选地为500-2,500keV。 基本上通过辐射俄歇粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。例如， Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、 1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β粒子辐射核素的衰变能 优选为＜1,000keV，更优选地为＜100keV，最优选地为＜70keV。基 本上通过产生α粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性 核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、 Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α粒子 辐射的放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选地为 3,000-8,000keV，最优选地为4,000-7,000keV。使用的其它潜在放射 性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、 113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、 165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、 199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。 某些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、 86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可包括光敏剂或染料。已使用荧光组合物例如荧光染料和 其它发色团或染料(例如对可见敏感的卟啉)来检测和治疗病变，即用 合适的光照射病变部位。在治疗中，这被称为光辐射、光疗或光动力 疗法。参见Jori等人(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem. Britain(1986)，22：430。此外，已将单克隆抗体与光敏染料偶联，用 于进行光疗。参见Mew等人，J.Immunol.(1983)，130：1473；idem.， Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1986)，83：8744；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；
其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，特别是优选导向抗癌基因和 癌基因产物例如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优 选形式为siRNA。
诊断剂
诊断剂优选选自放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、 荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏试剂。此类诊断剂 是公知的并且可使用任何此类已知的诊断剂。诊断剂的非限定性实例 可包括放射性核素例如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、 67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、 131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、 72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它γ、β或正电子发射体。使用的 顺磁离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、 铷(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒 (III)。超声造影剂可包括脂质体例如气体填充的脂质体。不透射线的 诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。许多种荧光 标记物在本领域是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、 藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。使用的化学 发光标记物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐 或草酸酯。
治疗性治疗的方法
不同的实施方案涉及治疗受试者例如哺乳动物(包括人、驯养或 伴侣宠物例如狗和猫)的癌症的方法，包括给所述受试者施用治疗有 效量的细胞毒性免疫缀合物。
在一个实施方案中，可利用本发明的免疫毒素治疗的免疫疾病可 包括例如关节疾病例如强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、类风湿 关节炎；神经疾病例如多发性硬化和重症肌无力；胰腺疾病例如糖尿 病，特别是青少年型糖尿病；胃肠道疾病例如慢性活动型肝炎、乳糜 泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、恶性贫血；皮肤病例如银屑病或硬皮 病；变应性疾病例如哮喘和移植相关病症例如移植物抗宿主病和同种 异体移植物排斥。
可通过同时或相继地施用治疗有效量的另一种抗体(所述抗体结 合靶细胞表面上的另一种抗原或与所述抗原反应)来补充细胞毒性免 疫缀合物的施用。优选的其它MAb包含至少一种人源化MAb、嵌合 MAb或人MAb，其选自与如下物质反应的MAb：CD4、CD5、CD8、 CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、 CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、 CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、 EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、 MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Flt-3、 VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、生腱蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、 补体因子C5、癌基因产物或其组合。使用的不同抗体例如抗-CD19、 抗-CD20和抗-CD22抗体对于本领域技术人员来说是已知的。参见， 例如，Ghetie等人，Cancer Res.48：2610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol. 8：353(1996)，第5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7,109,304； 7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7,282,567； 7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804号美国专利； 和第20080131363；20070172920；20060193865和20080138333号美 国专利申请公布，将上述每一篇的实施例部分通过引用并入本文。
还可通过同时或相继地施用至少一种治疗剂来进一步补充免疫 毒素疗法。例如“CVB”(15g/m2环磷酰胺，200-400mg/m2依托泊苷和 150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非-何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti 等人，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。其它适当的联合化学治疗方案 对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Freedman等人， ″Non-Hodgkin′s lymphomas，″in CANCER MEDICINE，第2卷，第3 版，Holland等人(编)，第2028-2068页(Lea & Febiger 1993)。作为举 例说明，用于治疗中度非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方 案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环 磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方 案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春 新碱、地塞米松和亚叶酸)，而适当的第三代方案是MACOP-B(甲氨 蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)。 其它有用的药物包括苯基丁酸盐、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。
可按已知方法配制本发明的免疫毒素以制备药学上有用的组合 物，由将免疫毒素与药学上适宜的赋形剂组合在混合物中。无菌的磷 酸盐缓冲液即为药学上适宜的赋形剂的一个实例。其它适当的赋形剂 对本领域技术人员为公知。参见，例如，Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂型和药物递送系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)， 和Gennaro(编)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷 明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修 订版本。
可将本发明的免疫毒素配制用于静脉内施用，通过例如推注注射 或连续输注。优选，在短于约4小时的时期内，更优选短于约3小时 的时期内输注免疫毒素。例如，可在30分钟内，优选甚至15分钟内 输注前25-50mg，在随后的2-3小时内输注剩余部分。注射用制剂可 呈单位剂型，例如装在安瓿中，或者装在多剂量容器中并且添加防腐 剂。组合物可采用例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液剂或乳 液的形式，并且可含有配方剂(formulatory agents)例如悬浮剂、稳定 剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可呈粉剂形式，用于在使用前 用适当的媒介物(例如无菌无热原水)配制。
可将其它制药方法用于控制免疫毒素的作用持续时间。控释制剂 可通过使用生物相容性聚合物络合或者吸附免疫毒素来实现。例如， 生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体 和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10： 1446(1992)。从此基质上释放的速率取决于该免疫毒素的分子量、基 质内的免疫毒素的量和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys.J. 55：163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型描述于Ansel 等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂型和药物递送系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro编，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
还可将免疫毒素皮下或甚至通过其它胃肠外途径施用至哺乳动 物。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选， 在短于约4小时的时期内，更优选在短于约3小时的时期内输注免疫 毒素。
更常见，用于人的免疫毒素的施用剂量取决于诸如患者年龄、体 重、身高、性别、总体健康状况和先前的治疗历史等因素而变化。可 能需要向受者提供约1mg/kg至25mg/kg范围内的免疫毒素的剂量作 为单次静脉内输注，但是也可根据情况需要施用更低或更高的剂量。 对于70kg患者按1-20mg/kg施用的剂量例如为70-1,400mg，或对于 1.7米的患者，剂量为41-824mg/m2。可按需要重复此剂量，例如， 每周一次，持续4-10周，或每周一次，持续8周或每周一次，持续4 周。还可以更低的频率给药，例如每隔一周一次，持续数月，或每月 一次或每季度一次，持续多月，如维持疗法中所需的。
可选择地，以每2或3周一个剂量施用免疫毒素，重复总共至少 3个剂量。或者，每周两次施用所述构建体，持续4-6周。如果将剂 量减少至约200-300mg/m2(每个剂量340mg(对于1.7米的患者)或 4.9mg/kg(对于70kg的患者)，可每周施用一次或甚至二次，持续4 至10周。可选择地，可减少疗程剂量，即每2或3周一次，持续2-3 个月。然而，已确定甚至可以通过缓慢的静脉内输注施用更高的剂量 (例如每周一次或每2-3周一次20mg/kg)，进行重复的给药循环。可 以任选地以其它间隔重复给药方案，并且可通过不同胃肠外途径(对 剂量和时间安排进行适当的调整)提供剂量。
