背景技术
透明质酸在美容领域中已被使用超过15年，其中其已被证明是无害且有效的。目前，基于源自生物发酵的交联透明质酸的凝胶是美容填充凝胶市场中或作为填充剂最广泛使用的产品。的确，在美容领域中，非再吸收性植入物使用得越来越少并且基于其他多糖的凝胶已被摒弃，因为副作用或因为其动物源性，导致病毒污染的风险。
源自生物发酵的透明质酸在例如填充皱纹(comblement de rides)、粘弹性补充(viscosupplémentation)、眼科治疗或尿失禁治疗等领域中的使用全部得到更加地认可与青睐，这是因为其天然存在于人体中，特别是天然存在于真皮、滑液和角膜中，使得由于副作用导致的风险降至最低。
尽管如此，归因于透明质酸天然存在于人体中的事实，存在能分解透明质酸的内源性酶，例如透明质酸酶。这种分解作用阐述于Locono等，J.Ped.Surg.，1988年，第4期，第33卷，第564-567页中，其涉及伤口愈合。透明质酸酶是一种通过催化透明质酸水解以得到透明质酸的低聚糖而分解透明质酸的酶。这种分解具有降低透明质酸粘性的效果。这种粘性降低无可挽回地导致在填充皱纹或粘弹性补充领域的期望效果随时间降低，导致缩短了每次注射间隔的时间以恢复其效果，容易导致患者的不适或疼痛。
解决该问题的第一种解决方案可以是用其他多糖替代透明质酸，所述多糖对透明质酸酶较不敏感且天然存在于人体中。
在胞外基质(ECM)的组分多糖中，硫酸软骨素、硫酸皮肤素及硫酸角质素可为有利的。
这是因为它们与透明质酸一起部分造成皮肤的保湿与柔顺，并且它们天然存在于真皮中使得能够预见其对于作为填充皱纹的产品、对于补水或对于粘弹性补充的优异的耐受性和有效性。
令人遗憾的是，硫酸软骨素是动物源性的，迄今为止，通过生物发酵途径合成硫酸软骨素的任何尝试均不可生产出适应于工业开发的量。这同样适用于硫酸皮肤素及硫酸角质素，其仅可在工业上作为动物来源产品而获得。
目标在于减少通过透明质酸酶对透明质酸分解的另一种解决方案是提供包含与透明质酸组合的具备透明质酸酶抑制性能的化合物的组合物。
在文献中已知硫酸酯基团的抗氧化及抗自由基性质，以及高保湿能力和抗透明质酸酶活性。
关于硫酸酯基团的抗氧化及抗自由基性质，它们保护糖胺聚糖(GAG)免受活性氧物质的解聚，如Moseley R等在Biochim.Biophys.Acta.，(1995)，1244(2-3)，第245-52页中所述的。
关于硫酸酯基团的高保湿能力，例如R.Servaty等在International Journal of Biological Macromolecules，(2001)，28，第121-127页中证明：相比于透明质酸，硫酸软骨素所具有更强的水分子吸收能力是由于存在硫酸软骨素所具有的硫酸酯基团所导致。
关于硫酸酯基团的抗透明质酸酶活性，已知硫酸化多糖、更特别是全部O-硫酸化糖胺聚糖具有高的抗透明质酸酶活性，这例如从T.Toida等，Archives of Biochemistry and Biophysics，1999年，第370(2)期，第176-182页中可知。该出版物中所述的全部O-硫酸化糖胺聚糖为硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素及硫酸化透明质酸。所获得的结果显示：所有的全部O-硫酸化糖胺聚糖都以剂量依赖性的方式抑制透明质酸酶，并且在已测试的全部O-硫酸化糖胺聚糖中，全部O-硫酸化透明质酸是最佳的透明质酸酶抑制剂。全部O-硫酸化透明质酸的缺点是其不能交联。
尽管如此，在美容领域中，超过80％的组合物基于交联透明质酸；因此，不可能开发基于非交联透明质酸的填充剂产品。
可以设想将少量的动物源性硫酸化多糖并入基于透明质酸的组合物中；例如，Hermida名下的专利申请WO 03/041724描述了基于透明质酸钠及硫酸软骨素的混合物的无菌注射组合物意在用于关节内用途。
同样，在Marcum名下的专利申请WO 2004/034980中，描述了基于透明质酸、硫酸软骨素及N-乙酰葡糖胺的注射组合物，其用于通过关节内注射进行软骨再生。
这种组合物的缺点仍然是硫酸软骨素的动物源性。
关于人工合成的硫酸化多糖，硫酸葡聚糖抑制透明质酸组合物中透明质酸酶的试验也已例如描述于K.Zimmermann的J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1983年，第105期，第189-190页中。根据纳尔逊(Nelson)法测定了如下组合物中透明质酸的水解，所述组合物包含透明质酸、透明质酸酶及不同浓度的分子量为17.7kDa的硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖被描述为透明质酸酶的强力抑制剂，并且如果分子量为17.7kDa的硫酸葡聚糖的活性剂量远低于毒性剂量，则毒性随分子量增大而升高，并且仅一些高分子量的分子才显著升高毒性，正如Walton，Br.在J.Pharmacol.，1954年，第9期，第1-14页中所证实的。另外，硫酸葡聚糖还被描述为可用于体内和体外试验的抗凝剂，正如例如在US2715091中所述，并且这些抗凝性质与作为可植入组合物的组分的用途本来就不兼容。
在植物源性的硫酸化多糖中，角叉菜聚糖是已知的，但已知这些多糖会引起炎症反应，以致用于测试抗炎性的模型都基于这些多糖的性质。
另外，Depuy名下的WO03/000191公开了用于治疗关节炎的包含透明质酸及透明质酸酶抑制剂(例如硫酸化多糖)的组合物，所述硫酸化多糖例如硫酸葡聚糖、硫酸木糖或硫酸乙酰肝素，这些多糖组分的一部分包覆在脂质体中以确保其扩散受控，但在特别意在交联的组合物中使用脂质体令人难以想象。
因此，可用作透明质酸添加剂(以降低透明质酸酶活性)的大多数多糖是动物源性的或者显示潜在毒性，这两个条件都与所设想的用途不相容。
从理论角度而言，可设想以硫酸根离子的形式引入硫酸盐溶液；尽管如此，它们在所注入组织中的扩散会太快，事实上甚至是立即扩散，因此，对于填充皱纹或粘弹性补充领域中组合物的抗透明质酸酶的性质而言是无效的。因此，优选选择通过硫酸酯基团官能化的化合物。
