总番荔素在制备抗肿瘤药物中的用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102552349 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102552349 A *CN102552349A* (21)申请号 201210044581.X (22)申请日 2012.02.23 A61K 36/185(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 131/00(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路 151 号 (72)发明人 黄文华 高南南 李雯敏 朱春燕 余竞光 郭宝林 (74)专利代理机构 北京市德权律师事务所 11302 代理人 余光军 (。

2、54) 发明名称 总番荔素在制备抗肿瘤药物中的用途 (57) 摘要 本发明公开了总番荔素在制备抗肿瘤药物中 的用途。本发明通过体外或体内的抑制肿瘤活性 试验发现， 总番荔素对于乳腺癌、 鼻咽癌、 胃癌、 前 列腺癌或成骨肉瘤具有显著的抑癌活性。将总番 荔素中加入制备不同剂型时所需的各种辅料或药 学上可接受的载体后， 再按照常规的中药制剂方 法将其制备成任何一种临床上适宜的抗肿瘤制 剂， 包括注射制剂或口服制剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 。

3、1/1 页 2 1. 总番荔素在制备抗肿瘤药物中的用途。 2. 按照权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的肿瘤是乳腺癌、 鼻咽癌、 胃癌、 前列 腺癌或成骨肉瘤。 3. 一种抑制肿瘤的药物组合物， 其特征在于 ： 由治疗上有效量的总番荔素和药学上可 接受的载体组成。 4. 按照权利要求 3 所述的药物组合物， 其特征在于 ： 所述的肿瘤是乳腺癌、 鼻咽癌、 胃 癌、 前列腺癌或成骨肉瘤。 5. 按照权利要求 3 所述的药物组合物， 其特征在于 ： 以常规的中药制剂方法将所述的 药物组合物制备成任何一种临床上适宜的制剂。 6. 按照权利要求 5 所述的药物组合物， 其特征在于 ： 所。

4、述的制剂包括注射剂或口服制 剂。 权 利 要 求 书 CN 102552349 A 2 1/9 页 3 总番荔素在制备抗肿瘤药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及总番荔素在制备抗肿瘤药物中的用途， 尤其涉及总番荔素在制备抗乳 腺癌、 鼻咽癌、 胃癌、 前列腺癌或成骨肉瘤药物中的用途， 属于总番荔素的抗肿瘤药理用途 领域。 背景技术 0002 总番荔素 (Total Annonaceous Acetogenins， TAAs) 是从番荔枝科植物番荔枝种 子中所提取的有效部位， 其主要含有 squamocin、 bullatacin、 annonacin、 cherinolin-1、 che。

5、rinolin-2、 squamostatin-B 等多种番荔素内酯类化合物。 0003 公开号为 CN1224016A， 发明名称为 “抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法” 的 中国发明专利申请公开了总番荔素对于肝癌、 肺癌、 卵巢癌、 子宫颈癌、 黑色素瘤、 口腔上皮 癌、 结肠癌、 肉瘤、 艾氏癌等肿瘤细胞株的体外或体内的抑制活性试验 ； 其体外抗肿瘤作用 实验结果发现， 总番荔素对于肝癌、 结肠癌和卵巢癌具有一定的抑癌活性 ； 体内对动物移植 性肿瘤生长的作用试验表明， 总番荔素对于肝癌、 黑色素瘤和子宫颈癌具有一定的抑癌活 性。 0004 迄今为止， 尚未有文献报道总番荔素对于乳腺。

6、癌、 鼻咽癌、 胃癌或前列腺癌是否具 有确切的抑癌活性。 发明内容 0005 本发明通过大量的体外或体内的抑制肿瘤活性试验， 最终发现， 总番荔素对于乳 腺癌、 鼻咽癌、 胃癌、 前列腺癌或成骨肉瘤具有显著的抑癌活性。 0006 本发明应用 SRB 法研究了总番荔素对人乳腺癌耐药株 MCF-7/Adr、 人鼻咽癌 CNE-2Z、 人乳腺癌 MCF-7、 人胃癌细胞 BGC、 人前列腺癌 PC-3M 的杀伤作用。实验结果发 现， 总番荔素对这 5 种人癌细胞株均有一定的抑制肿瘤细胞生长的作用， 其中对乳腺癌耐 药株 MCF-7/Adr 抑瘤效应尤为明显， IC50为 0.167g/mL ； 其次。