在优选的实施方案中，免疫毒素用于癌症的治疗。癌症的实例包 括但不限于癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、 骨髓瘤或淋巴样恶性疾病肿瘤(lymphoid malignancies)。下文中指出此 类癌症的更具体的实例，包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、 尤因肉瘤、Wilms瘤、星形细胞瘤、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞 肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌(gastric cancer)或胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、 卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝细胞癌、神经内分泌瘤、甲状腺髓 样癌(medullary thyroid cancer)、分化的甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、 结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌症或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌 症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞还未迁移至除了原始恶 性肿瘤或肿瘤的位置外的受试者的身体的位置的恶性细胞或肿瘤)和 继发性恶性细胞或肿瘤(例如，通过恶性细胞或肿瘤细胞至与原始肿 瘤的位置不同的继发性位置的转移、迁移产生的恶性细胞或肿瘤)。 适合于本发明的治疗方法的癌症包括表达、过表达或异常表达 IGF-1R的细胞。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：儿童急性淋巴细胞白 血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原 发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成 人急性髓样白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成 人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS- 相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、直肠癌、星形细胞瘤、胆管癌、 膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管的癌 症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细 胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、脑星形细胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、 宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴 母细胞白血病(Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia)、儿童急性髓 样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤(Childhood Cerebellar Astrocytoma)、儿童小脑星形细胞瘤Childhood Cerebral Astrocytoma)、儿童颅外生殖细胞肿瘤(Childhood Extracranial Germ Cell Tumors)、儿童何杰金氏病(Childhood Hodgkin′s Disease)、儿童何 杰金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童淋巴细胞白血 病(Childhood Lymphoblastic Leukemia)、儿童髓母细胞瘤(Childhood Medulloblastoma)、儿童非-何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始 神经外胚瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、 儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白 血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌 症、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺 癌、颅外胚细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外胚细胞瘤 (Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、 高歇氏病(Gaucher′s Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌 (Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠瘤(Gastrointestinal Tumors)、 生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞 癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症(Hypergammaglobulinemia)、 下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西 氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾 病(Lymphoproliferative Disorders)、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性 间皮瘤(Malignant Mesothelioma)、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、 间皮瘤、转移性潜伏的原发性鳞状颈癌(Metastatic Occult Primary Squamous Neck Cancer)、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Primary Squamous Neck Cancer)、转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer)、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常 综合征、髓性白血病(Myelogenous Leukemia)、髓样白血病(Myeloid Leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、非黑素 瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Occult Primary Metastatic Squamous Neck Cancer)、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维 肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、 卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、胰腺癌、副蛋白血症 (Paraproteinemias)、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬 细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma)、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾 盂和输尿管癌(Renal Pelvis and Ureter Cancer)、视网膜母细胞瘤、横 纹肌肉瘤、涎腺癌、肉状瘤病肉瘤、赛扎里氏综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌 (Squamous Neck Cancer)、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T 细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌 (Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis and Ureter)、肾盂和输尿管 移行细胞癌(Transitional Renal Pelvis and Ureter Cancer)、滋养细胞肿 瘤(Trophoblastic Tumors)、输尿管和肾盂细胞癌(Ureter and Renal Pelvis Cell Cancer)、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和 下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞 瘤和任何其它过度增殖性疾病，除瘤形成形成外，都位于上面所列的 器官系统中。
本文中描述的和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶 化前状态以及用于阻止至瘤形成状态(neoplastic state)或恶性状态(包 括但不限于上述那些障碍)的进展。此类用途适用于已知或怀疑进行 至瘤形成或癌症，特别是其中由超常增生、化生(metaplasia)或最特别 地发育不良组成的非瘤形成细胞生长已发生的疾病(关于此类异常生 长条件的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版， W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976))的进展的状态。
发育不良通常是癌症的先兆，并且主要见于上皮中。其为非瘤形 成细胞生长的最紊乱形式，包括个体细胞一致性和细胞的构造朝向 (architectural orientation)的损失。当存在慢性刺激或炎症时，发育不 良特征性地发生。可被治疗的发育不良障碍包括但不限于无汗性外胚 层发育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)、异侧发育不良 (anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良 (atriodigital dysplasia)、支气管肺发育不良、脑发育不良(cerebral dysplasia)、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不全、 先天性外胚叶发育不良、颅骨骨干发育异常(craniodiaphysial dysplasia)、颅腕跖骨发育不全(craniocarpotarsal dysplasia)、颅骨干骺 端发育不全(craniometaphysial dysplasia)、牙本质发育异常(dentin dysplasia)、骨干发育不全(diaphysial dysplasia)、外胚层发育不良 (ectodermal dysplasia)、釉质发育不全(enamel dysplasia)、脑性眼球发 育不全(encephalo-ophthalmic dysplasia)、偏侧骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis multiplex)、点状骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis punctata)、上皮 发育不良(epithelial dysplasia)、面-指(趾)-生殖器发育不良 (faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常(familial fibrous dysplasia of jaws)、家族性白色皱襞发育异常(familial white folded dysplasia)、肌纤维发育不良(fibromuscular dysplasia)、骨纤维异 常增殖症(fibrous dysplasia of bone)、旺盛骨性发育不良(florid osseous dysplasia)、遗传性肾脏-视网膜发育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、出汗性外胚层发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia)、少 汗性外胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia)、淋巴细胞减 少性胸腺发育不全(lymphopenic thymic dysplasia)、乳房发育不良 (mammary dysplasia)、下颌面发育不良(mandibulofacial dysplasia)、干 骨后端发育不良(metaphysial dysplasia)、蒙底尼发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性发育不良(monostotic fibrous dysplasia)、粘膜 上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育不良 (multiple epiphysial dysplasia)、眼-耳-脊椎综合征 (oculoauriculovertebral dysplasia)、眼-牙-指(趾)发育不良 (oculodentodigital dysplasia)、眼椎骨发育不全(oculovertebral dysplasia)、牙体发育异常(odontogenic dysplasia)、 opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨质结构不良(periapical cemental dysplasia)、多骨纤维发育不良(polyostotic fibrous dysplasia)、 假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良(retinal dysplasia)、隔- 视神经发育不良(septo-optic dysplasia)、脊椎骨骺发育不全 (spondyloepiphysial dysplasia)和ventriculoradial dysplasia。
可被治疗的另外的肿瘤前障碍包括但不限于良性过度增生性障 碍(例如，良性肿瘤、纤维囊性状态、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及 食道发育不良)、白斑、角化病、鲍温病、农民皮肤病(Farmer′s Skin)、 日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症特别是上文所 列的那些癌症的生长、进展和/或转移。
其它过度增殖性疾病、障碍和/或状态包括但不限于恶性肿瘤和 相关障碍的进展和/或转移，所述恶性肿瘤和相关障碍是例如白血病 (包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包 括成髓细胞白血病)、前髓细胞性白血病)、骨髓单核细胞性白血病)、 单核细胞白血病)和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细 胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例 如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨 球蛋白血症、重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症例如纤维肉 瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉 瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤 因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢 癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、 乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、 肝细胞瘤(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、 肾母细胞瘤((Wilm′s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、 膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽 管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神 经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母 细胞瘤。
表达载体
