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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711272834.8 (22)申请日 2017.12.01 (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 许激扬 卞筱泓 陈际宇 史心悦 杨青晨 张怡静 钟斯卉 张真赫 (51)Int.Cl. A61K 31/7034(2006.01) A61P 9/14(2006.01) (54)发明名称 天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞 药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种天然单体天麻素对同型 半胱氨酸诱导的人脐静。
2、脉血管内皮细胞损伤的 保护作用。 通过一定浓度的同型半胱氨酸预处 理， 诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤， 建立损伤 模型。 在此模型的基础上， 加入天麻素， 通过细胞 活力检测， 确定了天麻素保护细胞的有效浓度， 通过检测ROS以及p-eNOS/eNOS和Cav-1的表达确 定了天麻素保护内皮细胞是通过eNOS/Cav-1信 号通路。 本发明首次应用天麻素对人脐静脉血管 内皮细胞进行保护并确证其保护机制。 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 CN 107929294 A 2018.04.20 CN 107929294 A 1.天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应用。 2.如权利要求。
3、1所述的应用， 其特征在于： 所述的人脐静脉血管内皮细胞为HUVEC。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于： 天麻素在同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血管 内皮细胞有效作用浓度为50-800 g/mL。 4.天麻素对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血管内皮细胞的保护作用是通过eNOS/Cav- 1信号通路。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107929294 A 2 天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学和药理学技术领域， 具体涉及人脐静脉血管内皮细胞损伤 模型的建立， 特别涉及天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应用。 背景技。
4、术 0002 高血压为临床常见病和多发病， 其主要并发症有中风、 心肌梗死及肾功能衰竭， 严 重危害人们的身心健康， 其是心脑血管病死亡的主要因素之一。 由于高血压的发病多为遗 传、 环境、 生物等多因素共同决定的， 其发病涉及体内物质代谢的紊乱和多系统多器官的病 变及功能失调。 大量西药的降压药物只能通过单靶点的对抗作用降压， 存在药物副作用大、 耐药性高、 常需联合用药等问题， 给患者带来沉重的经济负担， 这些都影响着患者的依从性 及降压疗效。 而与之相比， 中药治疗高血压不仅副作用小， 价格低廉， 且是通过多靶点、 多层 次等途径降低血压， 不在于单纯降低血压， 更在于调整机体阴阳的平衡。
5、从而明显改善症状， 提高生存质量， 在降低心脑血管系统并发症及靶器官损伤， 改善物质代谢， 促进心、 脑、 肾、 血管病理改变的恢复等多方面具有作用。 中药疗效持久， 在治疗高血压病方面具有独特的 优势。 因此研制开发疗效确切的治疗高血压的纯中药制剂具有良好的市场前景和积极的社 会效益， 符合医药发展趋势。 0003 高血压发病机制复杂， 除了肾素-血管紧张素-醛固酮系统、 肾脏因素和遗传因素 等， 多项研究表明高同型半胱氨酸(Hcy)水平也是高血压病发病机制中重要的环节。 Hcy是 导致心血管疾病重要的危险因子。 血液中同型半胱氨酸的浓度比半胱氨酸的浓度要更高， 但是半胱氨酸并不对细胞造成损。