另一种潜在的解决方案是使用属于硫酸化单糖和硫酸化寡糖类别的硫酸化化合物。
该类别的硫酸化单糖或寡糖(由1至10个单糖单元形成)令人关注，因为它们会容易地通过合成制得，还因为它们的糖类结构仍然与胞外基质的组分糖胺聚糖的糖类结构近似，它们可以很好地被代谢，同时产生无毒的分解产物。
例如，对透明质酸酶有活性的低聚半乳糖已被描述于已发表的如下著作中：S.Salmen等，Planta Medica，71，No.8，2005年，第727-732页，特别是毛蕊花糖、车前糖及新霉素，其表现出的抗透明质酸酶活性比芹黄素(一种已知的透明质酸酶抑制剂)高100倍至500倍。
源自透明质酸的全部O-硫酸化低聚糖的抗透明质酸酶性质也被描述在现有技术中，例如A.Suzuki等，Glycobiology，2001年，第11(1)期，第57-64页。已证实源自透明质酸的O-硫酸化低聚糖对透明质酸酶的抑制作用与其硫酸酯基团官能度及所述低聚糖大小之间的相关性。更特别注意到：这些O-硫酸化低聚糖的抑制活性与所述低聚糖大小有关。
还有硫酸化单糖(例如硫酸化葡糖胺，例如葡糖胺-3-硫酸)已被描述为软骨分解的抑制剂(J.I.Fenton等，Osteoarthritis and Cartilage，2000年，第8卷，第6期，第444-451页)。
这些低聚糖中，还包括由2个单糖单元(葡萄糖和果糖)缩合形成的低聚糖。
Marion Laboratories名下的专利EP0230023中已描述硫酸化蔗糖(与其他硫酸化低聚糖类似)被用作局部施用的伤口愈合促进剂，以溶液或胶原基质或基于聚乙烯醇给药。
在Bar-Shalom名下的WO 89/05646和EP 0640346中，描述了包含蔗糖八硫酸酯的盐的组合物，更具体的例子为蔗糖八硫酸酯的铝盐，其是意在用于局部施用或注射到组织(包括关节)中的不溶性盐。蔗糖八硫酸酯的盐更特别的是利用它们的愈合性质。在愈合应用的上下文中，透明质酸也能用作促进愈合的活化剂。
Dumex-Alpharma名下的WO 98/22114公开了包含由多糖(例如壳聚糖或透明质酸)及硫酸化低聚糖(例如蔗糖八硫酸酯或其盐)形成的化合物的组合物。本文的这些组合物再次意在促进包含胶原的组织(例如皮肤、骨骼及粘膜)的伤口愈合。利用各种不同技术证明了复合物的形成，例如NMR光谱、红外光谱、X射线衍射、热力学分析及规定条件下的溶解度测试。
意在植入或注射的组合物的生产意味着在其生产过程中对其进行灭菌，以遵守对这种组合物的最低卫生要求。在这种组合物的生产过程中最广泛使用的灭菌方法是蒸汽灭菌(或称高压灭菌)，这类灭菌方法会导致组成组合物的产品的分解。因此，在高压灭菌期间保留并保持流变学特性、pH度量及生物相容性是必要的。这同样适用于通过细针头的可注射要求(这些组合物的主要使用方式)。
通过让人非常惊喜并意外的测试已证实：利用蔗糖八硫酸酯(SOS)的水溶性盐配制的透明质酸凝胶，在所有可能的候选对象中，是唯一可能获得在蒸汽灭菌(另称为高压灭菌)期间稳定的组合物的凝胶，并且相比于不含蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含透明质酸凝胶，所述凝胶由于其对透明质酸酶导致的分解的抗性，还表现出升高的持久性(rémanence)。
蔗糖八硫酸酯水溶性盐在每个蔗糖分子上都有8个硫酸酯基团；因此，在利用蔗糖八硫酸酯水溶性盐配制的凝胶中，每mg SOS中硫酸酯基团的加入量高。本公司申请人还已证实：让人惊喜的是，向基于透明质酸的凝胶中加入蔗糖八硫酸酯水溶性盐不会导致灭菌过程中凝胶粘性或弹性的降低。
发明内容
本发明中，本公司申请人旨在通过加入蔗糖八硫酸酯水溶性盐来解决由透明质酸酶导致的含透明质酸组合物分解的问题，同时保持这些组合物用于填充皱纹、粘弹性补充、化妆品制剂或药物制剂领域的能力，这是由于其在生产过程中的蒸汽灭菌阶段流变学特性的稳定性。
本发明使得能够解决所有上述问题，另外，使得能够获得根据本发明的组合物，所述组合物在高压灭菌期间保持其流变性特性，并且相比于现有技术的组合物具有更高的持久性(更长的半衰期)。
本发明涉及包含至少一种交联或非交联的透明质酸或其一种盐，以及至少一种蔗糖八硫酸酯水溶性盐的灭菌组合物；还涉及生产所述组合物的方法，以及所述组合物在配制粘弹性补充组合物或在配制作为填充皱纹的组合物、在配制化妆品组合物或在配制药物组合物中的用途。
根据本发明的组合物具备透明质酸酶抗性，其特征在于蒸汽灭菌之后保持的至少与仅包含至少一种交联或非交联的透明质酸或其一种盐的组合物的流变性特性类似的流变性特性。本发明还涉及包含根据本发明的组合物以及至少一种化妆品可接受的赋形剂的化妆品制剂。
出人意料的是，本发明使得能够获得抗透明质酸酶并且满足关于意在前述领域的组合物高压灭菌的稳定性要求的组合物。
本发明涉及一种在水性介质中的组合物，其包含至少一种透明质酸以及至少一种蔗糖八硫酸酯水溶性盐，其特征在于所述组合物是物理混合物，并且透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]大于或等于0.1。
“透明质酸”被理解为交联或非交联透明质酸(单独或作为混合物)，任选地通过取代进行化学改性(单独或作为混合物)，任选地为其一种盐的形式(单独或作为混合物)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含至少一种非交联透明质酸或其一种盐(单独或作为混合物)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含至少一种交联透明质酸或其一种盐(单独或作为混合物)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含至少一种共交联透明质酸或其一种盐(单独或作为混合物)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含至少一种交联或非交联的、通过取代进行化学改性的透明质酸或其一种盐(单独或作为混合物)。