7、为鼻咽癌 CNE-2Z， IC50为 6.484g/mL， 抑瘤效应也十分显著。另外， 总番荔素对乳腺癌 MCF-7、 胃癌 BGC 以及前列腺 癌PC-3M的IC50分别为25.62g/mL、 26.321g/mL和44.613g/mL， 表现出了一定的抑瘤 效果。此外， 本发明实验结果发现， 总番荔素对卵巢癌 SKOV3 细胞株抑瘤效应较差， IC50为 56.972g/mL。 0007 总番荔素对小鼠移植性乳腺癌 EMT6 生长抑制作用观察实验结果表明， 总番荔素 的低、 中、 高剂量对乳腺癌 EMT6 细胞生长均有显著的抑制作用。 0008 将有效量的总番荔素与药学上可接受的载体或辅料。

8、组合在一起后可得到抗肿瘤 的药物组合物。 将总番荔素中加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形 剂或载体后， 以常规的中药制剂方法将其制备成任何一种临床可接受的适宜制剂， 例如， 可 以是注射制剂 ( 粉针、 冻干粉针、 水针、 输液等 )、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 胶囊剂、 软胶囊或滴 丸等 ； 其中， 所述的辅料可以是抗氧络合剂、 填充剂、 骨架材料等 ； 所述的药学上可接受的 说 明 书 CN 102552349 A 3 2/9 页 4 载体是木糖醇、 甘露醇、 乳糖、 果糖、 葡聚糖、 葡萄糖、 聚乙烯吡咯烷酮、 低分子右旋糖酐、 氯 化钠、 葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种。

9、或几种。 0009 本发明中所述的 “总番荔素” 可按照公开号为 CN 1224016A， 发明名称为 “抗肿瘤 药和杀虫剂总番荔素及其制造方法” 的中国发明专利申请所公开的方法提取并富集得到总 番荔素， 其具体的提取和富集方法可参考如下 ： 0010 总番荔素的提取 ： 将番荔枝种子破碎为粗粉， 室温下以己烷或石油醚浸泡脱脂， 溶 剂挥发后用 95醇溶液 ( 甲醇、 丙醇、 异丙醇或丙酮 ) 渗漉， 减压回收溶剂得醇提取物 ； 将 醇提取物在水中以氯仿(或二氯甲烷、 二氯乙烷、 乙醚或乙酸乙酯)等有机溶剂进行分配处 理， 萃取得到的有机溶剂中含有总番荔素。 0011 总番荔素的富集 ： 用 。

10、90的乙醇 ( 或者是甲醇、 丙醇、 异丙醇、 己烷或石油醚 ) 分 配处理含有总番荔素的有机萃取物， 将 90的乙醇提取物以硅胶吸附层析， 用氯仿 ( 二氯 甲烷、 二氯乙烷、 乙醚或乙酸乙酯 )/ 甲醇洗脱， 收集最先洗出部分， 可使总番荔素的含量富 集至 90。 附图说明 0012 图 1 总番荔素对小鼠移植性乳腺癌 EMT6 生长抑制作用的实验结果。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发。

11、明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0014 实验例 1、 总番荔素体外抗肿瘤实验 0015 1、 实验材料 0016 1.1 人癌细胞株 ： MCF-7( 人乳腺癌细胞株 )、 BGC( 人胃癌细胞株 )、 PC-3M( 人前列 腺癌高转移细胞株 )、 CNE-2Z( 人鼻咽癌细胞株 )、 SKOV3( 人卵巢癌细胞株 ) 购自中国医学 科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。 MCF-7/Adr(人乳腺癌耐药株)购自中国医学科 学院肿瘤医院。 0017 1.2 总 番 荔 素 的 配 制 ： 精 确 称 取 总 番 荔 素 装 于 4mL 离。

12、 心 管 中， 加 一 定 量 Cremophor(2 )。1000rpm 离心 3 4min 后将离心管放入 40-45水浴中溶解 20-40min， 待整个溶液呈淡黄色均匀液体后在超净工作台中加入无菌水， 配置成浓度为 1mg/mL 溶液。 加入无菌水后放置15-20分钟， 或在超声仪中超声20-30分钟， 待完全溶解呈现澄清状态后 进行细胞试验， 现配现用。 0018 1.3 阳性药 顺铂， 1mg/mL， 50mL 装， 澳大利亚 Hospira Australia Pty Ltd 公司 生产， 批号 ： W071881AB。 0019 1.4试剂磺基罗丹明B ： Sigma公司， 批。