其它实施方案可涉及包含编码免疫毒素例如DNL构建体的抗 体、抗体片段、毒素或组成融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白 可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或毒素。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。所述载体可 包含编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区以及铰链区的序列，可将 该序列与嵌合、人源化或人可变区序列连接。所述载体可额外地包含 在所选择的宿主细胞中表达编码的蛋白质的启动子、增强子和信号序 列或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和 重链恒定区及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地将 同种异型位置上的氨基酸的至少一个改变成在不同IgG1同种异型中 发现的氨基酸，并且其中任选地可用丙氨酸替代基于EU编号系统的 EU的重链的氨基酸253。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。在其它实施方案中，可将IgG1序列转变成IgG4 序列。
本领域技术人员将会了解，基因工程改造表达载体和插入宿主细 胞以表达工程蛋白质的方法在本领域是公知的并且只不过是常规实 验。已在例如第7,531,327号和第7,537,930号美国专利(其各自的实 施例部分通过引用并入本文)中描述了用于表达克隆的抗体或片段的 宿主细胞和方法。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适合用于治疗或诊断患者的患病组织 的组分的试剂盒。示例性试剂盒可包含一种或多种本文中描述的免疫 毒素。如果包含施用组分的组合物未制成通过消化道(如通过口服递 送)递送，则试剂盒还可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分 的设备。一种用于施用例如肠胃外递送的设备类型为注射器，其用于 将所述组合物注射到受试者体内。也可使用吸入设备。在某些实施方 案中，可以以装有无菌液体制剂或冻干制剂的预装注射器或自动注射 笔(autoinjection pen)的形式提供治疗剂。
所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多个容 器中。在某些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建 (reconstitution)的组合物的无菌、冻干制剂的管形瓶。试剂盒还可包 含适用于重建和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。其它可使用 的容器包括但不限于：袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装并 保存在所述容器中。可包括的另一组成部分为给使用试剂盒的人员的 使用说明。
实施例
下列实施例被提供用以举例说明，但不限定本发明的权利要求。
实施例1.被人源化、内化、抗-Trop-2抗体靶向的豹蛙酶(Frog RNase)具有抗不同人上皮癌细胞的有效细胞毒性
本文中显示包含重组束缚至人源化抗-Trop-2抗体的两栖动物核 糖核酸酶的新型免疫毒素展示体外抗多种人上皮癌细胞系(例如宫颈 癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌)以及体内抗人肺 癌异种移植物的广泛且强有力的抗增殖活性。
摘要
我们在本文中公开了命名为2L-Rap(Q)-hRS7的新型基于IgG的 免疫毒素，其包含Rap(Q)(除去假定的N糖基化位点的Rap的突变形 式)和hRS7(抗Trop-2(在多种上皮癌中过表达的细胞表面糖蛋白)的内 化人源化抗体)。不同测试，包括大小排阻HPLC、SDS-PAGE、流式 细胞术、RNA酶活性、内化、细胞成活力(cell viability)和集落形成论 证该免疫毒素的纯度、分子完整性、对结合几种不同的表达Trop-2 的细胞系的hRS7的可比较的亲和力以及在纳摩尔浓度上抑制这些细 胞系的生长的效力。2L-Rap(Q)-hRS7也在荷有Calu-3人非小细胞肺 癌异种移植物的裸小鼠的预防模型中抑制肿瘤生长，中位存活时间 (MST)从55天增加至96天(P＜0.01)。这些结果证明了2L-Rap(Q)-hRS7 作为多种表达Trop-2的癌症例如宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、 卵巢癌和前列腺癌的治疗剂的优良功效。
材料与方法
细胞系和细胞培养宫颈癌品系(ME-180)、乳腺癌品系(T-47D、 MDA-MB-468、SK-BR-3)、前列腺癌品系(DU-145、PC-3、22Rv1)、 肺腺癌品系(Calu-3)、胰腺癌品系(Capan-1、BxPC-3和AsPc-1)和卵巢 癌品系(SK-OV-3)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并 且将其在37℃、5％CO2下培养于补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、 2mM L-谷氨酰胺、200个单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。
抗体和试剂Milatuzumab(hLL1，抗-CD74)、hRS7、重组豹蛙酶 (rRap)和小鼠抗-Rap IgG来自Immunomedics。异硫氰酸荧光素 (FITC)-、藻红蛋白(PE)-或辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗-人 (GAH)或山羊抗-小鼠(GAM)IgG、Fc-特异性抗体购自Jackson ImmunoResearch Labs(West Grove，PA)。缀合至Alexa Fluor 488的 GAH IgG、缀合至Alexa Fluor 568的人转铁蛋白和Hoechst 33258均 获自Molecular Probes(Invitrogen，Carlsbad，CA)。全部限制性内切酶 获自New England Biolabs(Beverly，MA)。
载体的构建用于表达2L-Rap-hLL1-γ4P的质粒 pdHL2-Rap-L-hLL1-γ4P的构建描述于下文实施例2中。表达载体 pdHL2-Rap(Q)-L-hLL1-γ4P通过用Rap(Q)替代Rap从 pdHL2-Rap-L-hLL1-γ4P衍生，并且用于表达(Q)-hRS7的质粒 pdHL2-Rap(Q)-L-hRS7-γ1通过将Rap(Q)基因从 pdHL2-Rap(Q)-L-hLL1-γ4P亚克隆到pdHL2-hRS7-γ1载体中而得以构 建。简而言之，使用适当的引物，通过PCR在hRS7 VL基因的N末 端(5’)侧引入EcoRV限制性酶切位点。将包含前导肽-Rap-连接体的 pdHL2-Rap(Q)-L-hLL1-γ4P的XbaI-EcoRV片段与通过PCR产生的包 含hRS7 VL基因的EcoRV-BamHI片段连接入中间载体 pBS-Rap(Q)-L-hRS7。pdHL2-hRS7-γ1的Xba-BamHI片段替换为 pBS-Rap(Q)-L-hRS7的Xba-BamHI片段。
转染和选择pdHL2-Rap(Q)-L-hRS7-γ1载体(30μg)用Sal I来进行 线性化，然后通过电穿孔方法转染入Sp2/0细胞，将所述细胞培养在 补充有10％Low-IgG FBS、100个单位/mL青霉素和100μg/mL链霉 素、2mM L-谷氨酰胺、1μM丙酮酸钠、100μM必需氨基酸和0.05μM 甲氨蝶呤(MTX)的完全杂交瘤无血清培养基中。使用缀合HRP的 GAH IgG、Fc-特异性抗体，通过ELISA分析来自存活细胞的孔的培 养上清液的融合蛋白的表达。扩增阳性克隆并且将其冷冻以待将来使 用。
表达和纯化将细胞培养在转瓶中至最终的培养(10-20％的成活 力)。将上清液过滤，然后用于先前用含有20mM Tris-HCl和100mM NaCl的pH 8.5缓冲液平衡的蛋白A柱子。加载后，用100-mM柠檬 酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤柱子，然后用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5) 进行洗脱以获得融合蛋白。使用3M Tris-HCl，pH 8.5将包含产物的 峰调整至pH 7.0，针对40mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行透析。浓缩 后，将产物通过0.22μm滤器过滤，于2-8℃下贮存。
大小排阻HPLC和SDS-PAGE分析使用购自BioRad(Hercules， CA)的Zorbax柱子通过大小排阻HPLC，以及使用4-20％Tris-甘氨酸 凝胶(Gold Precast Gels，Cambrex，Rockland，ME)在还原性 条件下通过SDS-PAGE评估(Q)-hRS7的纯度和分子完整性。
体外转录和翻译(IVTT)测定通过按照制造商的说明书使用 Quick Coupled Transcription/Translation系统(Promega， Madison，WI)测量从头合成的荧光素酶的活性来在无细胞系统中测定 RNA酶活性。简而言之，向8μL含有甲硫氨酸和荧光素酶-对照DNA 的Quick Master Mix中加入2μL的浓度范围在10pM至100nM 之间的各种测试样品，将其在30℃下于96孔圆底板中温育2小时， 从所述孔中取出2μL用于在黑色96孔平底板中利用50μL Bright-Glo 底物进行分析。在Envision化学发光读数器上读取板。将相对荧光素 酶单位(RLU)对测试样品的浓度作图。
酵母tRNA降解测定还可通过测量使用酵母tRNA(Invitrogen) 作为底物形成的高氯酸可溶性核苷酸的量来测定RNA酶活性 (Newton等人，Blood 2001；97：528-35)。用不含RNA酶的水(Ambion， Austin，TX)在1.5-mL无RNA酶Eppendorf管中制备每一个样品，以 在100μL的终体积中包含5nM(Q)-hRS7或rRap；10mM HEPES，pH 6.0；200μg/mL人血清白蛋白；和范围在100μg/mL(3.09μM)至 600μg/mL(18.54μM)之间的预定浓度的tRNA。在37℃下进行酶促反 应2小时，通过在冰上向每一个样品中加入233μL 3.4％的冰冻高氯 酸来终止反应。10分钟后，在冷室中以12,000rpm在微量离心机中 离心样品10分钟。从每一个样品的上清液中取出等分，用水稀释10 倍，以水为空白对照，测量来自所述稀释液的260nm处的光密度 (OD)。通过将对应的OD值除以反应时间(7200秒)来计算每一个底物 浓度的初始速率，将其针对底物浓度作图，以测定kcat/Km，根据米 -门二氏方程(Michaelis-Menten equation)其在Km＞＞[S]的条件下，应 当等于所得的最小二乘方线除以总酶浓度(对于rRap，5nM以及对于 (Q)-hRS7，10nM)的斜率。
细胞结合测量如下将基于ELISA的方法用于评估(Q)-hRS7对 所选择的细胞系的结合。将细胞涂布在黑色96孔平底板(1×105个细 胞/孔；100μL/孔)并且在37℃下于5％CO2潮湿培养箱中温育过夜。 第二天，将含有细胞的板从培养箱取出，将培养基轻拍出孔，然后通 过在纸巾上轻轻拍打干燥。随后每一个孔接受50μL新鲜生长培养基。 在测定培养基(RPMI 1640；10％FBS完全培养基)中进行(Q)-hRS7的 系列1∶4稀释(200nM至1.9×10-4nM)，以一式三份向对应的孔(终浓度 100nM至0.95×10-4nM)中加入(50μL/孔)。在4℃下温育1.5小时后， 将板以600×g离心2分钟，在除去培养基后将其在纸巾上进行印迹干 燥(blotted dry)，通过向每一个孔内加入150μL冰冷培养基，然后以 600×g离心2分钟来进行洗涤。除去培养基，将板进行印迹干燥。以 1∶20,000的稀释度使用HRP-缀合的GAH抗体，随后将其加入所有孔 (100μL/孔)。对于本底对照，一组孔只接受细胞+二抗。将板在4℃下 温育1小时。然后，将板离心和印迹干燥。随后用冰冻培养基洗涤细 胞2次，然后用冰冻PBS洗涤第3次。每一次洗涤后，重复离心、 培养基去除和板印迹的过程。
在最后的洗涤步骤后，将LumiGLO(KPL，Gaithersburg，MD) 加入所有孔(100μL/孔)，使用Envision板读数器读取板的发光。使用 GraphPad Prism软件分析数据以测定表观亲和力(apparent affinity)，其 为对应半最大饱和度的浓度。在每一个实验中，hRS7和hLL1被包 括分别作为阳性和同种型对照。可选择地，使用制造商的试剂、方案 和软件，在Guava PCA(Guava Technologies，Inc.，Hayward，CA)上 通过流式细胞术测定(Q)-hRS7与人癌细胞系的结合。对于每一个细 胞系，使用hRS7和hLL1平等地进行类似研究。简而言之，获得待 分析的不同细胞系的约5×105个细胞，将其悬浮在PBS/1％BSA(牛血 清白蛋白)中。将细胞离心，重悬浮于100μL含有10μg/mL(Q)-hRS7、 hRS7或hLL1的PBS/1％BSA中，在4℃下温育45分钟。在用PBS/1％ BSA洗涤2次(每一次洗涤后进行离心)后，将细胞重悬浮于50μL缀 合FITC的GAH，Fc特异性抗体(1∶25的稀释度)，然后在4℃下温育 30分钟。在用PBS/1％BSA洗涤2次并且悬浮于0.5mL PBS/1％BSA 中后通过流式细胞术分析细胞。为了将死细胞与活细胞分离，加入 1μg/mL碘化丙啶。对于每一次分析，需要10,000个分析。
细胞增殖测定将肿瘤细胞接种在96孔板(1×104个细胞/孔)中，将 其与0.01至100nM的试验品一起温育72小时。随后按照制造商的方 案，使用可溶性四唑盐MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧 基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]测定活细胞的数目。使用GraphPad Prism软件分析来自剂量-反应曲线的数据以获得EC50值(50％抑制发 生时的浓度)。
集落形成测定使细胞经历胰蛋白酶处理，然后涂布在60-mm培 养皿(1×103个细胞)中。用每一个试验品处理细胞，使其形成集落。 每4天1次加入含有试验品的新鲜培养基，在2周的温育后，将集落 于4％甲醛中固定，用吉姆萨(Diemsa)染色。在显微镜下计数超过50 个细胞的集落。
通过荧光显微镜检查进行的内化研究将ME-180细胞置于(2000 个细胞于500μL/孔中)8孔Lab-TekTM II培养腔室载玻片(NalgeNunc International，Naperville，IL)中，用(Q)-hRS7(10μg/mL)或hRS7(6μg/mL) 在37℃下温育16小时。在室温下进行所有后续步骤。在用PBS/2％ BSA洗涤两次后或用PBS/2％BSA洗涤2次然后用0.1M甘氨酸， pH 2.5(500μL，2分钟)洗涤2次后，将细胞在4％福尔马林中固定15 分钟，用PBS洗涤2次，然后用小鼠抗-Rap mAb，接着用缀合PE 的GAM、Fc特异性抗体探测，或直接用缀合FITC的GAH、Fc特 异性抗体探测，以使用荧光显微镜来显示(Q)-hRS7或hRS7的定位。
如下进行阐明(Q)-hRS7的亚细胞定位的二次研究。将缀合Alexa Fluor 568的人转铁蛋白(hTf)和(Q)-hRS7(10μg/mL)或hRS7(6μg/mL) 一起加入置于(3000个细胞于500μL/孔中)8孔培养腔室载玻片中的 MDA-MB-468人乳腺癌细胞。在于37℃下温育2小时后，如上所述 洗涤和固定细胞，然后在室温下用缀合Alexa Fluor 488的GAH IgG 处理15分钟。在用PBS洗涤2次后，用Hoechst 33258在室温下处 理细胞15分钟，洗涤细胞，随后在荧光显微镜下检查细胞。
体内毒性用范围从25至400μg/小鼠的不同剂量的(Q)-hRS7静 脉内注射初次接受实验的BALB/c小鼠(雌性，7周龄，Taconic Farms， Germantown，NY)，每天监测毒性的可见体征和体重变化。最大耐受 剂量(MTD)定义为无死亡发生并且体重减轻为20％或更少的处理前 动物体重(约20g)时的最高剂量。无痛处死经历毒性效应的动物。
荷瘤小鼠的治疗功效用1×107Calu-3人NSCLC细胞皮下接种 约20g的雌性NCr纯合无胸腺nu/nu小鼠(当从Taconic农场接收时 为5周龄)，通过测量径器测量肿瘤的长×宽来监测其肿瘤生长。肿瘤 体积计算为(L×W2)/2。一旦肿瘤达到大小约0.15cm3，就将动物分成 处理组，每组5只动物。治疗由单次50μg(Q)-hRS7的静脉内注射或 两次间隔7天施用的25μg的注射组成。对照组接受盐水。每天监测 动物的毒性的体征，人道地无痛处死小鼠，如果肿瘤大小达到超过 2.0cm3或成为溃疡，那么所述动物被认为屈服于疾病进展。此外， 如果小鼠减轻超过20％的初始体重或变得垂死，那么无痛处死它们。 利用GraphPad Prism软件，使用Kaplan-Meier曲线(log-rank分析)分 析存活数据。在P＜0.05上，差异被认为是统计上显著的。