在一个实施方案中，所述透明质酸为钠盐或钾盐形式。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于蔗糖八硫酸酯水溶性盐选自碱金属盐、碱土金属盐、银盐、铵盐及氨基酸盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于蔗糖八硫酸酯水溶性盐选自碱金属盐和碱土金属盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于蔗糖八硫酸酯水溶性盐为蔗糖八硫酸酯的钠盐或蔗糖八硫酸酯的钾盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于蔗糖八硫酸酯水溶性盐为蔗糖八硫酸酯的钠盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于蔗糖八硫酸酯水溶性盐为蔗糖八硫酸酯的钾盐。
蔗糖八硫酸酯的钾盐的最大溶解度为40mg/g；因此，假定本发明组合物中HA的最小可接受浓度为4mg/g以获得用于本发明用途的适当一致性，本发明组合物的最小[HA]/[SOS]比率为0.1。由于蔗糖八硫酸酯的钠盐的溶解度大于其钾盐的溶解度，因此在确定[HA]/[SOS]比率的最小值时已考虑蔗糖八硫酸酯的钾盐的溶解度极限。
“水性介质”被理解为水溶液形式的组合物，任选地存在可溶盐或缓冲液，任选地为凝胶或水凝胶形式。
“物理混合物”被理解为一种混合物，其中该混合物的组分的所有物理化学性质都得以保留，也就是说，这些性质与混合物组分在分开时的物理化学性质是严格相同的，能够通过各种分析方法表征所述物理化学性质的完整性。本公司申请人已选择核磁共振(NMR)光谱用于表征所述物理混合物。根据本发明的混合物的NMR光谱是一维质子1H光谱。例如，包含蔗糖八硫酸酯水溶性盐的物理混合物的NMR光谱的特征在于：单独处于溶液中的蔗糖八硫酸酯水溶性盐的质子的化学位移值，与根据本发明的物理混合物中蔗糖八硫酸酯水溶性盐的质子的化学位移值相等，这证明：蔗糖八硫酸酯水溶性盐与透明质酸之间没有相互作用或不反应。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：当利用质子1HNMR光谱进行分析时，蔗糖八硫酸酯的盐的端基质子的化学位移值(δ＝5.7ppm)，与单独处于溶液中的蔗糖八硫酸酯的盐的端基质子的化学位移值相等。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为0.1至5000。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为0.1至2500。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为1至1000。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为10至500。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为0.1至100。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]为0.5至50。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的含量[HA]与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的含量[SOS]按重量计的比率[HA]/[SOS]等于20。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：蔗糖八硫酸酯水溶性盐相对于组合物的含量为0.01mg/g至40mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：蔗糖八硫酸酯水溶性盐相对于组合物的含量为0.1mg/g至10mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：蔗糖八硫酸酯水溶性盐相对于组合物的含量为0.1mg/g至1mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸相对于组合物的含量为2mg/g至50mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸相对于组合物的含量为4mg/g至40mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸相对于组合物的含量为10mg/g至30mg/g。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其包含至少一种非交联透明质酸。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其包含至少一种交联透明质酸。
本发明中，交联度X定义为等于如下比率：
X＝引入反应介质的交联剂的摩尔数
引入反应介质的二糖单元的摩尔数
在一个实施方案中，交联透明质酸显示0.001至0.5的交联度X。
在一个实施方案中，交联透明质酸显示0.01至0.25的交联度X。
在一个实施方案中，交联透明质酸显示0.1至0.2的交联度X。
在一个实施方案中，透明质酸是共交联的，如Fermentech名下的申请WO 2000/0046253或Cornéal名下的WO 2004/092222乃至Anteis名下的FR 2 865 737中所述。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其包含Innomed Ltd名下的申请WO 2005/061611中所述的交联和非交联的透明质酸的混合物。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其包含交联的透明质酸的混合物。
