技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及DUSP12在治疗脂肪肝中的功能及应用，以及以DUSP12作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
背景技术
随着现代人生活方式以及环境的改变，肥胖、脂质异常及糖尿病等代谢性疾病已经成为全球性的重大疾病，严重威胁公众的健康及生活质量。非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)为一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪堆积及变性为病理特征的代谢性疾病，其发病因素包括肥胖、2型糖尿病、血脂异常及代谢综合征等[1-3]。NAFLD是最为常见的慢性肝脏疾病，根据全球大范围统计，NAFLD的发病率大约为25％，其中10-20％的患者最终发展为非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)，而约三分之一的NASH患者逐步演化为肝硬化，甚至肝癌[4][5]。此外，伴随着NAFLD及NASH的出现同时，机体也会产生一系列的代谢紊乱综合征，如血脂代谢异常，糖尿病等等。然而，目前尚无有效的药物及治疗手段攻克这一临床难题，鉴于此，寻找制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物的新靶点，就显得尤为重要。
葡萄糖激酶相关双特异性磷酸酶12(DUSP12)是近年来发现的一种表达于肝脏，能够与葡萄糖激酶特异性结合并且催化其磷酸化的磷酸酶。葡萄糖激酶在纷繁复杂的肝脏代谢通路网络中扮演着重要角色。它是肝脏糖酵解的限速酶，无论是有氧氧化还是无氧酵解，都首先需通过葡萄糖激酶催化葡萄糖成为具有活性的6-磷酸葡萄糖，继而进入代谢通路产生ATP，确保其它代谢的能量需求。编码DUSP12的基因位于染色体1q21-23区域内，有研究表明该区域有与Ⅱ型糖尿病密切相关的遗传关联位点[6]。双特异性蛋白磷酸酶(DUSPs)是蛋白磷酸酶家族中的一类，它对磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸的去磷酸化作用在免疫激活、大脑功能和细胞生长信号中发挥重要作用[7]。DUSPs使酪氨酸和苏氨酸残基去磷酸化，从而对MAPK激活的强度和持续时间进行负调控。DUSP12是DUSPs家族中一种非典型的、缺乏MAPK结合域的成员。有文献报道DUSP12能与MAPKs通路的细胞外信号调节激酶、JNK和p38相互作用[8]。DUSP12是一种致癌基因，过表达此基因能增强细胞运动性及对凋亡的抵抗力[7]。DUSP12的锌结合c端侧翼区参与细胞周期调节和氧化还原调节活动[9]。DUSP12可以使葡萄糖激酶去磷酸化，调节细胞周期，并参与到压力诱导的细胞死亡和癌症中[10-12]。但DUSP12在脂肪肝中的作用目前暂未报道。
参考文献
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[6].Das SK,Chu WS,Hale TC,et al.Polymorphisms in the glucokinase-associated,dual-specificity phosphatase 12(DUSP12)geneunder chromosome 1q21 linkage peak are associated with type 2diabetes.Diabetes.2006；55(9):2631-9.
[7].Jeong DG,Wei CH,Ku B,et al.The family-wide structure and function of human dual-specificity protein phosphatases.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2014；70(Pt 2):421-35.
[8].Cho SSL,Han J,James SJ,et al.Dual-Specificity Phosphatase 12 Targets p38 MAP Kinase to Regulate Macrophage Response to Intracellular Bacterial Infection.Front Immunol.2017；8:1259.
[9].Kozarova A,Hudson JW,Vacratsis PO.The dual-specificity phosphatase hYVH1(DUSP12)is a novel modulator of cellular DNA content.Cell Cycle.2011；10(10):1669-78.