结果
纯度和分子完整性通过大小排阻HPLC显示(Q)-hRS7由指示 比IgG更大的分子大小的观察到的保留时间(7.8分钟)的单峰(未显示) 组成。(Q)-hRS7的纯度还通过在还原型SDS-PAGE上只观察到2条 带(一条约50kDa，归因于hRS7的重链，另一条约37KDa，归因于 融合Rap(Q)的L链)(未显示)得到证实。
结合分析通过ELISA初步评估(Q)-hRS7与表达Trop-2的细胞 系的反应性，对于PC-3(图2A)和Calu-3(图2B)(两者都产生约为hRS7 的表观解离常数的2倍的表观解离常数(KD)(0.28nM对0.14nM))该反 应性得到证明。对于Trop-2-阴性22Rv1(图2C)未观察到结合。在总 共10个表达Trop-2的细胞系中利用流式细胞术进行随后的研究，结 果(未显示)表明(Q)-hRS7的结合性质与hRS7的结合性质实际上不存 在差异。
RNA酶活性IVTT测定法测量因mRNA被RNA酶降解而引起 的蛋白质合成的抑制。如图3A中显示的，(Q)-hRS7和rRap在该无 细胞测定法中具有可比较的RNA酶活性，然而对于hRS7未观察到 酶促活性。通过使用酵母tRNA作为底物，我们估计rRap和(Q)-hRS7 的kcat/Km(109M-1s-1)分别为4.10(±0.42)和1.98。因此，基于Rap 的浓度的(Q)-hRS7的催化效率约为rRap的50％，这与报导的与天然 Rap相比较的LL2-豹蛙酶的40％催化效率相似(Newton等人，Blood 2001；97：528-35)。初始速率对tRNA的浓度(来自一组代表性实验)的 曲线示于图3B中。
体外细胞毒性基于MTS测定的结果，(Q)-hRS7最有力抗 ME-180(图4A)、T-47D(图4B)、MDA-MB-468和Calu-3，EC50值 分别为1.5、2.0、3.8和8.5nM。通过MTS测定，对于在100nM(Q)-hRS7 上显示低于50％的生长抑制的那些细胞系，我们还进行集落测定以确 认(Q)-hRS7在10nM或100nM上对DU-145、PC-3、MCF7、SK-BR-3、 BxPC-3、Capan-1和SK-OV-3具有细胞毒性(未显示)。显示了 DU-145(图4C)和PC-3(图4D)的代表性结果。在两个测定中，hRS7、 rRap以及hRS7和rRap的组合在100nM上在所有被评估的细胞系中 都显示了极小的细胞毒性(如果有的话)。Trop-2阴性AsPC-1在两个 测定中都对(Q)-hRS7有抗性。
内化和亚细胞定位对于在用PBS/0.2％BSA或用低pH甘氨酸 缓冲液洗涤以剥离膜结合的蛋白质(未显示)后固定的样品，明确地显 示了(Q)-hRS7至ME-180细胞的内化。细胞内(Q)-hRS7在ME-180 中的分布模式，如通过缀合FITC的GAH直接检测到的或通过缀合 PE的GAM经由小鼠抗-Rap IgG间接检测到的，显现几乎完全相同， 这表明(Q)-hRS7在进入这些细胞后仍然保持完整(未显示)。使用荧光 标记的hTf作为重复利用内体的标记和Hoechst 33258(其染色细胞核) 进一步探测(Q)-hRS7在MDA-MB-468细胞内的亚细胞定位。根据结 果，很明显的是当在37℃下温育2小时后，(Q)-hRS7和hTf占据 MDA-MB-468中的相同亚细胞位置(未显示)。如所预期的(数据未显 示)，除了其未被PE-GAM/抗-Rap显现外，hRS7在两种细胞系中都 显示与(Q)-hRS7相似的内化特征。
小鼠中的MTD我们在被给予为50μg至100μg的单次静脉内注 射的正常BALB/c小鼠中测定(Q)-hRS7的MTD。迄今为止产生的其 它2L-Rap-X或2L-Rap(Q)-X融合蛋白具有相似的MTD范围。此外， 我们通过4次每5天给予20μg(q5d×4)测定了多次注射的(Q)-hRS7在 初次接受实验的SCID小鼠中的MTD为80μg。
荷瘤小鼠中的治疗功效如图5A中显示的，利用(Q)-hRS7的任 一处理(单剂量，50μg或两个间隔5天给予的25μg的剂量)与未处理 对照相比较显示地抑制了Calu-3异种移植物的生长(P＜0.019)，平均 存活时间从55天增加至96天(P＜0.01；图5B)。
讨论
与从植物或细菌来源(Kreitman，AAPS J 2006；8：E532-51)的毒素 制备的免疫毒素(针对所述毒素的癌症治疗的临床试验已完成或进行 至相当的程度(Pastan等人，Nat Rev Cancer 2006；6：559-65；Pastan等 人，Annu Rev Med 2007；58：221-37；Kreitman，BioDrugs 2009；23：1-13)) 相比较，抗体靶向RNA酶(也称为免疫RNA酶)的有利方面(De Lorenzo等人，FEBS Lett 2002；516：208-12；Cancer Res 2004；64：4870-4) 是相对温和，大部分被开发用于治疗恶性血液病并且靶向成分由scFv 的某些形式赋予(Schirrmann等人，Exp Opin Biol Ther 2009；9：79-95)。 迄今为止，未在具有任何癌症的患者中评估免疫RNA酶。
其它植物或微生物免疫毒素的临床开发中指出的两个困难是不 期望的毒性和免疫原性。对于这些免疫毒素观察到的常见组织毒性包 括血管渗漏综合征(VLS)、溶血性尿毒症综合征(HUS)和肝毒性 (Kreitman，BioDrugs 2009；23：1-13)。经鉴定负责蓖麻蛋白A-链或IL-2 与内皮细胞的结合的结构基元(x)D(y)在Rap(Q)的天然序列中不存 在，并且hRS7不与人内皮细胞交叉反应。我们因而认为(Q)-hRS7引 起VLS的可能性是很小的。大尺寸的(Q)-hRS7(约180kDa)(其引起了 对肿瘤的不太快速的渗透的可能关注(Yokota等人，Cancer Res 1992；52：3402-8))应当阻止其通过肾的清除和缓和发生HUS的风险。 至于肝毒性，我们指出，BL22，由融合至PE38的RFB4的二硫键稳 定的Fv组成的重组抗-CD22免疫毒素，和类似毒素例如LMB-2(抗 -Tac(Fv)-PE38)因非特异性肝毒性而在小鼠中也具有极低的MTD，然 而已报导BL22在患有多毛细胞白血病的患者的临床试验中是安全有 效的(Kreitman等人，N Engl J Med 2001；345：241-7)。因此，通常在小 鼠中观察到的剂量限制肝毒性可能在人中极少表现(Kreitman， BioDrugs 2009；23：1-13)。在另一方面，免疫原性是更常见的问题。已 在癌症患者中进行评估的大部分遗传工程改选的免疫毒素诱导强体 液免疫反应，这缩短了血清半衰期并且妨碍了进一步施用。已在实验 动物中测试了几种降低免疫反应的方法，对于脱氧精胍菌素(Pai等 人，Cancer Res 1990；50：7750-3)和CTLA4Ig(Sieall等人，J Immunol 1997；159：5168-73)已有一些成功的报导，并且已提出了与免疫毒素组 合的此类和其它免疫抑制剂的临床试验(Frankel，Clin Cancer Res 2004；10：13-5)。(Q)-hRS7的免疫原性较低，因为其包含人源化抗体与 毒素的融合物，所述融合物在患者中似乎几乎不诱导抗体反应 (Mikulski等人，J Clin Oncol 2002；20：274-81)。
免疫毒素的细胞毒性需要其进入靶细胞，随后迁移至细胞溶胶。 虽然已报导豹蛙酶(Rodriguez等人，J Cell Sci 2007；120：1405-11； Haigis和Raines，J Cell Sci 2003；116：313-24；Wu等人，J Biol Chem 1995；270：17476-81)和其它RNA酶(Wu等人，J Biol Chem 1995；270：17476-81；Leich等人，J Biol Chem 2007；282：27640-6；Bracale 等人，Biochem J 2002；362：553-60)以及包含融合至人抗-ErbB2 scFv(De Lorenzo等人，Cancer Res 2004；64：4870-4；FEBS Lett 2007；581：296-300)或人抗-CD30 scFv-Fc(Menzel等人，Blood 2008；111：3830-7)的人胰腺RNA酶的免疫RNA酶的内化后细胞内途 径，但完全理解仍未出现。我们的内化实验表明当在加入至 MDA-MB-468后2小时检查时，(Q)-hRS7与hTf共定位，这表明 (Q)-hRS7可直接从内体出来进入细胞溶胶，如对于豹蛙酶所提出的 (Haigis和Raines，J Cell Sci 2003；116：313-24)。抗-Rap与抗-人Fc f 之间在ME-180中对于细胞内(Q)-hRS7所观察到的荧光图像的密切相 似性进一步表明(Q)-hRS7在内吞过程中抗蛋白酶降解的能力。
尽管当通过3天MTS测定测量时，发现(Q)-hRS7的体外效力在 表达Trop-2的细胞系之间可变化(这可部分归因于差异细胞内路径选 择)，但通过使用集落形成测定，明确地显示(Q)-hRS7在10nM上存 在对所有细胞系的细胞毒性。除了其强有力的体外抗多种癌细胞系的 细胞毒性外，还显示(Q)-hRS7在抑制裸小鼠的Calu-3人肺癌异种移 植物的生长中是有效的，从而验证了(Q)-hRS7的体内抗肿瘤活性和 稳定性以及确认了向目前列表的被免疫毒素靶向的实体癌上的抗原 加入Trop-2的适合性(Kreitman，AAPS J 2006；8：E532-51；Pastan等人， Nat Rev Cancer 2006；Pastan等人，Annu Rev Med 2007；58：221-37； Schirrmann等人，Exp Opin Biol Ther 2009；9：79-95)。
总之，我们已证明与人源化抗-Trop-2抗体重组融合的两栖动物 RNA酶在体外和体内都显示抗多种上皮癌的选择性和强有力的细胞 毒性。
实施例2.2L-rap-hLL1-γ4P的表达和鉴定
如下文中所使用的，rap表示豹蛙酶。
dHL-IgG4P变体的构建：
包含IgG4基因的B13-24细胞购自ATCC(ATCC编号CRL-11397) 并且分离基因组DNA。细胞用PBS进行洗涤，悬浮于消化缓冲液 (100mM NaCl，10mM Tris-HCl pH 8.0，25mM EDTA，0.5％SDS， 0.1mg/ml蛋白酶K)中，在50℃下温育18小时。用等体积的酚/氯仿/ 异戊醇提取样品，然后用7.5M NH4Ac/100％EtOH进行沉淀。通过离 心回收基因组DNA，将其溶解在TE缓冲液中。使用基因组DNA作 为模板，通过PCR扩增IgG4基因。
将扩增的PCR产物克隆入TOPO-TA测序载体(Invitrogen)，通过 DNA测序进行确认。pdHL-hLL2中含有IgG1的重链恒定区的 SacII-EagI片段替换为TOPO-TA-IgG4质粒的SacII-EagI，从而产生 pdHL2-hLL2-IgG4(pdHL2-hLL2-γ4)载体。
IgG4-脯氨酸突变
将Ser228Pro突变引入IgG4的铰链区以避免半分子的形成。合 成突变的铰链区56bp片段(PstI-StuI)，使其退火，然后替换为IgG4的PstI-StuI片段。该构建体导致产生最终的载体pdHL2-hLL2-γ4P。
pdHL2-hLL1-γ4P的构建
将pdHL2-hLL2-γ4P的XbaI-HindIII片段替换为含有Vk和VH 区的pdHL2-hLL1的Xba-HindIII片段以产生hLL1-γ4P构建体。
pdHL2-2L-rap-hLL1-γ4P的构建
使用包含3个拷贝的4个甘氨酸-1个丝氨酸单体的柔性连接体将 Rap的C末端连接至hLL1的Vk的N末端。每一条轻链的N末端连 接一个rap分子。通过PCR进行该分子的DNA的构建。将 pdHL2-hLL1-γ4P的Xba-BamHI片段替换为pBS-2L-rap-hLL1的 Xba-BamHI(Xba-前导序列-rap-连接体-Vk-BamHI)片段以完成最终的 载体pdHL2-2L-rap-hLL1-γ4P。
转染
载体DNA(30μg)用SalI酶进行线性化，然后通过电穿孔(450V) 转染NSO(4×106个细胞/mL)或Sp2/0-Ag14(5×106个细胞/mL)骨髓瘤 细胞。将所述细胞培养在补充有低-IgG FBS(10％)、青霉素(100个单 位/mL)、链霉素(100μg/mL)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、 必需氨基酸(100μM)和甲氨蝶呤(0.1μM)的完全杂交瘤-SFM培养基 中。通过ELISA筛选阳性克隆。简而言之，用50μl的5ug/mL的PBS 培养基中的抗-rap抗体包被平板，在4℃下温育过夜。在用PBS洗涤 和用2％BSA封闭后，加入细胞培养上清液。将缀合HRP的山羊抗- 人IgG.sub.4抗体用于检测并且将OPD用作用于显色的底物。在490 nm读取板。扩展阳性克隆，将其冷冻用于将来使用。克隆C6被鉴 定为最佳生产者并且用于进一步开发。
表达和纯化
将细胞培养在2个各自装有500ml培养基的转瓶中至最终的培 养(10-20％的成活力)，通过离心除去细胞。将上清液过滤，然后用于 用20mM Tris-HCl/100mM NaCl缓冲液(pH 8.5)平衡的蛋白A柱子。 加载后，用100-mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤柱子，然后用100mM 柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)进行洗脱以获得融合蛋白。使用3M Tris-HCl，pH 8.5将包含产物的峰调节至pH 7.0，针对10mM PBS溶 液进行透析。浓缩后，将产物通过0.22μm滤器过滤，于2-8℃下贮存。 纯化后，从1-L培养物回收16mg。
2L-rap-hLL1-γ4P的鉴定
HPLC：在HPLC上检查蛋白质的纯度和浓度。在7.7分钟(未显 示)观察到保留时间指示分子大于IgG的单一锐峰。
SDS-PAGE：使用4-20％Tris-甘氨酸凝胶在还原性条件下进行 SDS-PAGE。观察到与预期大小约50kD的重链相关的条带和分子量 约37和39kD的两个条带(两者大于hLL1的轻链(约25kD))(未显示)。 已显示两条轻链的存在归因于融合蛋白上rap的糖基化(参见下文)。
质谱法：在Scripps Research Institute，CA，通过MALDI-TOF法 进行质谱法。将两个样品呈送以进行分析，一个以天然状态存在 (1.6mg/mL于10mM PBS中)，另一个以还原状态存在(1.6mg/mL于 1mM HEPES/10mM DTT，pH 7.5缓冲液中)。天然样品显示一个质量 177150的主峰，这与1个IgG+2个rap的MW正好吻合(未显示)。还 原的样品在50560(对应于重链)、38526和36700(对应于2条含rap的 轻链)上显示3个主峰(未显示)。
蛋白质印迹法：为了确认rap存在于纯化的蛋白质中，进行蛋白 质印迹法。将在还原性条件下来自SDS-PAGE凝胶的样品电转移至 PVDF膜上。在用5％BSA封闭后，以1∶10,000的稀释度或10ng/ml 加入小鼠抗-rap抗体，温育1小时。在洗涤后，加入缀合HRP的山 羊抗-小鼠Fc抗体，温育1小时。在洗涤6次后，加入 LumiGloTM(Kirkegaard & Perry Laboratories)底物，使Kodak膜显影。 在膜上检测到对应于融合轻链的两个条带，从而确认rap存在于两条 轻链上(未显示)。
利用N-糖苷酶的处理：由于rap具有潜在N糖基化位点 Asn-X-Thr/Ser、Asn69-Val70-Thr71，因此两条具有2kD差异的分子 质量的轻链的观察可能是rap的不均匀糖基化的结果。为了研究该可 能性，将rap-hLL1抗体与N-糖苷酶(New England Biolabs)在按照提供 商的推荐的变性条件下一起温育。在N-糖苷酶处理后，对应于两条 轻链的两个条带合并成一个(更快的迁移条带)，从而确认了糖的不均 匀分布是在SDS-PAGE上观察到两个条带(未显示)的原因。其它证明 通过当Rap(N69Q)(去除了糖基化位点的Rap的变体)替代重组构建体 中的Rap时只观察到一条Rap融合轻链(数据未显示)来提供。