在一个实施方案中，所述交联的透明质酸的混合物为单相混合物，例如本公司申请人名下的专利申请WO 2009/071697中所述。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其包含由赋予亲脂性或保湿性的基团取代的至少一种透明质酸，例如本公司申请人名下的申请WO 2013/079889中所述的取代的透明质酸。
在一个实施方案中，所述组合物额外地包含另一种多糖。
在一个实施方案中，所述另一种多糖选自纤维素、褐藻酸或其一种盐。
Mw或“分子量”是指聚合物的重量平均分子量(以道尔顿为单位)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的分子量Mw为0.01MDa至5MDa。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：透明质酸的分子量Mw为0.1MDa至3.5MDa。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其额外地包含至少一种活性成分。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述活性成分选自抗氧化剂、局部麻醉剂或维生素(单独或组合使用)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述抗氧化剂选自多元醇。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述抗氧化剂选自甘露醇和山梨醇(单独或组合使用)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述抗氧化剂选自甘露醇。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述抗氧化剂选自山梨醇。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述抗氧化剂为甘露醇和山梨醇的组合。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述局部麻醉剂选自利多卡因、普鲁卡因、甲哌卡因、柔匹华卡因、布比卡因及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：所述局部麻醉剂为盐酸利多卡因。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：相对于所述组合物总重量，所述活性成分的含量按重量计为0.01wt％至10wt％。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：相对于所述组合物总重量，所述活性成分的含量按重量计为0.1wt％至5wt％。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于：其在蒸汽灭菌下是稳定的。
在一个实施方案中，本发明是粘弹性补充组合物，其特征在于其包含至少一种根据本发明的组合物。
在一个实施方案中，本发明是用于治疗干眼病或眼珠干涩的组合物，其特征在于其包含至少一种根据本发明的组合物。
根据实施方案，所述组合物实施方案用作人工泪液、泪液凝胶或润滑剂。
在一个实施方案中，本发明是化妆品制剂，其特征在于其包含根据本发明的组合物以及至少一种化妆品可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，根据本发明的化妆品制剂的特征在于：其包含相对于所述化妆品制剂总重量按重量计为0.01wt％至10wt％的根据本发明的组合物。
在一个实施方案中，根据本发明的化妆品制剂的特征在于：所述至少一种化妆品可接受的赋形剂选自常规化妆品辅料。
“常规化妆品辅料”被理解为特别地选自如下的赋形剂：脂肪物质、有机溶剂、离子或非离子增稠剂、软化剂、抗氧化剂、乳浊剂、稳定剂、软化剂、硅氧烷、α-羟基酸、消泡剂、保湿剂、香料、防腐剂、表面活性剂、填料、螯合剂、聚合物、推进剂、碱化或酸化剂、着色剂或化妆品中常用的任何其他组分。
根据本发明的化妆品制剂可额外地包含其他活性剂，特别是保湿剂、湿润剂、舒缓剂(apaisants)、抗炎剂或伤口愈合剂(cicatrisants)。
根据本发明的化妆品制剂可依照本领域技术人员公知的技术制备，特别是那些意在制备水包油(O/W)或油包水(W/O)型乳剂的技术。
这种化妆品制剂特别地可以简单或复合乳液(O/W、W/O、O/W/O或W/O/W)的形式提供，例如乳膏、乳、凝胶、胶状乳液，也可以粉剂、固体棒剂的形式提供，还能任选地包装到气溶胶中并以摩丝或喷雾的形式提供。
在一个实施方案中，所述化妆品制剂根据本领域技术人员公知的技术进行消毒，特别是γ射线辐照。
本发明还涉及根据本发明的化妆品制剂，其特征在于：其可以洗剂、乳膏、油剂、棒剂、洗发剂或任何其他适当的形式进行局部施用。
根据本发明的化妆品制剂、皮肤科用制剂或药物制剂能用作保护人类表皮的组合物免受外部因素的侵扰，并且因此能阻止表皮的早衰。
本发明还涉及根据本发明的组合物的生产方法。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其包括至少如下步骤：
-至少一种透明质酸的纤维的水合步骤，以获得水凝胶，
-将前述步骤所获得的水凝胶与蔗糖八硫酸酯水溶性盐的溶液混合的步骤，
-均质化步骤，以及