13、号 ： MW09213。 Cremopher ： Sigma公司， 批号 ： CH09103。DMEM 培养基 ： Gibco 公司， 批号 ： NVC0247。RPMI 1640 培养基 ： Gibco 公司， 批号 ： NVD0249。胎牛血清 ： 杭州四季青生物工程材料有限公司， 批号 ： 090702。乙酸 ： 北京化工厂 分析纯， 批号 ： 20080415。三羟甲基甲烷 ： 北京康特理化高技术公司， 批号 ： AT007-91。三氯 说 明 书 CN 102552349 A 4 3/9 页 5 乙酸 ： 天津市科密欧化学试剂开发中心， 批号 ： 20040524。 0020 1.5。

14、 仪器 XSZ-D2型倒置显微镜 ： 重庆光学仪器厂。SKF-01 型恒温箱 ： 湖北省黄 石市依赖器械厂。3111 型二氧化碳培养箱 ： 美国 ThermoForma 公司。PFG-I 型超净工作 台 ： 北京昌平长城空气净化工程公司。移液器 (100-1000L， 20-200L， 2-20L) ： 德国 Eppendorf。3599 型 96 孔细胞培养板 ： 美国 Costar。BIO-RAD550 型酶标仪 ： 美国 BIO-RAD 伯乐公司。AL204 型精密电子天平 ： 上海托利多仪器有限公司。MDF-U333 型超低温冰箱 (-70 ) ： 日本 SANYO 公司。LD4-2 。

15、型离心机 ： 北京医用离心机厂。 0021 2、 实验方法 (SRB 法检测 ) 0022 取对数生长的细胞用胰蛋白酶消化， 按细胞特性配成一定浓度的细胞悬液， 再将 其接种至 96 孔培养板中， 每孔 200L， 于 37， 5 CO2的培养箱内培养 24h ； 待细胞完全 贴壁达到生长对数期后进行给药。实验组每孔加入含不同浓度 (1g/mL、 5g/mL、 15g/ mL、 30g/mL、 50g/mL)番荔素溶液配制的培养液200L ； 每一个浓度设4个平行孔， 培养 48h 后各孔分别加入 50 ( 质量 / 体积 ) 的三氯乙酸 (TCA)50L 固定细胞。培养板各孔 用去离子水洗涤。

16、多次后， 在空气中干燥后， 每孔加 0.4的 SRB100L， 室温放置 20min 后， 用 1乙酸洗涤， 空气中干燥后用 pH 为 10.5， 10mmolL-1三羟甲基胺基甲烷溶解， 在平板 振荡器上振荡 20min， 在酶标仪以 490nm 波长测定 OD 值。按照公式 ： 肿瘤细胞生长抑制率 ()1-(实验组光密度值/对照组光密度值)100， 计算药物对肿瘤细胞生长的抑制 率， 采用改良寇氏法计算 IC50值。 0023 3 实验结果 0024 本实验应用 SRB 法研究了总番荔素对人乳腺癌耐药株 MCF-7/Adr、 人鼻咽癌 CNE-2Z、 人乳腺癌 MCF-7、 人胃癌细胞 B。

17、GC、 人前列腺癌 PC-3M 的杀伤作用， 结果发现总番 荔素对这 5 种人癌细胞株均有一定的抑制肿瘤细胞生长的作用 ( 表 1)。其中对乳腺癌耐 药株 MCF-7/Adr 抑瘤效应尤为明显， IC50为 0.167g/mL， 其次为鼻咽癌 CNE-2Z， IC50为 6.484g/mL， 其抑瘤效应也十分显著。另外， 总番荔素对乳腺癌 MCF-7、 胃癌 BGC 以及前列 腺癌PC-3M的IC50分别为25.62g/mL、 26.321g/mL和44.613g/mL， 也表现出了较好的 抑瘤效果 ( 表 2-5)。对卵巢癌 SKOV3 细胞株抑瘤效应较差， IC50为 56.972g/mL。