rap的活性：按照提供商的推荐使用Bright-GloTM Luciferase Reporter Assay系统(Promega)，利用Quick Coupled Transcription/Translation系统(Promega)测试RNA酶活性。该测定的 原理是使用荧光素酶报告系统测量作为RNA酶活性的结果的蛋白质 合成的抑制(mRNA降解)。以不同的稀释度：游离rap(0.001-2.5nM)、 hLL1-rap(0.01-20nM)或hLL2-rap的化学缀合物(表示为K1-LL2-One 和PKII-LL2-One)(0.01-20nM)制备样品。将每个样品(5uL)与20μl TNT主混合物混合，在30℃下于96孔板中温育2小时，从所述板取 出1μl用于利用50μl Bright-GloTM底物进行的分析。使用Excel或Prism Pad软件，结果示于图6中。对于rap-hLL1和hLL2-One的化学缀合 物EC50值为约300pM，对于游离rap，值为30pM。
WP的竞争结合WP是hLL1的抗-独特型抗体。通过竞争性结 合测定评估rap-hLL1抗体与hLL1抗体相比较的对WP的亲和力。简 而言之，用50μl 5ug/mL的WP包被96孔板，在4℃下温育过夜。 以不同的2×稀释度(终浓度范围在0.49至1000nM之间)制备3种类 型的蛋白质样品hLL1、rap-hLL1或hA20，将所述样品与等体积的2× 缀合HRP的mLL1抗体(终稀释度为1/20,000)混合。将50μL与上述 缀合HRP的mLL1混合的蛋白质样品加入每一个孔中并且温育1小 时。在洗涤后，加入含OPD底物的H2O2，在490nm处读取平板。 如图7中显示的，使用Excel或Prism Pad绘图软件将蛋白质浓度对 吸光度作图。将hA20(人源化抗-CD20抗体)用作阴性对照。根据图7， 很明显rap-hLL1具有与hLL1相似的结合亲和力并且阴性对照hA20 根本不具有亲和力。使用Raji细胞作为抗原源获得相似的结果。
体外细胞毒性在B细胞淋巴瘤细胞系(Daudi)和多发性骨髓瘤细 胞系(MC/CAR)中测定体外细胞毒性。将细胞(0.1ml中10,000个)置 于96孔板的每一个孔中。24小时后，将游离hLL1、游离rap或 rap-hLL1(10μl)加入适当的孔中，将细胞在37℃下于培养箱中温育3 天。使用MTS四唑染料还原测定法或BrDU比色测定法测定细胞增 殖。结果表示为EC50，所述EC50通过使用Prism Pad软件图解获得。 根据图8-9很明显的是rap-hLL1对B细胞淋巴瘤细胞系(Daudi)和多 发性骨髓瘤细胞系(MC/CAR)都很敏感。rap-hLL1对Daudi细胞与对 MC/CAR细胞相比较显著更有效力(细胞毒性)，如通过EC50值(图8 和图9)反映的。对于MC/CAR细胞系，在测试的浓度上未达到EC50值。在最高浓度(56nM)上，细胞成活力为57％。hLL1或游离rap本 身在任一细胞系中未显示细胞毒性。
药代动力学和生物分布方法如Sharkey等人(Int J Cancer.1990； 46：79-85)所描述的，使用2-(4-异硫氰苄基)DTPA(Macrocyclics， Dallas，Tex.)将hLL1或2L-Rap-hLL1-γ4P缀合至二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)以获得DTPA-hLL 1或DTPA-2L-Rap-hLL1-γ4P，分别用氯化 88Y(Los Alamos National Laboratory(Los Alamos，N.Mex.)或氯化 111(Perkin Elmer Life Sciences，Boston，Mass.)标记DTPA-hLL1或 DTPA-2L-Rap-hLL1-γ4P，以进行药代动力学和生物分布研究。用 0.001mCi 88Y-DTPA-hLL1和0.02mCi 111In-DTPA-2L-Rap-hLL1-γ4P 的混合物(补充有未标记的hLL1或2L-Rap-hLL1-γ4P的DTPA缀合物) 静脉内注射初次接受实验的雌性SCID小鼠(8周龄，18-22g)以便每 只动物接受总剂量各自为10μg的hLL1和2L-Rap-hLL1-γ4P。给药后 在选择的时间(1、2、4、16、48、72、168小时)上，麻醉小鼠组(每 组5只小鼠)，利用心脏穿刺抽取血液样品。取出主要组织，称重， 将其置于容器中。在已校准的γ计数器中计数血液样品和组织的 111In(通道120-480)和88Y(通道600-2000)。产生交换曲线以校正88Y 能至111In计数窗中的反向散射。
体内毒性用范围从25至400μg/小鼠的不同剂量的 2L-Rap-hLL1-γ4P静脉内注射初次接受实验的SCID或BALB/c小鼠， 每天监测毒性的可见体征和体重减轻。最大耐受剂量(MTD)定义为无 死亡发生并且体重减轻为小于20％的处理前动物体重(约20g)时的最 高剂量。处死并且收获经历毒性效应的动物，将其经历组织病理学分 析。在初次接受实验的SCID小鼠中，100、150、200、250、300或 400μg的2L-Rap-hLL1-γ4P的单次静脉内剂量导致动物的严重体重减 轻和死亡，但所有小鼠经历25或50μg的剂量后存活(未显示)。在 BALB/c小鼠中，所有小鼠在经历30或50μg但非100或200μg(未显 示)的单次静脉内剂量的2L-Rap-hLL1-γ4P后存活。在另一个实验中， 发现75μg剂量的2L-Rap-hLL1-γ4P对SCID小鼠是有毒的(数据未显 示)。因此，作为单次快速静脉注射给予的2L-Rap-hLL1-γ4P的MTD 在SCID小鼠中为50至75μg，在BALB/c小鼠中为50至100μg。死 亡或被处死的小鼠的肉眼病理学检查显示严重的肝和脾毒性。肝呈苍 白色并且脾皱缩，小于通常的大小。组织病理学检查显示肝和脾坏死。 代表性小鼠的血清样品具有升高的水平的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、 天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素，表明在这些高剂量上存在显 著的肝毒性。
数据分析对于体外细胞毒性分析，从一式三份测定的平均值产 生剂量-反应曲线，使用GraphPad Prism软件(Advanced Graphics Software，Encinitas，Calif.)获得50％抑制浓度(IC50)值。使用非隔室 模型分析程序(noncompartmental analysis program)WinNonlin，4.1版 (Pharsight，Mountain View，Calif.)的标准算法分析药代动力学数据。 所述程序利用线性梯形法则，使用线性插值计算曲线下面积(AUC)。 假定一级动力学，根据终末半衰期(t1/2β)计算消除速率常数(kβ)。利用 GraphPad Prism软件，使用Kaplan-Meier曲线(log-rank分析)分析存 活研究。差异在P＜0.05时是统计上显著的。
药代动力学和生物分布数据在初次接受实验的SCID小鼠中测 定放射性标记的hLL1和2L-Rap-hLL1-γ4P的药代动力学和生物分 布。用DTPA缀合hLL1和2L-Rap-hLL1-γ4P，并且分别用88Y和111In 进行标记示踪。如图10中显示的，111In-标记的2L-Rap-hLL1-γ4P显 示与88Y-标记的hLL1相似的血液双相性清除率，其特征在于初始快 速再分布(α)和随后更慢的清除(β)相。与hLL1(4小时)相比较，对于 2L-Rap-hLL1-γ4P(5.1小时)观察到稍微更慢的半衰期。使用超过5小 时的数据点来计算t1/2β、kβ、AUC、平均保留时间(MRT)、表观分布 容积(Vd)和清除速率(Cl)，并且这些参数的值示于表2中。111In-标记 的2L-Rap-hLL1-γ4P的组织吸收与88Y-标记的hLL1的组织吸收相似 (数据未显示)。
表2.使用放射性标记的DTPA-缀合物在SCID小鼠中测定的 2L-Rap-hLL1-γ4P和hLL1的药代动力学参数
参数 单位 88Y-DTPA-hLL1 111In-DTPA-2L-Rap-hLL1-γ4P T1/2，β h 103 113 kβ 1/h 0.0067 0.0061 Cl mL/h 0.025 0.024 Vd mL 3.8 3.9 MRT h 140 156 AUC h*μg/mL 393 418
荷瘤小鼠中的治疗功效
荷瘤小鼠中的治疗功效：用1.5×107个Daudi细胞静脉内注射雌 性SCID小鼠(8周龄，18-22g)，每组8至9只，一天后接受处理。 每天检查小鼠的后腿麻痹，并且每周称重一次。当动物发生后腿麻痹 或失去20％的它们的处理前重量时，无痛处死它们。180天后终止每 一组治疗实验。
如图11中显示的，未处理小鼠(PBS组)在30天内全部死亡，平 均存活时间(MST)为28天。接受hLL1-γ4P(43.2μg)和Rap(6.6μg)的混 合物(代表50μg2L-Rap-hLL1-γ4P中的组成蛋白质的组合物)的对照组 的MST为70天(P＜0.0001，相对于PBS组)。相反地，接受5或15μg 2L-Rap-hLL1-γ4P的单次注射的所有小鼠都存活超过100天 (MST＞180天；P＝0.0005，相对于组分处理的组)，并且每组中只有一 只小鼠在接近研究终止时丢失。当在180天后终止研究时，90％的接 受5、15、30、40或50μg 2L-Rap-hLL1-γ4P的单次注射的小鼠得到 治愈。值得注意的是接受1μg的单次注射的小鼠的MST为92天，与 未处理的组的28天相比较(P＜0.0001)，表示230％的增加。
PCR-扩增的编码细胞毒性RNA酶的DNA的合成
利用自动化DNA合成仪合成139-聚体DNA核苷酸，ONCO-N， 其具有编码重组细胞毒性RNA酶的N端序列(46个氨基酸)的有义链 序列：
5′-TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA CAT ATC ACG AAT ACA CGA GAT GTA GAC TGG GAC AAT ATA ATG TCT ACG AAT CTG TTT CAC TGT AAG GAT AAG AAT ACC TTT ATA TAC AGT CGG CCA GAG CCT GTA AAG GCT ATC TGT A-3′(SEQ ID NO：88)，将其 用作模板，利用下列引物进行PCR扩增。
ONNBACK
5′-AAG CTT CAT ATG CAG GAT TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA-3′(SEQ ID NO：89)
ONNFOR
5′-CTT ACT CGC GAT AAT GCC TTT ACA GAT AGC CTT TAC AGG CTC TG-3′(SEQ ID NO：90)
所得的双链PCR产物包含编码细胞毒性RNA酶的N端半部分 的54个氨基酸残基的cDNA序列。ONNBACK包含限制性酶切位点 HindIII和NdeI以有利于亚克隆入分期载体(staging vector)或使框内 连接(NdeI位点)亚克隆入细菌表达载体。将NruI位点整合入 ONNFOR引物以有利于框内与编码细胞毒性RNA酶的C端半部分的 cDNA连接。
类似地，合成137-聚体DNA核苷酸，ONCO-C，其具有编码 细胞毒性RNA酶的C端序列(46个氨基酸)的有义链序列：
5′-TGC TGA CTA CTT CCG AGT TCT ATC TGT CCG ATT GCA ATG TGA CTT CAC GGC CCT GCA AAT ATA AGC TGA AGA AAA GCA CTA ACA AAT TTT GCG TAA CTT GCG AGA ACC AGG CTC CTG TAC ATT TCG TTG GAG TCG GG-3′(SEQ ID NO：91)，利用下列 引物PCR扩增所述序列。
ONCBACK
5′-ATT ATC GCG AGT AAG AAC GTG CTG ACT ACT TCC GAG TTC TAT-3′(SEQ ID NO：92)
ONCFOR
5′-TTA GGA TCC TTA GCA GCT CCC GAC TCC AAC GAA ATG TAC-3′(SEQ ID NO：93)
最终的双链PCR产物包含编码细胞毒性RNA酶的剩余的C端 半部分的51个氨基酸的cDNA序列。NruI位点允许框内与整合在 ONCBACK中的PCR扩增的DNA的N端半部分连接。用于亚克隆 入分期载体或表达载体的终止密码子和BamHI限制性酶切位点包括 在ONCFOR序列中。
在用适当的限制性内切酶处理后，将编码细胞毒性RNA酶的N 端和C端半部分的PCR扩增的DNA在NruI位点连接，然后亚克隆 入分期载体，例如来自Stratagene的pBluescript。连接的序列编码具 有N末端Met的105个氨基酸的多肽。
LL2和MN-14V-区序列的克隆以及LL2和MN-14的人源化
hLL2和hMN-14的V区序列已经公布。Leung等人，Mol. Immunol.，32：1413(1995)；第5,874,540号美国专利。使用公布的方 法和引物PCR扩增LL2和MN-14的VK和VH序列。对PCR扩增 的DNA的序列分析表明它们编码通常抗体VK和VH结构域的蛋白 质。基于PCR扩增的LL2和MN-14序列构建的嵌合抗体显示可与它 们的亲代抗体相比较的免疫反应性，从而确认了获得的序列的真实性
LL2抗体的序列分析显示在构架-1区域中存在VK悬挂的N-连 接的糖基化位点。突变研究表明VK-悬挂位点上的糖基化不是维持抗 体的免疫反应性所必需的(未显示)。在不包含FR-1糖基化位点的情 况下，REI构架序列用作移植轻链CDR的支架，并且EU/NEWM用 于移植LL2的重链CDR。人源化LL2(hLL2)的免疫反应性(未显示) 经显示与鼠和嵌合LL2的免疫反应性相当(未显示)。LL2的内化速率 不受抗体的嵌合化或人源化影响(未显示)。
编码人源化LL2与细胞毒性RNA酶的融合蛋白的基因的构建
将hLL2的VH和VK序列用作模板来通过标准PCR方法装配 hLL2-scFv基因。将-1位置上的Met起始密码子整合在VL基因的N 端，通过16个氨基酸的连接体将其连接至VH结构域。将6个组氨 酰残基的尾部包含在VH链的羧基末端以有利于通过金属螯合层析 纯化融合蛋白。
以相似的方式通过限制性降解和连接方法构建豹蛙酶-hLL2scFv 的免疫毒素融合蛋白基因。cDNA序列，当表达时，编码具有通过短 连接体连接至LL2 VL序列的N末端的豹蛙酶的融合蛋白。存在多 种连接体，其可被插入细胞毒性RNA酶C末端与VL结构域N端之 间。优选连接体是来自假单胞菌外毒素(PE)的C端位置273-281的氨 基酸序列TRHRQPRGW(SEQ ID NO：94)。已显示该序列为PE被枯 草杆菌蛋白酶细胞内切割成活性片段的识别位点，切割发生在序列的 G与W残基之间。Chiron等人，J.Biol.Chem.，269：18167(1994)。该 序列的整合有助于融合免疫毒素内化后活性细胞毒性RNA酶的释 放。可选择地，用于EDN-scFv融合物的构建的由葡萄球菌蛋白质A 的片段B的氨基酸残基48-60组成的13个氨基酸残基间隔区可替代 地用于允许细胞毒性RNA酶与scFv之间的柔性连接。Tai等人， Biochemistry，29：8024(1990)和Rybak等人，Tumor Targeting， 1：141(1995)。
编码人源化MN-14和豹蛙酶的融合蛋白的基因的构建
MN-14 scFv通过PCR扩增来自人源化MN-14转染瘤的cDNA 来产生。用于MN-14 scFv的连接体是15个氨基酸的连接体并且取 向为VL-连接体-VH。在确认DNA序列后，将单链构建体亚克隆入 真核生物表达载体，并且转染至用于表达的适当的哺乳动物宿主细胞 中。
还制备另一个单链构建体。这利用相反的5′-3′取向的重链和轻链 来制备，将其装配在pCANTABE5E(Pharmacia Biotech，Piscataway， N.J.)中，然后于噬菌体中表达。表达该scFv的重组噬菌体的特异性 结合通过ELISA来证明(未显示)。
将scFv序列用于构建豹蛙酶-MN-14融合蛋白，豹蛙酶通过连接 体连接至VL序列的N末端。如上所述获得编码豹蛙酶的DNA片段。 在豹蛙酶序列与scFv之间使用23个氨基酸的连接体。Kurucz等人 (1995)。
停靠和加锁
实施例3.用于产生模块Fab亚单位的一般策略
Fab模块可制备成包含DDD或AD序列的融合蛋白。为每个Fab 融合蛋白开发独立的转基因细胞系。当制备时，如果需要，模块可进 行纯化或保存在细胞培养物的上清液中。制备之后，任何DDD2模块 与任何AD模块之间可任意组合，以产生DNL构建体。