-蒸汽灭菌步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述水合步骤在室温下实施。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述均质化步骤在室温下实施。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述蒸汽灭菌步骤在121℃至134℃的温度下实施，该步骤持续调整到所述温度的时段。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其额外地包括至少一个包装步骤，其中将均质化混合物包装入注射器中。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其额外地包括至少一个包装步骤，其中将均质化混合物包装入单剂量瓶中。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其额外地包括至少一个交联步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述交联步骤是在所述水合步骤与所述混合步骤之间进行的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其包括按照WO 2013/079889中所述方法来混合两种预先交联的透明质酸的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述交联步骤是借助于至少一种交联剂来实施的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述交联剂是双官能或多官能的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述双官能交联剂或多官能交联剂选自：乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚甘油聚缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、双或多环氧化合物(例如1，2，3，4-双环氧丁烷或1，2，7，8-双环氧辛烷)、二烷基砜、二乙烯基砜、甲醛、环氧氯丙烷，或可选戊二醛或碳化二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：所述双官能交联剂为丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或1，2，7，8-双环氧辛烷。
在一个实施方案中，根据本发明的生产方法的特征在于，所述交联步骤是根据本领域技术人员已知的技术实施的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法的特征在于：其在所述交联步骤之后，包括至少一个纯化和洗涤步骤，其根据本领域技术人员已知的技术实施。
本发明涉及根据本发明的组合物在配制粘弹性补充组合物中的用途。
本发明涉及根据本发明的组合物在配制作为填充皱纹的组合物中的用途。
目标应用更特别地是那些常见于用于或潜在可用于如下疾病或治疗的可注射粘弹性补充产品的应用：
-面部美容注射：用于填充皱纹、皮肤缺陷或体积缺陷(颧骨、下巴、唇)；
-体内丰盈注射：乳房及臀部增大、G点增大、阴道成形术、阴道阴唇的重建或阴茎增大；
-治疗骨关节炎，注射到关节中以替代或补充不足的滑液；
-在治疗括约肌机能不全导致的尿失禁中的尿道周围注射；
-特别用于防止腹膜粘连的手术后注射；
-通过激光巩膜切开的远视外科手术之后的注射；
-向玻璃体腔中的注射。
更特别地，在美容手术中，根据其粘弹性补充及持久性，根据本发明方法获得的水凝胶可用于：
-用于填充微细、中度、深度皱纹，并可用细针头(例如27号)注射；
-利用通过直径更大(例如22号至26号)且长度更长(例如30mm至40mm)的针头的注射，作为丰盈产品；这种情况下，其粘合性将使得能够确保其保持在注射位置。
根据本发明的组合物还在关节外科中具有重要应用，以及在口腔外科具有例如用于填充牙周袋的重要用途。
这些实施的例子绝非限制性的，根据本发明的组合物更广泛地用于：
-填充体积；
-在某些组织间产生空隙，由此发挥它们的最佳机能；
-代替不足的生理流体。
本发明还涉及包含根据本发明的组合物的套装，其包装于注射器中并在包装后进行灭菌。
本发明还涉及包含根据本发明的组合物的套装，其包装于单剂量瓶中并在包装后进行灭菌。
根据本发明的组合物在化妆品或医药领域中也是有用的。
更特别地，在化妆品领域中，根据本发明的组合物将用作化妆品组合物中的保湿活性成分。
在医药领域中，根据本发明的组合物将用作使患有干眼病的眼睛保湿的组合物，即作为人工泪液。
在这些化妆品和/或医药应用中，本发明组合物可额外地包含任何化妆品和/或药学上可接受的组分。
根据本发明的组合物的特征、它们的制备方法及其性质在以下的实施例中进行详述。
实施例1
本实施例说明根据本发明的包含非交联透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的组合物。
在容器中称取可注射等级的透明质酸钠(NaHA)纤维(1g；分子量：约2.7MDa)。加入磷酸盐缓冲水溶液(32.3g)，在室温及900mmHg的大气压下，用刮铲将全部物质均质化约1小时。
由此所得的非交联NaHA水凝胶的NaHA浓度为约30mg/g。
将蔗糖八硫酸酯钾(KSOS)(60mg，即4.7×10-5mol)溶于磷酸盐缓冲溶液(19.94g)中，以获得浓度为3mg/g的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液。
通过加入上述制备得到的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液，将前述步骤所获得的NaHA水凝胶进行稀释。随后将由此得到的组合物均质化。
由此得到了包含浓度为20mg/g的非交联NaHA及浓度为1mg/g的KSOS的组合物；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