6、伤， 同时也有研究表明同型半胱氨酸通过内质网应激反 应， 引起未折叠蛋白反应使蛋白不能正常折叠最终导致细胞损伤。 许多研究表明， Hcy能够 诱导促凝血因子， 诱导细胞坏死和凋亡。 同型半胱氨酸对内皮细胞损伤涉及多条机制， 包括 促进氧化剂的活性， 抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性， 通过激活NF-kB增加炎症反应， 促进血 管平滑肌细胞的生长， 导致胶原合成增加。 Hcy促进活性氧(ROS)的产生导致内皮细胞的损 伤。 Hcy通过减少一氧化氮(NO)的释放损伤内皮细胞的功能， 降低NO的生物活性和内皮依赖 的血管松弛。 内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通过连接到小凹蛋白(Cav-1)特定位点以调节其。
7、 活性。 在静息条件下， Cav-1对eNOS有负调控作用； 在激动剂的作用下， 通过调控蛋白的介 导， eNOS可以和Cav-1解离， 但不会离开， 这增加了合成NO的能力。 当Cav-1过表达， eNOS和 Cav-1结合过多导致NO合成减少。 以上这些均会导致高血压的发生。 因此， 选用Hcy对实验细 胞进行损伤。 0004 高血压病和内皮细胞功能障碍之间有密不可分的关系。 高血压是内皮损伤的始动 因素之一， 在高血压病理状态下， 主要表现为内皮依赖性舒张功能减弱或内皮依赖性收缩 功能增强以及血管壁炎症反应的增强。 高血压患者血流动力增加， 影响血管内皮细胞的 eNOS和Cav-1的分泌。
8、， 可引起血管内皮细胞紊乱， 形态和结构的改变和功能的失调， 同时使 氧自由基增多， 进而引起收缩血管物质增加， 使扩张血管物质减少而导致血管变形。 因此， 选用人脐静脉血管内皮细胞为实验细胞， 通过检测ROS和p-eNOS/eNOS、 Cav-1蛋白表达， 确 说 明 书 1/3 页 3 CN 107929294 A 3 证天麻素对细胞的保护作用及其机制。 0005 目前明确有降压作用的中药和有效成份较多， 如钩藤、 葛根、 天麻、 牛膝、 天麻等。 使用天麻进行降血压的治疗由来已久， 其降血压机制是通过多种活性成分和多种机制产生 的。 其中主要包括天麻素， 天麻苷元以及天麻多糖等， 但是关。
9、于天麻素治疗同型半胱氨酸发 病机制的高血压并未见报道。 因此， 选用天麻素作为药物对研究天麻在临床应用， 特别是在 高血压疾病中具有指导意义。 发明内容 0006 本发明的第一个目的在于提供天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物 中的应用。 本发明确证了天麻中天麻素具有药物活性， 对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血 管内皮细胞具有保护作用。 0007 其中， 所述的人脐静脉血管内皮细胞为HUVEC。 0008 本发明的第二个目的在于提供天麻素在制备降血压的药物中的应用。 0009 有益效果： 本发明提供了天麻素在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应 用， 证实了天麻素对同型半胱氨酸损伤的人。
10、脐静脉血管内皮细胞有效作用浓度50-800 g/ mL， 效果好， 用量少， 副作用小。 0010 本发明的第三个目的在于确证天麻素保护人脐静脉血管内皮细胞的作用机制。 本 发明确证了天麻素保护人脐静脉血管内皮细胞作用通路是通过eNOS/Cav-1信号通路。 附图说明 0011 图1为Hcy对HUVEC损伤的时间和剂量关系图； 0012 图2为天麻素浓度和细胞相对活力关系图； 0013 图3为天麻素浓度和活性氧关系图； 0014 图4为天麻素浓度和p-eNOS/eNOS关系图； 0015 图5为天麻素浓度和Cav-1关系图。 具体实施方式 0016 实施例1细胞损伤模型的建立 0017 分组：。
11、 实验分为空白组、 对照组、 不同浓度Hcy组； 每组设置5个复孔。 0018 细胞模型建立： 0019 (1)收集对数期HUVEC细胞， 待细胞长满90后， 吸出原来培养基， 实验组加入不同 浓度Hcy溶液150 L， 对照组和空白组加入培养基150 L， 每孔终体积150 L。 0020 (2)放置在5CO2， 37细胞培养箱中孵育6、 12、 18、 24、 30h， 倒置显微镜下观察； 每孔加入20 L MTT溶液， 在37恒温培养箱中继续培养4h。 0021 (3)将上清液吸净， 每孔加入150 L DMSO， 摇床避光震荡10min使蓝色结晶物充分 溶解。 0022 (4)用酶标仪。