质粒载体pdHL2已用于产生多种抗体和基于抗体的构建体。参 见Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等 人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体介 导IgG重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列 绝大部分都是相同的，仅在可变区(VH和VL)序列存在差异。使用本 领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化为 Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链 的铰链区、CH2和CH3结构域的编码序列替换为编码所述铰链的前 4个残基、14个残基的Gly-Ser连接体和人RIIα的前44个残基的序 列(称为DDD1)。为了产生Fab-AD表达载体，IgG的铰链区、CH2 和CH3结构域的序列替换为编码所述铰链的前4个残基、15个残基 的Gly-Ser连接体和名为AKAP-IS的17个残基的合成AD的序列(称 为AD1)，该序列系使用生物信息学和肽阵列技术产生，并显示非常 高的与RIIα二聚体结合的亲和力(0.4nM)。参见Alto等人Proc.Natl. Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。
设计了两个穿梭载体，以利于将IgG-pdHL2载体转化为 Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
CH1结构域系使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增获 得。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)和SacII限制性核酸内切 酶位点(即CH1编码序列的5’)组成。右侧引物由编码铰链的前4个残 基以及短连接体(最后两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点)的序 列组成。
CH1左侧引物的5’
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：63)
CH1+G 4 S-Bam右侧
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACC TTGGTGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO：64)
将410bp PCR扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体(Promega， Inc.)，然后筛选克隆以获得T7(5’)方向的插入物。
(G4S)2DDD1的构建
使用Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成双链体寡核苷酸(命名为 (G4S)2DDD1)，以编码DDD1的氨基酸序列，所述DDD1前面有连接 肽的11个残基，其中前两个密码子包含BamHI限制性酶切位点。终 止密码予和EagI限制性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所 示。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFA VEYFTRLREARA(SEQ ID NO：65)
合成两个寡核苷酸(命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下，它们的3’ 端有30个碱基对的重叠)(Sigma Genosys)，并将它们组合在一起以包 含174bp DDD1序列的154个居中碱基对。对寡核苷酸进行退火，然 后使用Taq聚合酶进行引物延伸反应。
RIIA1-44上
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCC CGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGT GCTGCGACAG-3’(SEQ ID NO：66)
RIIA1-44下
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCG AATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCG TGTAGCCCTG-3’(SEQ ID NO：67)
引物延伸之后，使用以下引物对所述双链体进行扩增：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：68)
1-44终止Eag右
5’-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3’(SEQ ID NO：69)
将此扩增引物克隆入pGemT，然后筛选T7(5’)方向的插入物。
(G4S)2-AD1的构建
合成双链体寡核苷酸(命名为(G4S)2-AD1)(Sigma Genosys)，以编 码AD1的氨基酸序列，所述AD1前面有连接肽的11个残基，其中 前两个密码子包含BamHI限制性酶切位点。终止密码子和EagI限制 性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所示。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：70)
合成两个互补并有重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS上和 AKAP-IS下)。
AKAP-IS上
5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCA GATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAG CAGGCCTGACGGCCG-3’(SEQ ID NO：71)
AKAP-IS下
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTG CTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGC CACCTCCGGATCC-3’(SEQ ID NO：72)
使用下列引物对所述双链体进行PCR扩增：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：73)
AKAP-IS终止Eag右
5’-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3’(SEQ ID NO：74)
将此扩增引物克隆至pGemT载体，然后筛选T7(5’)方向的插入 物。
连接DDD1和CH1
使用BamHI和NotI限制性内切酶将编码DDD1序列的190bp片段 从pGemT上切下，然后将该片段连接至CH1-pGemT的相同位点，以 产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
连接AD1和CH1
使用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段从pGemT上切 下，然后将该片段连接至CH1-pGemT的相同位点，以产生穿梭载体 CH1-AD1-pGemT。
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的载体
使用此模块化设计，CH1-DDD1或CH1-AD1均可包含于pdHL2载 体中的任何IgG构建体。通过去除pdHL2的SacII/EagI限制性片段 (CH1-CH3)，并将其替换为从相应pGemT穿梭载体上切下的 CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段，整个重链恒定区即替换为 上述构建体之一。
N-末端DDD结构域
DDD或AD的位置并不限于CH1的羧基末端。已改造了其中 DDD1序列连接至VH结构域的氨基末端的构建体。
实施例4.DNL表达载体
h679-Fd-AD1-pdHL2的构建
h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生h679 Fab的表达载体，其中AD1 通过由14个氨基酸残基组成的柔性Gly/Ser肽间隔区偶联至Fd的CH1 结构域的羧基末端。将包含h679的可变区的基于pdHL2的载体的 SacII/EagI片段替换为CH1-AD1片段(由SacII和EagI从CH1-AD1-SV3 穿梭载体上切下)，该载体即转化为h679-Fd-AD1-pdHL2。
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生融合蛋白 C-DDD1-Fab-hMN-14的表达载体，在所述融合蛋白中，DDD1通过柔 性肽间隔区连接至hMN-14 Fab的CH1羧基末端。质粒载体 hMN14(I)-pdHL2(已用于产生hMN-14 IgG)通过用SacII和EagI限制性 核酸内切酶消化以去除CH1-CH3结构域，然后插入CH1-DDD1片段 (由SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体上切下)，即转化为 C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2。
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生包含两个拷贝的融合蛋 白N-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，在所述融合蛋白 中，DDD1通过柔性肽间隔区连接至hMN-14 Fab的VH的氨基末端。 如下对所述表达载体进行改造。使用下面所示的两个引物对DDD1结 构域进行PCR扩增。
DDD1 Nco左
5’CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3’(SEQ ID NO：75)
DDD1-G 4 S Bam右
5’GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGC TTCTCTCAGGCGGGTG-3’(SEQ ID NO：76)
作为PCR的结果，NcoI限制性酶切位点和连接体中包含BamHI 限制性酶切位点的部分的编码序列即分别连接至5’和3’末端。将170 bp PCR扩增引物克隆至pGemT载体，然后筛选克隆以获得T7(5’)方 向的插入物。194bp插入物由NcoI和SalI限制性内切酶从所述 pGemT载体上切下，并克隆入所述SV3穿梭载体(使用相同的酶消化 制备而成)，以生成中间载体DDD1-SV3。
使用下面所示的寡核苷酸引物对hMN-14Fd序列进行PCR扩增。
hMN-14VH左G4S Bam
5’-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGA GAGCGG-3’(SEQ ID NO：77)
CH1-C终止Eag
5’-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3’(SEQ ID NO：78)
作为PCR的结果，BamHI限制性酶切位点和连接体的部分的编 码序列即连接到扩增引物的5’端。终止密码子和EagI限制性酶切位 点则连接至3’端。将该1043bp扩增引物克隆入pGemT。使用BamHI 和EagI限制性内切酶将hMN-14-Fd插入物从pGemT上切下，然后 将该插入物连接至DDD1-SV3载体(使用相同的酶消化制备而成)，以 产生构建体N-DDD1-hMN-14Fd-SV3。
使用XhoI和EagI限制性内切酶将N-DDD1-hMN-14Fd序列切 下，然后将该1.28kb插入片段连接至经相同酶消化C-hMN-14-pdHL2 制备的载体片段。最终的表达载体即为N-DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2。
实施例5.h679-Fab-AD1的产生和纯化
679抗体结合HSG靶抗原并且可利用亲和层析进行纯化。 h679-Fd-ADl-pdHL2载体用Sal1限制性核酸内切酶消化而被线性化， 然后通过电穿孔方法转染Sp/EEE骨髓瘤细胞。该双顺反子表达载体 介导h679κ轻链和h679 Fd-AD1两者的合成和分泌，它们结合形成 h679 Fab-AD1。电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并 用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。使用涂布 BSA-IMP-260(HSG)缀合物的微量滴定板通过ELISA筛选克隆的蛋白 质表达，并使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。将使用 HSG(IMP-239)传感器芯片的BIAcore分析用于通过测量获自注射的 稀释培养基样品的初始斜率来确定产率。产量最高的克隆具有约为 30mg/L的初始产率。使用单步IMP-291亲和层析，从4.5升转瓶培 养物中纯化出总计230mg h679-Fab-AD1。在加至IMP-291-affigel柱 之前，培养基用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基 线，然后使用1M咪唑、1mM EDTA、0.1M NaAc、pH 4.5洗脱 h679-Fab-AD1。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在保留时间(9.63分 钟)对应于50kDa蛋白(未显示)的单一锐峰。在还原SDS-PAGE分析 中，仅有代表h679-AD1的多肽组分的两个条带可见(未显示)。
实施例6.N-DDD1-Fab-hMN-14和C-DDD1-Fab-hMN-14的产 生和纯化
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2和N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2载体 通过电穿孔转染入Sp2/0衍生的骨髓瘤细胞。 C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载体，其介导hMN-14κ 轻链和hMN-14 Fd-DDD1两者的合成和分泌，它们组合形成 C-DDD1-hMN-14 Fab。N-DDD1-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载 体，其介导hMN-14κ轻链和N-DDD1-Fd-hMN-14两者的合成和分泌， 它们组合形成N-DDD1-Fab-hMN-14。每个融合蛋白均通过DDD1结 构域的相互作用形成稳定的同型二聚体。
电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并用0.05μM甲 氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。使用涂布WI2(针对hMN-14的大鼠抗 id单克隆抗体)的微量滴定板通过ELISA筛选克隆的蛋白质表达，并 使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。产量最高的 C-DDD1-Fab-hMN14Fab和N-DDD1-Fab-hMN14 Fab克隆的初始产 率分别为60mg/L和6mg/L。
使用AD1-Affigel亲和纯化N-DDD1-hMN-14和 C-DDD1-hMN-14
使用DDD/AD相互作用对包含DDD1的构建体进行亲和纯化。 AD1-C是通过合成制备的由ADI序列和羧基末端半胱氨酸残基组成 的肽，所述半胱氨酸残基用于将该肽偶联至Affigel(根据巯基与氯乙 酸酐的反应)。包含DDD的a2结构在中性pH下特异性结合 AD1-C-Affigel树脂，并可在低pH(例如，pH 2.5)下洗脱。