表7中所述的凝胶是通过调整使用量根据与上述相同的方法制备的。
实施例2
本实施例说明根据本发明的包含交联透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的组合物。
根据Vivacy名下的WO 2009/071697(实施例1，第1部分)中描述的交联方法，以透明质酸钠(NaHA)纤维(1g；分子量：约2.7MDa)及丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(54mg)为原料，制备得到包含交联透明质酸的组合物。由此所得的组合物的交联NaHA浓度为约30mg/g，交联度X为约0.12。
按照实施例1制备浓度为3mg/g的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液。
在上述制备得到的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液中稀释前述步骤中所获得的交联NaHA水凝胶。随后将由此得到的组合物均质化。
由此得到了包含浓度为20mg/g的交联NaHA及浓度为1mg/g的蔗糖八硫酸酯钾的组合物；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
表8中所述的凝胶是通过调整使用量根据与上述相同的方法制备的。
实施例3
本实施例说明根据本发明的包含非交联透明质酸、蔗糖八硫酸酯钾及甘露醇的示例性组合物。
根据实施例1的方法，以30mg/g浓度的透明质酸水凝胶及10mg/g浓度的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液为原料，制备包含非交联透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的组合物。
根据Anteis名下的WO 2009/024670中描述的方法，向上述获得的组合物中进行添加86mg/g浓度的甘露醇溶液。
由此得到的组合物包含浓度为20mg/g的非交联NaHA、浓度为20mg/g的甘露醇及浓度为1mg/g的蔗糖八硫酸酯钾；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
实施例4
本实施例说明根据本发明的包含交联透明质酸、蔗糖八硫酸酯钾及甘露醇的示例性组合物。
根据实施例2的方法，以30mg/g浓度的NaHA水凝胶及10mg/g浓度的蔗糖八硫酸酯钾为原料，制备包含交联NaHA的组合物。
根据Anteis名下的WO 2009/024670中描述的方法，向上述获得的组合物中进行添加86mg/g浓度的甘露醇溶液。
由此得到的组合物包含浓度为20mg/g的交联透明质酸、浓度为20mg/g的甘露醇及浓度为1mg/g的蔗糖八硫酸酯钾；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
实施例5
本实施例说明根据本发明的包含非交联透明质酸、蔗糖八硫酸酯钾及利多卡因的示例性组合物。
根据实施例1的方法，以30mg/g浓度的透明质酸水凝胶及10mg/g浓度的蔗糖八硫酸酯钾溶液为原料，制备包含非交联透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的组合物。
根据Anteis名下的WO 2009/024670中描述的方法，或者根据Vivacy名下的申请US 61/791 977或FR 13/52971中描述的方法，向上述获得的组合物中进行添加13mg/g浓度的利多卡因溶液。
由此得到的组合物包含浓度为20mg/g的非交联透明质酸、浓度为3mg/g的利多卡因及浓度为1mg/g的蔗糖八硫酸酯钾；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
实施例6
本实施例说明根据本发明的包含交联透明质酸、蔗糖八硫酸酯钾及利多卡因的示例性组合物。
根据实施例2的方法，以30mg/g浓度的NaHA水凝胶及10mg/g浓度的蔗糖八硫酸酯钾为原料，制备包含交联NaHA的组合物。
根据Anteis名下的WO 2009/024670中描述的方法，或者根据Vivacy名下的申请US 61/791 977或FR 13/52971中描述的方法，向上述获得的组合物中进行添加13mg/g浓度的利多卡因溶液。
由此得到的组合物包含浓度为20mg/g的交联透明质酸、浓度为3mg/g的利多卡因及浓度为1mg/g的蔗糖八硫酸酯钾；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为20。
将上述得到的组合物包装到注射器中，将其经蒸汽灭菌消毒(T＝121℃，10分钟)。
实施例1至6中制得的组合物可用于粘弹性补充或用作填充流体。
实施例7
本实施例说明根据本发明的包含非交联透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的组合物用于治疗干眼病。
在容器中称取可注射等级的透明质酸钠(NaHA)纤维(1g；分子量：约1MDa)。加入磷酸盐缓冲水溶液(165.7g)，在室温及900mmHg的大气压下，用刮铲将全部物质均质化约1小时。
由此所得的非交联NaHA水凝胶的NaHA浓度为约6mg/g。
将蔗糖八硫酸酯钾(KSOS)(600mg，即4.7×10-4mol)溶于磷酸盐缓冲溶液(19.94g)中，以获得浓度为30mg/g的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液。
通过加入上述制备得到的蔗糖八硫酸酯钾的水溶液，将前述步骤所获得的NaHA水凝胶进行稀释。随后将由此得到的组合物均质化。
由此得到包含浓度为4mg/g的非交联NaHA及浓度为10mg/g的KSOS的组合物；因此以重量计的[HA]/[SOS]比率为0.4。
将上述得到的组合物包装到单剂量瓶中，将其灭菌。