18、( 表 6)。 0025 表 1 总番荔素对体外人癌细胞杀伤作用结果 (SRB 法 ) 0026 0027 表 2 总番荔素对人鼻咽癌 CNE-2Z 的生长抑制作用 说 明 书 CN 102552349 A 5 4/9 页 6 0028 0029 0030 IC50 6.484g/mL 0031 表 3 总番荔素对人乳腺癌 MCF-7 生长抑制作用 0032 说 明 书 CN 102552349 A 6 5/9 页 7 0033 0034 IC50 25.621g/mL 0035 表 4 总番荔素对人胃癌细胞 BGC 的生长抑制作用 0036 说 明 书 CN 102552349 A 7 6/。

19、9 页 8 0037 IC50 26.321g/mL 0038 表 5 总番荔素对前列腺癌 PC-3M 的生长抑制作用 0039 0040 说 明 书 CN 102552349 A 8 7/9 页 9 0041 IC50 44.613g/mL 0042 表 6 总番荔素对人卵巢癌 SKOV3 的生长抑制作用 0043 0044 IC50 56.972g/mL 0045 实验例 2 总番荔素对小鼠移植性乳腺癌 EMT6 生长抑制作用观察实验 0046 1、 实验材料 0047 1.1 瘤株 ： 小鼠乳腺癌细胞株 EMT6， 购自中国医学科学院肿瘤医院。 0048 1.2 实验动物 ： BALB/。

20、C 小鼠， 雌性， 体重 16 18g， 年龄 6 8 周。购自北京华阜 康生物科技股份有限公司， 合格证号 ： SCXK( 京 )2009-0007。 0049 1.3 药物 ： 总番荔素为白色固体粉末 ( 批号 ： 20100723)， 临用时采用低比稀释 法， 用蒸馏水配制。氟尿嘧啶注射液 ( 阳性药 )， 上海旭东海普药业有限公司， 产品批号 ： 090904。 说 明 书 CN 102552349 A 9 8/9 页 10 0050 2、 实验方法 0051 取接种 10 天后的小鼠 EMT6 肿瘤， 摘取肿块密度集中的部分， 去掉结缔组织后称 重， 然后将其放入研磨器中， 按照肿块。

21、重量与生理盐水溶液 1 7 比例研磨成细胞悬液， 以 0.2mL/ 只的量接种于小鼠右前肢腋部皮下， 24 小时后将已接种的小鼠随机分为 6 组， 分别 为空白组、 辅料组、 氟尿嘧啶 (25mg/kg)、 总番荔素 1mg/kg、 2mg/kg、 4mg/kg 三个剂量组， 氟 尿嘧啶腹腔注射给药， 其余为灌胃给药， 连续给药10天， 末次给药后24小时处死小鼠， 精确 剪取肿瘤组织， 剔除结缔组织和脂肪组织， 并摘取胸腺和脾脏分别称重。按公式计算抑瘤 率 ： 抑瘤率 ( ) (1- 给药组平均瘤重 / 空白对照组平均瘤重 )100。观察总番荔素 对小鼠 EMT6 乳腺癌的抑制作用。 005。

22、2 3、 实验结果 0053 实验结果表明， 总番荔素 1mg/kg、 2mg/kg、 4mg/kg 连续灌胃给药 10 天， 高剂量组 (4mg/kg) 的抑瘤率为 21.03。中剂量组 (2mg/kg) 的抑瘤率分别为 40.52。低剂量组 (1mg/kg) 的抑瘤率为 36.50， 说明对 EMT6 细胞生长有明显抑制作用 ( 表 7， 图 1)。 0054 阳性药氟尿嘧啶表现出较强的抑瘤作用。 但是氟尿嘧啶在抑制肿瘤生长的同时明 显降低动物体重， 同时可明显降低小鼠胸腺和脾脏重量， 说明对免疫系统有较强的毒性作 用。 0055 表 7 总番荔素对小鼠移植性乳腺癌 (EMT6) 抑瘤作用。

23、 0056 0057 与空白组比较， *P 0.05， *P 0.01， *P 0.001 0058 实验例 3 总番荔素体内对人癌细胞裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用实验 0059 以 BAL/C 裸鼠接种人成骨肉瘤 OS-732 细胞， 连续口服番荔素给药 14 天。实验结 果见表 8， 表明总番荔素对人成骨肉瘤 OS-732 细胞有较强的抑瘤活性。 0060 表 8 总番荔素口服给药对裸鼠异种移植的人成骨肉瘤 OS-732 细胞的抑制作用 说 明 书 CN 102552349 A 10 9/9 页 11 0061 说 明 书 CN 102552349 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102552349 A 12 。