使用单步AD1-C亲和层析，从1.2升转瓶培养物中纯化出总计 81mg C-DDD1-Fab-hMN-14。在加至AD1-C-affigel柱之前，培养基 用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基线，然后使用 0.1M甘氨酸、pH 2.5洗脱C-DDD1-Fab-hMN-14。对洗脱液的 SE-HPLC分析表明存在保留时间(8.7分钟)与107kDa蛋白(未显示)一 致的单一蛋白峰。纯度还经还原SDS-PAGE分析确认，仅显示预期 为C-DDD1-Fab-hMN-14的两个多肽组分的分子大小的两个条带(未 显示)。
如上所述，使用单步ADI-C亲和层析，从1.2升转瓶培养物中纯 化出总计10mg N-DDD1-hMN-14。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存 在类似于C-DDD1-Fab-hMN-14的保留时间(8.77分钟)并与107kDa 蛋白(未显示)一致的单一蛋白峰。还原SDS-PAGE分析仅显示对应于 N-DDD1-Fab-hMN-14的多肽组分的两个条带(未显示)。
C-DDD1-Fab-hMN-14的结合活性通过样品的SE-HPLC分析确 定，在所述样品中，该试验品与不同量的WI2混合。WI2 Fab和 C-DDD1-Fab-hMN-14按0.75∶1的摩尔比混合制成的样品显示三个 峰，对应于未结合的C-DDD1-Fab-hMN14(8.71分钟)、结合一个WI2 Fab的C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95分钟)和结合两个WI2 Fab的 C-DDD1-Fab-hMN14(7.37分钟)(未显示)。当分析的样品包含的WI2 Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14的摩尔比为4时，仅观察到7.36分钟的 单峰(未显示)。这些结果证明，hMN14-Fab-DDD1为二聚体，并且有 两个活性结合位点。使用N-DDD1-Fab-hMN-14重复此实验，得到的 结果非常相似。
竞争性ELISA证明，C-DDD1-Fab-hMN-14和 N-DDD1-Fab-hMN-14均以和hMN-14 IgG相似的亲和力与CEA结 合，并且亲和力显著强于单价hMN-14 Fab(未显示)。使用包含hMN-14 特异的CEA表位(A3B3)的融合蛋白涂布ELISA平板。
实施例7.a2b复合物的形成
a2b复合体形成的证据是由包含等摩尔的 C-DDD1-Fab-hMN-14(作为a2)和h679-Fab-AD1(作为b)的混合物的 SE-HPLC分析首先提供的。对此样品进行分析时，观察到保留时间 为8.40分钟的单一峰，这与形成了大于任何单独的 h679-Fab-AD1(9.55分钟)或C-DDD1-Fab-hMN-14(8.73分钟)的新蛋白 一致(未显示)。当hMN-14 F(ab’)2与h679-Fab-AD1混合，或者 C-DDD1-Fab-hMN-14与679-Fab-NEM混合时，均未观察到此高磁场 位移，证明相互作用明确地通过DDD1和AD1结构域介导。使用 h679-Fab-AD1和N-DDD1-Fab-hMN-14获得非常相似的结果(未显 示)。
使用BIAcore进一步证明和鉴定了DD1与AD1融合蛋白之间的 特异性相互作用。此实验过程如下：首先将h679-Fab-AD1或 679-Fab-NEM结合到高密度的HSG偶联的(IMP239)传感器芯片的表 面，然后注射C-DDD1-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab’)2来进行实验。 如所预期的，当注射后者时，仅有h679-Fab-AD1和 C-DDD1-Fab-hMN-14组合造成响应单元的进一步增加(未显示)。使 用h679-Fab-AD1与C-DDD1-Fab-hMN-14得到了相似的结果(未显 示)。
进行平衡SE-HPLC实验以测定存在于各融合蛋白中的AD1与 DDD1之间的特异性相互作用的结合亲和力。发现h679-Fab-AD1与 C-DDD1-Fab-hMN-14、N-DDD1-hMN-14和重组人RIIα的商业样品 的结合的解离常数(Kd)分别为15nM、8nM和30nM。
实施例8.DDD或AD融合蛋白的亲和纯化
通过产生具有更低亲和力停靠的DDD或AD蛋白来开发通用亲 和层析系统。由RIα二聚体形成的DDD以与RIIα相比较1/500的亲 和力(225nM)结合AKAP-IS(AD1)。因此，可产生从前44个氨基酸残 基形成的RIα二聚体并且将其偶联至树脂以产生用于纯化任何含 AD1的融合蛋白的亲和基质。
自然界存在许多较低亲和力(0.1μM)AKAP锚定结构域。如果需 要，可引入高度可预测的氨基酸替代以进一步降低所述结合亲和力。 低亲和力AD可通过合成或生物学方法制备，并可偶联至树脂以用于 任何DDD1融合蛋白的亲和纯化。
实施例9.用于产生二硫键稳定结构的载体
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
N-DDD2-hMN-14-pdHL2是用于产生N-DDD2-Fab-hMN-14的表 达载体，其拥有与Fd的氨基末端连接的DDD2的二聚化和停靠结构 域序列。DDD2通过15个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体偶联至VH结构域。DDD2具有与DDD1的序列相同的二聚化序列和停靠序列， 但是在它们之前具有半胱氨酸残基。
如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含DDD2 的1-13位残基的重叠的互补寡核苷酸(DDD2上和DDD2下)。将所 述寡核苷酸进行退火，并用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，以在5’ 和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶NcoI和PstI消化的DNA 连接的悬突。
DDD2上
5’CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGA GCTGCTGCA-3’(SEQ ID NO：79)
DDD2下
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGC A-3’(SEQ ID NO：80)
所述双链体DNA与载体片段DDD1-hMN14 Fd-SV3(通过用NcoI 和PstI消化制备)连接，以生成中间构建体DDD2-hMN14 Fd-SV3。使 用XhoI和EagI限制性核酸内切酶，将包含DDD2-hMN14 Fd编码序列 的1.28kb插入片段从所述中间构建体上切下，然后将该片段连接至使 用相同酶消化制备的hMN14-pdHL2载体DNA。最终的表达载体即为 N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的 表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至 Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。如下对所述表 达载体进行改造。通过合成制备两个包含连接体肽的部分的编码序列 (GGGGSGGGCG，SEQ ID NO：81)和DDD2的1-13位残基的重叠的 互补寡核苷酸。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，以在5’ 和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的 DNA连接的悬突。
G4S-DDD2上
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACA TCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ ID NO：82)
G4S-DDD2下
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGC AACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：83)
所述双链DNA与穿梭载体CH1-DDD1-pGemT(逦过用BamHI和 PstI消化制备)连接，以生成穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。使用SacII 和EagI将507bp片段从CH1-DDD2-pGemT上切下，然后将该片段连接 至使用SacII和EagI消化制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2。最终的 表达构建体即为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其 具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至CH1的羧基末 端的AD2的锚定结构域序列。AD2在AD1锚定结构域序列的前后各 有一个半胱氨酸残基。
如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含AD2的 编码序列和部分连接体序列的重叠的互补寡核苷酸(AD2上和AD2 下)。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，在5’和3’端形成 适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的 悬突。
AD2上
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCG AGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGC CGGCTGCTGAA-3’(SEQ ID NO：84)
AD2下
5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCT GCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCC ACCTCCG-3’(SEQ ID NO：85)
所述双链体DNA与穿梭载体CH1-AD1-pGemT(通过用BamHI 和Spel消化制备)连接，以生成穿梭载体CH1-AD2-pGemT。使用SacII 和EagI限制性内切酶将包含CH1和AD2编码序列的429碱基对片 段从所述穿梭载体上切下，然后将该片段连接至使用相同酶消化制备 的h679-pdHL2载体。最终的表达载体即为h679-Fd-AD2-pdHL2。
实施例10.TF1的产生
如下进行DNL构建体(称为TF1)的大规模制备。首先按照大致的 化学计量浓度将N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-纯化的)与 h679-Fab-AD2(IMP-291-纯化的)在1mM EDTA，PBS，pH 7.4中混合。 加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(未显示)。 而是具有代表a4(7.97分钟；200kDa)、a2(8.91分钟；100kDa)和B(10.01 分钟；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成， 与150kDa蛋白一致的、在8.43分钟的新峰证明了这一点(未显示)。 该实验中显然有过量的B，因为对应于h679-Fab-AD2(9.72分钟)的 峰仍是明显的，但是对应于a2或a4则未见明显的峰。还原反应1小 时后，针对几次更换的PBS进行透析过夜，除去TCEP。所得溶液加 入10％DMSO并在室温下保存过夜。
当用SE-HPLC分析时，代表a2b的峰明显变得更尖，保留时间 稍微降低了0.1分钟，变为8.31分钟(未显示)，根据我们先前的发现， 这表示结合亲和性的提高。该复合物通过IMP-291亲和层析进一步纯 化以除去κ链杂质。如所预期的，过量h679-AD2一起被纯化出来， 然后用制备型SE-HPLC除去(未显示)。
TF1是高度稳定的复合物。当测定TF1与HSG(IMP-239)传感器 芯片结合时，在样品注射结束之后所观察的响应未见明显降低，相比 之下，当在相似条件下测定含有等摩尔混合物的 C-DDD1-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1的溶液时，在样品注射期间和 刚注射完后，所观察到的响应单元的增加伴随着可检测的下降，表明 开始形成的a2b结构不稳定。此外，尽管随后注射WI2在针对TF1 的响应单元中引起大幅度的增加，但是对于C-DDD1/AD1混合物来 说没有明显增加。
因WI2与固定在传感器芯片上的TF1结合而导致的响应单元的 额外增加，对应于两个完整的功能性结合位点，其各自是由 N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起的。TF1与WI2的两个Fab片 段的结合能力证实了这一点(未显示)。在含有h679-AD2和 N-DDD1-hMN14的混合物被正确还原和氧化成为TF1后，当用 BIAcore分析时，WI2几乎没有额外结合(未显示)，表明二硫键稳定 的a2b复合物(例如TF1)仅通过DDD2与AD2的相互作用而形成。
对该过程进行了两个改进，以减少过程的时间和效率。首先，以 a4/a2结构混合物形式存在的稍微摩尔过量的N-DDD2-Fab-hMN-14与 h679-Fab-AD2反应，使得没有游离的h679-Fab-AD2存在，而未束缚 至h679-Fab-AD2的任何a4/a2结构以及轻链，都用IMP-291亲和层析 除去。第二，疏水作用层析(HIC)代替透析或渗滤，在还原反应后用 于除去TCEP，这不仅缩短过程时间，而且还增加了潜在病毒的去除 步骤。N-DDD2-Fab-hMN-14与679-Fab-AD2混合，用5mM TCEP在 室温下还原1小时。溶液加入0.75M硫酸铵，然后上样到丁基FF HIC 柱上。用含0.75M硫酸铵、5mM EDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。 用PBS从HIC柱上洗脱还原蛋白，加入10％DMSO。在室温下孵育 过夜后，用IMP-291亲和层析分离出高度纯化的TF1(图22)。无需额 外的纯化步骤，例如凝胶过滤。
实施例11.TF2的产生
成功产生TF1之后，将C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2 反应，也得到一种类似物，称为TF2。如下产生具有超过90％的收率 的试验批量的TF2。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg) 与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4∶1的摩尔比混合。在含有1mM EDTA 的PBS中，总蛋白质浓度为1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、 HIC层析、DMSO氧化和IMP-291亲和层析，都与针对TF1所述的 相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(未 显示)。而是存在对应于a4(8.40分钟；215kDa)、a2(9.32分钟；107kDa) 和b(10.33分钟；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物 的形成，正如在8.77分钟的新峰所证明的那样(未显示)，该峰与二元 结构所预期的157kDa蛋白是一致的。用IMP-291亲和层析将TF2纯 化至接近均质(未显示)。对IMP-291未结合级分进行的SE-HPLC分 析证明从产物中除去了a4、a2和游离κ链(未显示)。
按照对于TF1所述的利用BIACORE测定TF2的功能。将TF2、 C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或 C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非还原a2和b组分的对照样品)稀 释至1μg/ml(总蛋白质)并且通过固定了HSG的传感器芯片。对TF2 的响应是两个对照样品反应的约2倍，表明对照样品中仅有 h679-Fab-AD组分与传感器芯片结合并保留在其上。随后注射WI2 IgG，证明仅有TF2具有与h679-Fab-AD紧密结合的 DDD-Fab-hMN-14组分，正如额外的信号响应所示。因WI2与固定 在传感器芯片上的TF2结合而导致的响应单元增加，也对应于两个 完整的功能性结合位点，每个都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚 基引起。TF2与WI2的两个Fab片段的结合能力证实了这一点(未显 示)。