实施例8
本实施例说明化妆品制剂。
实施例9
本实施例说明灭菌化妆品制剂。
根据实施例1获得的非交联透明质酸及蔗糖八硫酸酯钾盐的组合物，其中
以剂量为5-25kGy(优选7-15kGy)的γ射线辐照对上述化妆品制剂进行灭菌。
实施例10
关于蒸汽灭菌的稳定性
对于根据本发明的包含非交联透明质酸的组合物，经蒸汽灭菌步骤之后该灭菌组合物的粘度η，利用TA Instruments的AR 2000Ex型流变仪在受控的约束条件及25℃下进行表征。所述粘度值在约束为0.02s-1下记录。
对于包含非交联透明质酸的组合物，粘度损失的百分比为：蒸汽灭菌后参考组合物的粘度与包含非交联透明质酸和硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的组合物在经蒸汽灭菌后的粘度的差值，相对于蒸汽灭菌后参考组合物粘度值的百分比。
对于根据本发明的包含交联透明质酸的组合物，经高压灭菌步骤之后灭菌组合物的弹性分量G’，利用TA Instruments的AR 2000Ex型流变仪在振荡条件及25℃下进行表征。所述弹性分量值在1Hz频率下记录。
对于上述包含交联透明质酸的组合物，弹性分量G’损失的百分比为：蒸汽灭菌后参考组合物的弹性分量G’与包含交联透明质酸和硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的组合物在经蒸汽灭菌后的弹性分量G’的差值，相对于蒸汽灭菌后参考组合物的弹性分量G’值的百分比。
对于所有这些测试，配制一种参考组合物，将硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液代替。
a)关于包含非交联透明质酸及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的组合物经蒸汽灭菌的稳定性。
根据实施例1所述的方法制备了9种包含非交联透明质酸及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(在组合物中的浓度为1mg/g)的组合物。
还配制了参考组合物，将硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液代替。
测定了根据实施例1方法制得的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌步骤后的粘度损失百分比，所得结果列于下表1中：
表1
包含非交联透明质酸及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(浓度为1mg/g)的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的粘度损失百分比
经蒸汽灭菌步骤后，除了包含蔗糖八硫酸酯水溶性盐的组合物之外，均观测到其他所有组合物粘度损失。观测到包含硫酸化葡萄糖胺(N-乙酰化或未乙酰化以及2位或6位硫酸化)的组合物的最大损失。至于包含硫酸化低聚多糖(例如硫酸葡聚糖或硫酸软骨素)的组合物，它们的粘度损失较小。
b)对于包含非交联透明质酸、硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖及甘露醇的组合物经蒸汽灭菌的稳定性
根据实施例3所述的方法制备了一系列的5种包含非交联透明质酸、甘露醇及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(在组合物中的浓度为1mg/g)的组合物。
还配制了参考组合物，将硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液代替。
测定了根据实施例3的方法制得的组合物相对于参考组合物的粘度损失百分比，所得结果列于下表2中：
表2
包含非交联透明质酸、甘露醇及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(浓度为1mg/g)的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的粘度损失百分比
观测到包含非交联透明质酸、甘露醇及葡萄糖胺硫酸酯的组合物相对于参考组合物的粘度损失。
未观测到相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的粘度损失的唯一组合物为包含蔗糖八硫酸酯水溶性盐的组合物。
c)关于包含交联透明质酸、硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖及甘露醇的组合物经蒸汽灭菌的稳定性。
根据实施例4所述的方法制备了一系列的4种包含交联透明质酸、甘露醇及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(在组合物中的浓度为1mg/g)的组合物。
还配制了参考组合物，将硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液代替。
测定了根据实施例4方法制得的组合物相对于参考组合物的弹性分量G’损失百分比，所得结果列于下表3中：
表3
包含交联透明质酸、甘露醇及硫酸化低聚多糖或硫酸化单糖(浓度为1mg/g)的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的弹性分量G’损失百分比
观测到包含非交联透明质酸、甘露醇及硫酸化葡萄糖胺(N-乙酰化或未乙酰化以及2位或6位硫酸化)的组合物相对于参考组合物的弹性分量G’损失。
未观测到包含蔗糖八硫酸酯钾的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的弹性分量G’损失。
总之，仅仅未观测到包含蔗糖八硫酸酯钠或蔗糖八硫酸酯钾的组合物相对于参考组合物的经蒸汽灭菌后的粘度或弹性分量G’损失。不管透明质酸是否交联还是组合物是否包含甘露醇，该观测结果都是相同的。