12、在490nm波长处测量各孔的吸光度。 0023 设对照组的细胞相对活力为1， 其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值， 图1中纵坐标为细胞相对活力， 横坐标为6、 12、 18、 24、 30h下空白组、 4、 2、 1、 0.5mmol/L浓度 说 明 书 2/3 页 4 CN 107929294 A 4 Hcy损伤的细胞相对活力。 根据图1确定Hcy最终损伤浓度为1mmol/L， 时间为24h。 0024 实施例2天麻素对细胞活性的影响 0025 药物作用浓度建立： 0026 (1)收集对数期HUVEC细胞， 待细胞长满85后， 吸出原来培养基， 实验组加入 2mmol/L Hcy溶液。
13、100 L和不同药物浓度溶液各100 L， 造模组加入0.5mmol/L Hcy 200 L， 对照组和空白组加入培养基150 L。 0027 (2)放置在5CO2， 37细胞培养箱中孵育24h， 倒置显微镜下观察； 每孔加入20 L MTT溶液， 在37恒温培养箱中继续培养4h。 0028 (3)将上清液吸净， 每孔加入150 L DMSO， 摇床避光震荡10min使蓝色结晶物充分 溶解。 0029 (4)用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光度。 0030 设对照组的细胞相对活力为1， 其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值， 图2中为对照组、 模型组以及不同浓度天麻素下细胞相对活力。
14、。 根据图2确定天麻素最终有 效浓度为50-800 gl/mL。 0031 实施例3天麻素对ROS的影响 0032 (1)将细胞铺于6孔板， 待细胞长到70左右后， 吸出原来培养基， 实验组加入 2mmol/L Hcy溶液1mL和不同药物浓度溶液各1mL， 造模组加入1mmol/L Hcy 2mL， 对照组加 入培养基2mL， 每孔终体积2mL。 0033 (2)放置在5CO2， 37细胞培养箱中孵育24h， 倒置显微镜下观察， 吸出原来培养 基， 预冷的PBS洗3遍， 加入含1 mol/L DCFH-DA预冷的PBS， 37孵育细胞30min。 0034 (3)吸出原来PBS， 用预冷的PB。
15、S洗3遍， 加入500 L多聚甲醛， 放置37恒温箱中固 定15min。 0035 (4)倒去多聚甲醛， 用预冷的PBS洗3遍， 最后加入2mL预冷的PBS。 在荧光显微镜下 观察细胞。 0036 图3分别为对照组、 模型组、 800 g/mL、 400 g/mL、 200 g/mL浓度天麻素下ROS的荧 光。 根据图3表明Hcy能够增加ROS， 天麻素可以降低ROS， 其中ROS与天麻素浓度呈负相关性。 0037 实施例4天麻素对eNOS/Cav-1蛋白的影响 0038 (1)将细胞培养于60mm细胞培养皿， 待细胞长到80左右后， 吸出原来培养基， 实 验组加入2mmol/L Hcy溶液1。
16、mL和不同药物浓度溶液各2mL， 造模组加入1mmol/L Hcy 4mL， 对照组加入培养基4mL， 每皿终体积4mL。 0039 (2)放置在5CO2， 37细胞培养箱中孵育6h， 倒置显微镜下观察， 吸出原来培养 基， 预冷的PBS洗3遍， 用试剂盒提取细胞总蛋白。 0040 (3)Western Blot检测蛋白表达。 0041 根据图4和图5确定Hcy能够降低p-eNOS/eNOS的表达同时增加Cav-1的表达， 药物 能够增加p-eNOS/eNOS和降低Cav-1的表达， 并且p-eNOS/eNOS和Cav-1表达量与天麻素浓度 呈剂量依赖性。 说 明 书 3/3 页 5 CN 107929294 A 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 6 CN 107929294 A 6 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 7 CN 107929294 A 7 图4 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 8 CN 107929294 A 8 。