通过竞争性ELISA测定TF2的相对CEA-结合亲合力。用含有 CEA的A3B3结构域的融合蛋白包被各板(0.5μg/孔)，所述蛋白被 hMN-14识别。连续稀释TF1、TF2和hMN-14IgG，一式四份，在含 有缀合HRP的hMN-14IgG(1nM)的孔中温育。数据显示TF2以与IgG 的亲合力至少相等的亲合力结合CEA，比TF1强2倍(未显示)。
实施例12.TF1和TF2的血清稳定性
将TF1和TF2设计成可用于体内的稳定束缚结构，其中在血液 和组织中会发生大量稀释。用BIACORE评估人血清中TF2的稳定性， 将TF2用新鲜人血清(是从4个供体合并而获得的)稀释至0.1mg/ml 并在5％CO2、37℃温育7天。每天样品按1∶25进行稀释，然后通 过BIACORE进行分析，使用IMP-239HSG传感器芯片。注射WI2 IgG，用于定量测定完整而完全活性的TF2的量。将血清样品与直接 从原液稀释的对照样品相比较。TF2在血清中高度稳定，7天后保持 98％的其双特异性结合活性(未显示)。在人或小鼠血清中对于TF1观 察到相似的结果(未显示)。
实施例13.C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的产生
pdHL2哺乳动物表达载体已被用于介导许多重组IgG的表达(Qu 等人，Methods 2005，36：84-95)。产生质粒穿梭载体以利于将任何 IgG-pdHL2载体转化为C-H-AD2-IgG-pdHL2载体。使用pdHL2载体 作为模板以及寡核苷酸Fc BglII左和Fc Bam-EcoRI右作为引物扩增 Fc(CH2和CH3结构域)的基因。
Fc BglII左
5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：86)
Fc Bam-EcoRI右
5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQ ID NO：87)
将扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体。使用XbaI和BamHI 限制性内切酶从pGemT切下Fc插入物片段，然后将其连接至用XbaI 和BamHI消化h679-Fab-AD2-pdHL2而制备的AD2-pdHL2载体，以 产生穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。
为了将任何IgG-pdHL2表达载体转化成C-H-AD2-IgG-pdHL2表 达载体，从前者切下861bp BsrGI/NdeI限制性片段，将其替换为从 Fc-AD2-pdHL2载体切下的952bp BsrGI/NdeI限制性片段。BsrGI 在CH3结构域内切割并且NdeI在表达盒的下游(3’)切割。
实施例14.C-H-AD2-hLL2 IgG的产生
依帕珠单抗(或hLL2 IgG)是人源化抗-人CD22 MAb。如上所述， 从hLL2 IgG-pdHL2产生C-H-AD2-hLL2 IgG的表达载体，通过电穿 孔将其用于转染Sp2/0骨髓瘤细胞。转染后，用所述细胞涂布96孔 板，在含有甲氨蝶呤的培养基中选择转基因克隆。通过使用涂布 hLL2-特异性抗-独特型MAb的微量滴定板的夹心ELISA以及缀合过 氧化物酶的抗-人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hLL2 IgG产率。 将克隆扩增至转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单 步骤中从耗尽的培养基纯化C-H-AD2-hLL2 IgG。SE-HPLC分析对两 个蛋白峰进行解析(未显示)。慢洗脱峰的保留时间(8.63分钟)与hLL2 IgG相似。快洗脱峰的保留时间(7.75分钟)对应于约300kDa蛋白质。 后来确定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫键连接二聚体。此二聚 体在DNL反应中被还原为单体形式。SDS-PAGE分析表明，纯化的 C-H-AD2-hLL2-IgG由模块的两种单体和二硫键连接的二聚体形式组 成(未显示)。代表这两种形式的蛋白质条带在非还原性条件下的 SDS-PAGE中清晰可见，但是在还原条件下，所有形式均被还原为代 表组成性多肽(重链-AD2和κ链)的两个条带(未显示)。未检测到其它 污染条带。
实施例15.C-H-AD2-hA20 IgG的产生
hA20 IgG为人源化抗人CD20 MAb。从hA20 IgG-pDHL2产生 C-H-AD2-hA20 IgG的表达载体，然后将该载体通过电穿孔转染Sp2/0 骨髓瘤细胞。转染之后，用所述细胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶 呤的培养基上筛选转基因克隆。通过使用涂布hA20特异性抗独特型 MAb的96孔微量滴定板的夹心ELISA以及使用缀合过氧化物酶的 抗人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hA20 IgG产率。将克隆扩增至 转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单步骤中从耗尽 的培养基纯化C-H-AD2-hA20 IgG，SE-HPLC和SDS-PAGE分析得到 的结果与对于C-H-AD2-hLL2 IgG获得的结果非常相似(未显示)。
实施例16.AD-和DDD-连接的来自多个抗体的Fab与IgG融合 蛋白的产生
通过使用前述实施例中描述的技术，构建下列IgG或Fab融合蛋 白，并将其整合入DNL构建体。所述融合蛋白保持亲代抗体的抗原 结合特征并且DNL构建体显示被整合的抗体或抗体片段的抗原结合 活性。
表3.包含IgG或Fab部分的融合蛋白
融合蛋白 结合特异性 C-AD1-Fab-h679 HSG C-AD2-Fab-h679 HSG C-(AD2)2-Fab-H679 HSG C-AD2-IgG-h734 铟-DTPA C-AD2-IgG-hA20 CD20 C-AD2-IgG-hA20L CD20 C-AD2-IgG-hL243 HLA-DR C-AD2-IgG-hLL2 CD22 N-AD2-IgG-hLL2 CD22 C-AD2-IgG-hMN-14 CEA C-AD2-IgG-hR1 IGF-1R C-AD2-IgG-hRS7 EGP-1 C-AD2-IgG-hPAM4 MUC1 C-AD2-IgG-hLL1 CD74 C-DDD1-Fab-hMN-14 CEACAM5 C-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5 C-DDD2-Fab-h679 C-DDD2-Fab-hA19 CD19 C-DDD2-Fab-hA20 CD20 C-DDD2-Fab-hAFP AFP
C-DDD2-Fab-hL243 HLA-DR C-DDD2-Fab-hLL1 CD74 C-DDD2-Fab-hLL2 CD22 C-DDD2-Fab-hMN-3 CEACAM6 C-DDD2-Fab-hMN-15 CEACAM6 C-DDD2-Fab-hPAM4 MUC1 C-DDD2-Fab-hR1 IGF-1R C-DDD2-Fab-hRS7 IGP-1 N-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5
实施例17.包含缀合至B细胞淋巴瘤靶向抗体的4倍体豹蛙酶 (Rap)的基于核糖核酸酶的DNL免疫毒素
我们应用停靠-和-加锁(DNL)法产生新型种类的免疫毒素，其各 自包含4个拷贝的位点特异性连接至二价IgG的Rap。我们将大肠杆 菌(E.coli)中产生的重组Rap-DDD模块和重组人源化IgG-AD模块(其 在骨髓瘤细胞中产生并且靶向B细胞淋巴瘤和白血病)通过与 CD20(hA20，veltuzumab)、CD22(hLL2，依帕珠单抗)或 HLA-DR(hL243，IMMU-114)结合组合在一起，以分别产生20-Rap、 22-Rap和C2-Rap。对于每一个构建体，Rap的二聚体被共价束缚至 各自IgG的每一个重链的C端。类似地使用结合不在B细胞淋巴瘤/ 白血病上表达的抗原(CEACAM5)的labetuzumab(hMN-14)制备对照 构建体14-Rap。
pQDWLTFQKKHITNTRDVDCDNIMSTNLFHCKDKNTFIYSRP EPVKAICKGIIASKNVLTTSEFYLSDCNVTSRPCKYKLKKSTNKFC VTCENQAPVHFVGVGSC HHHHHH(SEQ ID NO：94)
分泌型Rap-DDD2的推导的氨基酸序列示于上面(SEQ ID NO：94)。Rap，加下划线的；连接体，斜体字；DDD2，粗体；pQ， 转变成焦谷氨酸的氨基末端谷氨酰胺。Rap-DDD2在大肠杆菌中产生 为内含体，在变性条件下通过IMAC纯化所述内含体，重折叠，然后 在通过Q-琼脂糖阴离子交换层析纯化之前透析至PBS中。还原条件 下的SDS-PAGE解析出具有对应于Rap-DDD2(18.6kDa)的Mr的蛋白 质条带(未显示)。纯化的Rap-DDD2的最终收率为10mg/L培养物。
将DNL法用于快速产生一组IgG-Rap缀合物。将IgG-AD模块 在骨髓瘤细胞中表达，然后使用蛋白A亲和层析将其从培养上清液 中纯化出来。产生Rap-DDD2模块，将其与IgG-AD2混合以形成 DNL复合物。由于CH3-AD2-IgG模块具有2个AD2肽并且每一个 可束缚Rap二聚体，因此所得的IgG-Rap DNL构建体包含4个Rap 基团和1个IgG。IgG-Rap几乎定量地从组成模块形成并且被蛋白A 纯化至接近均质。
在DNL反应之前，CH3-AD2-IgG以单体和二硫键连接的二聚体 (未显示)存在。在非还原性条件下，IgG-Rap解析为一簇在单体与二 聚体CH3-AD2-IgG之间的预期大小的高分子量条带(未显示)。将缀 合物还原为它们的组成多肽的还原性条件显示出IgG-Rap的纯度和 DNL法的一致性，因为只显现出代表重链-AD2(HC-AD2)、κ轻链和 Rap-DDD2的条带(未显示)。
对22-Rap的反相HPLC分析(未显示)解析出在9.10分钟洗脱的 单一蛋白峰，其处于CH3-AD2-IgG-hLL2的两个峰(代表单体形式 (7.55分钟)与二聚体形式(8.00分钟))之间。Rap-DDD2模块以二聚体 和四聚体(在DNL中被还原成二聚体)的混合物形式被分离，其分别 可在9.30分钟和9.55分钟被洗脱(未显示)。
对22-Rap的LC/MS分析通过将使用C8柱子的反相HPLC与 ESI-TOF质谱法偶联来实现(未显示)。未被修饰的22-Rap的质谱图鉴 定了两个主要种类，除了一些次要糖形式(未显示)外，其还具有两个 G0F(G0F/G0F)或一个G0F+一个G1F(G0F/G1F)N-连接的聚糖。酶促 去糖基化导致与22-Rap的经计算的质量相符的单个重叠合化质谱图 (未显示)。在用TCEP还原后所得的质谱图鉴定了被G0F或G1F结 构的N-连接的聚糖以及另外的次要形式(未显示)修饰的重链-AD2多 肽。包含22-Rap的3个亚单位多肽的每一个在被还原和去糖基化的 样品的重叠合化光谱中得到鉴定(未显示)。所述结果确认了 Rap-DDD2和HC-AD2多肽都具有被转化为焦谷氨酸(pQ)的氨基末端 谷氨酰胺；从而，22-Rap具有其8个被pQ修饰的组成多肽中的6个 多肽。
在3种NHL细胞系中评估体外细胞毒性。每一种细胞系以与 CD22相比较高得多的表面密度表达CD20；然而，hLL2(抗-CD22) 的内化速率远快于hA20(抗-CD20)。14-Rap与22-Rap和20-Rap共有 相同的结构，但其抗原(CEACAM5)不被NHL细胞表达。在图13中， 左图：用IgG-Rap作为单一试剂或用亲代MAb+rRap的组合连续处理 细胞。20-Rap和22-Rap都在高于1nM的浓度上杀伤每一个细胞系， 这表明它们的作用与仅仅细胞生长抑制相反，具有细胞毒性。20-Rap 是最有效的IgG-Rap，表明抗原密度可能比内化速率更重要。对于 Daudi和Ramos获得相似的结果，在所述细胞中20-Rap(EC50约0.1nM) 的效力是22-Rap的3-6倍。抗利妥昔单抗外套细胞淋巴瘤品系Jeko-1 与Daudi和Ramos相比较展示增加的CD20但减少的CD22。重要地， 20-Rap在Jeko-1中展示极强的细胞毒性(EC50约20pM)，其效力为 22-Rap的25倍。
如图13中显示的，右图：预料之中的是，在1小时的处理后洗 涤细胞显著地降低各试剂的细胞毒性(约50倍)。再次地，20-Rap是 最有效的，表明其更慢的内化速率不是限定性的。14-Rap与rRap(与 MAb的组合)相比较显示增加的细胞毒性，这表明gG-Rap的4倍Rap 结构可增加其内化。在1小时的温育后洗涤使14-Rap的细胞毒性比 靶向22-Rap和20-Rap的降得更多。
使用3个ALL细胞系评估IgG-Rap(图14)。3个细胞系之间相对 抗原密度相似，HLA-DR＞＞CD22＞CD20。没有一种亲代MAb(单独 地或与rRap组合)在这些测定中具有细胞毒性。然而，非靶向14-Rap 显示一定的活性，与NHL品系的结果相似。对于每一个细胞系，靶 向最丰富的抗原(HLA-DR)的C2-Rap产生最有效的反应，其为22-Rap 的约50倍。对于具有极低CD20抗原密度的ALL品系，20-Rap显示 中度的细胞毒性，该细胞毒性与非靶向14-Rap的细胞毒性相似。这 与具有高CD20密度并且对20-Rap反应最强的NHL品系的结果相 反。因此，IgG-Rap的功效与靶向抗原的相对丰度相关。
结论
DNL法提供了高效地将多个细胞毒素束缚至靶向抗体上(从而导 致预期因提高的药代动力学和靶向特异性而显示更高的体内效力的 新型免疫毒素)的模块化方法。LC/MS、RP-HPLC和SDS-PAGE证明 了IgG-Rap的均质性和纯度。利用MAb将Rap靶向细胞表面抗原 增强了其肿瘤特异性细胞毒性。抗原密度和内化速率是观察到的 IgG-Rap的体外效力的两个至关重要的因素。体外结果显示CD20-、 CD22-或HLA-DR-靶向IgG-Rap具有用于B细胞淋巴瘤和白血病的 治疗的有效的生物活性。
实施例18.Rap-抗-Trop-2 IgG DNL构建体抗癌的高效力
通过使用实施例17中描述的相同技术，产生包含连接至4个拷 贝的Rap-DDD2的hRS7-IgG-Ad2(抗-Trop-2)的E1-Rap DNL构建体， 所述构建体显示了抗多种癌细胞系的有效的体外生长抑制特性(未显 示)。在乳腺(MDA-MB-468)、宫颈(ME-180)和胰腺(BxPC-3和Capan-1) 肿瘤品系中，其全部表达高水平的Trop-2，E1-Rap效力非常高，显 示了在亚纳摩尔(subnanomolar)范围(5至890pM)内的EC50，其为非 靶向Rap或Rap与hRS7的组合的1,000倍至100,000倍。在表达中 等水平的Trop-2的细胞系例如3个前列腺癌品系(PC-3、DU 145和 LNCaP)中，E1-Rap效力不太高，但仍然显示在纳摩尔范围(1至890nM) 内的EC50。获得的关于这些实体癌细胞的细胞结合数据表明细胞系 对E1-Rap的敏感性似乎与其在细胞表面上的Trop-2表达相关。在不 能结合hRS7的前列腺癌品系22Rv1中未观察到E1-Rap的毒性。这 些结果显示了E1-Rap作为Trop-2-阳性实体瘤(包括乳腺癌、结肠癌、 胃癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌和前列腺癌)的 新型治疗剂的功效。
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可根据本公开内容制备和使用本文中公开的和要求保护的所有 组合物和方法而无需过度实验。虽然已通过优选的实施方案描述了组 合物和方法，但对于本领域技术人员很显然的是可对组合物和方法或 在本文中描述的方法的顺序或步骤进行改变而不背离本发明的概念、 精神和范围。更具体地，在化学和生理学上都相关的某些试剂可用于 替代本文中描述的试剂而可获得相同或相似的结果。对于本领域技术 人员很显然的是所有此类相似的替代和修饰被认为在如由所附权利 要求所确定的本发明的精神、范围和概念内。