因此，这些组合物仅是使得能够获得恰好与经蒸汽灭菌后的参考组合物一样稳定的产品的组合物。
实施例11
包含透明质酸和蔗糖八硫酸酯钾的物理混合物的光谱学特性
对实施例4的组合物进行了1H NMR分析。对实施例4组合物在灭菌之前以及在灭菌之后进行光谱学表征。
在600MHz(1H)下操作且装备有TCI探头(CryoProbe)的Bruker Avance光谱仪上进行溶液分析。
结果表示如下：
-图1是蔗糖八硫酸酯钾单独在水溶液中的1H NMR光谱，
-图2是实施例4的组合物在灭菌之前和在灭菌之后的1H NMR光谱的叠加图。
图1的蔗糖八硫酸酯钾单独溶于水的溶液的1H NMR光谱使得能够部分归属信号峰。蔗糖八硫酸酯钾的端基质子的化学位移值(δ＝5.7ppm)作为参考。
蔗糖八硫酸酯钾的端基质子的图示
蔗糖八硫酸酯钾单独溶于水的溶液中，或于实施例4的组合物中，其端基质子的化学位移值相同。因此，NMR分析证实：蔗糖八硫酸酯钾不与透明质酸反应从而形成复合物，并且实施例4的组合物是蔗糖八硫酸酯钾水溶液与包含交联透明质酸的水凝胶的物理混合物。
图2中，实施例4组合物在蒸汽灭菌之前和在蒸汽灭菌之后的1HNMR光谱的叠加图证实：两图谱是极为相似的。如图2所示，蔗糖八硫酸酯钾和透明质酸的化学结构经蒸汽灭菌后并未改变。这证实了上文测得的与实施例4组合物的流变性特性相关的结果。
实施例12
酶降解试验
以出版物“Comparison of the sensitivity of11crosslinked hyaluronic acid gels to bovine testis hyaluronidase”，I.Sall and G.Ferard，Polymer Deg.and Stability，(2007)，92，第915-919页”及专利申请WO 2009/068215中描述的试验为基础开展降解试验。
对根据实施例2方法制备的组合物(包含浓度20mg/g的交联NaHA及NaCl缓冲溶液中浓度为3mg/g的蔗糖八硫酸酯钾，组合物A)以及实施例4的组合物(组合物B)(均经蒸汽灭菌消毒)，以及参考组合物(也经蒸汽灭菌消毒)进行酶分解试验。通过将蔗糖八硫酸酯钾的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液替代，配制了参考组合物A和参考组合物B。
在37℃下对所述组合物进行体外酶降解试验。该试验使得能够模拟之后的已注入组合物的体内持久性。
通过将受试组合物与透明质酸酶溶液混合，通过透明质酸酶降解所述组合物。
通过37℃下的流变学(利用TA Instruments的AR 2000Ex型流变仪)监测所述降解，测定复数粘度。这两种组合物的降解结果的趋势曲线继而使得能够评估这些不同组合物的半衰期(n*＝n*0/2所需要的时长，单位为分钟，其中n*0＝待表征组合物在t0时的复数粘度)。
所得到的半衰期列于下表4中：
表4
对根据实施例2的KSOS浓度为3mg/g的组合物(组合物A)以及实施例4的组合物(组合物B)(均经蒸汽灭菌)、以及基于交联透明质酸经蒸汽灭菌消毒的参考组合物进行酶降解试验。
在相同条件下，经蒸汽灭菌消毒后的组合物A和B表现出比经蒸汽灭菌消毒的那些参考组合物更长的半衰期；特别地，经蒸汽灭菌消毒后的组合物A和B的酶降解持久性，分别比经蒸汽灭菌消毒的参考组合物A和B高24％和43％。
实施例13
氧化降解试验
在相同条件下，对根据实施例4的组合物(经蒸汽灭菌消毒)及参考组合物(也经蒸汽灭菌消毒)进行氧化降解试验。通过将蔗糖八硫酸酯钾的水溶液用相同量的磷酸缓冲水溶液代替，配制了参考组合物。
在45℃下对所述组合物进行体外氧化降解试验。该试验使得能够模拟之后的已注入组合物的体内持久性。
所述组合物在过氧化氢水溶液存在下发生降解。通过45℃下的流变学(利用TA Instruments的AR 2000Ex型流变仪)监测所述降解，测定复数粘度。这些组合物的降解结果的趋势曲线继而使得能够评估这些不同组合物的半衰期(n*＝n*0/2所需要的时长，单位为分钟，其中n*0＝待表征组合物在t0时的复数粘度)。
所得到的半衰期列于下表5中：
表5
对根据实施例4的组合物(经蒸汽灭菌消毒)以及参考组合物(基于交联透明质酸，也经蒸汽灭菌消毒)进行的氧化降解试验。
在相同条件下，经高压蒸汽灭菌消毒的根据实施例4的组合物表现出比也经高压蒸汽灭菌消毒的参考组合物更长的半衰期；特别地，经蒸汽灭菌消毒的实施例4的组合物的氧化降解持久性，比经蒸汽灭菌消毒的参考组合物高30％。
实施例14
对作为参考凝胶的含20mg/g交联NaHA凝胶(IPN类凝胶，以M品牌出售)的KSOS制剂(不同浓度)进行的试验例。
对凝胶灭菌，然后进行表征。
根据实施例8测定相对于参考组合物的弹性分量G’的损失百分比，并测定参考凝胶与包含蔗糖八硫酸酯钾的凝胶之间的可注射力(利用30-号1/2皮下注射针头)之差。
结果列于下表6中：
表6
在存在各种浓度的蔗糖八硫酸酯钾下包含交联透明质酸的组合物在经蒸汽灭菌后的弹性分量G’的损失百分比
未观测到包含交联透明质酸及蔗糖八硫酸酯钾的组合物经高压灭菌后的弹性分量G’的损失(无论组合物中的蔗糖八硫酸酯钾浓度如何)。
相对于参考制剂，无论蔗糖八硫酸酯钾含量如何，也未观测到任何可注射力的升高。
实施例15
含实施例1的非交联凝胶(浓度和比率见下表7所述)的KSOS制剂(不同浓度)的试验例。
对所述凝胶灭菌，然后根据实施例8进行流变学表征。
表7
不同[HA]/[SOS]比率下的组合物经高压灭菌后的粘度损失百分比
无论[HA]/[SOS]比率如何，均未观测到所述组合物经高压灭菌后的粘度损失。
实施例16
对于KSOS与含交联透明质酸的凝胶(浓度和比率见下表8)的制剂的试验例。
根据实施例2所述的方法制备所述凝胶，然后根据实施例8进行流变学表征。
表8
高压灭菌后的弹性分量G’的损失百分比。
未观测到在[HA]/[SOS]比率为0.4的经高压灭菌后的组合物的弹性分量G’损失。