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发明内容
解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种DUSP12基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因DUSP12的新用途，进而把DUSP12基因应用于脂肪肝的治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种DUSP12基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因DUSP12的新用途，进而把DUSP12基因应用于脂肪肝的治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明第一方面，提供双特异性磷酸酶12在制备保护肝脏的药物中的应用。
优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。
本发明第二方面，提供双特异性磷酸酶12在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
本发明涉及的双特异性磷酸酶12在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是双特异性磷酸酶12。
本发明涉及的双特异性磷酸酶12在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是双特异性磷酸酶12作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高双特异性磷酸酶12表达量的试剂。
优选地，提高双特异性磷酸酶12表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。
所述的双特异性磷酸酶12或DUSP12，包括基因或蛋白。所述的DUSP12基因在对象体内经转录翻译为双特异性磷酸酶12蛋白产物。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明通过试验确定了双特异性磷酸酶12的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：
本发明以人正常肝脏L02细胞系及DUSP12过表达L02细胞系为研究对象，通过棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型研究DUSP12基因的功能，发现DUSP12过表达能够显著改善肝脏细胞内脂质堆积，说明DUSP12能够保护肝脏细胞免受脂肪样变性。由此说明DUSP12在肝脏脂质代谢性疾病中起着保护作用，过表达DUSP12基因治疗肝脏脂质代谢性疾病具有潜在的治疗及应用价值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现DUSP12基因的新功能，即DUSP12基因具有能够保护脂肪肝疾病的作用。
(2)基于DUSP12在保护脂肪肝疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物。由于DUSP12是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。
附图说明
图1为两种L02细胞株中DUSP12蛋白表达量的Western Blot检测结果。
图2为L02细胞经PA(0.4mM)和OA(0.8mM)刺激后油红O染色结果(×400)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明中的试验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
实验用细胞及培养
人肝细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)于5％CO2的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。
DUSP12过表达质粒构建
1)PCR扩增DUSP12基因，引物为：
正向：5’-TCGGGTTTAAACGGATCCATGTTGGAGGCTCCGGGCCCGAG-3’
反向：5’-GGGCCCTCTAGACTCGAGTCATATTTTTCCTGTTTGTGATCCC-3’；
2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根)进行DNA片段的回收；
3)将所得DNA产物和限制性内切核酸酶、buffer orGreen buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用AxyPrepTMPCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；
4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；
5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于37℃培养箱，过夜培养；
6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；
7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；
8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA小提试剂盒)；
9)提取后的质粒可直接用于构建慢病毒包装。
慢病毒载体构建和包装
1)在200μLReduced Serum Medium中加入转染试剂(PEI Max，或Lipofectamine 2000)，轻轻混匀，简短离心；(DNAμg：转染试剂μl＝1:0.5～1:5)
2)在200μlReduced Serum Medium中加入目的基因质粒1μg、包装质粒(慢病毒常用pMD2.G(Addgene，12259)0.5μg和psPAX2(Addgene，12260)0.75μg)，轻轻混匀，简短离心；
3)将1)和2)体系轻轻混匀，简短离心，室温孵育20min；
4)将混合体系滴加到6孔板中，轻轻混匀。
5)转染6h后，换新鲜培养基；
6)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；
7)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。
Western blot分析
1)制胶
根据目的蛋白大小选择需要的分离胶浓度，一般8％-10％的分离胶可满足大部分实验需求。
2)蛋白提取
细胞用适量RIPA(50mM Tris-HCl PH7.4,150mM NaCl,1％Triton X-100or NP-40,1％Sodium deoxycholate,0.1％SDS,1mM EDTA，使用前加蛋白酶或磷酸酶抑制剂)冰上裂解10-30min，超声会提高蛋白提取效率；4℃，12000×g离心10min，上清即为总蛋白；采用BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量，取30-50μg总蛋白进行Western blot分析。
3)上样及电泳
保证上样量及上样体积一致，恒压电泳，上层胶采用80-90V，下层胶采用100V。
4)转膜
配制转膜液，提前预冷；PVDF膜使用前用甲醇浸泡1-2min；转膜，胶在负极侧，膜在正极侧，海绵、滤纸提前浸泡。(注意事项：胶要平铺均匀，不可拉伸；转膜过程中保证胶泡在缓冲液中；胶与膜之间不能有气泡。)
5)封闭
5％脱脂奶粉(in TBST)于震荡摇床室温封闭1h。
6)一抗孵育
4℃孵育过夜。
7)二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司，BF03008/BF03008X)孵育
一抗孵育后膜用TBST洗3遍，每次5min，加一定比例二抗(in TBST)室温孵育1h。(根据抗体的特异性选择是否用5％脱脂奶粉(in TBST)稀释二抗)
8)显影
9)利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。
油红O染色
1)细胞固定：细胞用PBS洗涤2-3次，去除死细胞，加入300μl 4％多聚甲醛固定20min；
2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s，弃去异丙醇，晾干；
3)每孔加入500μl油红O染色1min；
4)加入PBS洗涤2-3次，去除背景的红色，在显微镜下观察，拍照。
【实施例1】DUSP12过表达对肝细胞脂肪堆积的影响
构建过表达DUSP12的慢病毒表达载体，转染HEK-293T细胞，包装慢病毒，感染L02细胞构建过表达DUSP12的稳定细胞株(pHAGE-DUSP12)，同时过表达空载体作为对照组(pHAGE组)，通过Western blot检测稳定细胞株是否高表达DUSP12；表达成功的L02细胞种板，分为4组，即pHAGE对照组，pHAGE-DUSP12对照组，pHAGE实验组，pHAGE-DUSP12实验组。待细胞贴壁后，实验组加入棕榈酸酯(PA，终浓度0.4mM)和油酸(OA，0.8mM)刺激，同时对照组加入同等量的BSA，16h后进行油红O染色。
Western blot检测结果如图1所示，感染过表达DUSP12慢病毒的L02细胞株DUSP12的蛋白表达量显著高于空载对照组。油红O染色结果如图2所示，BSA处理细胞时，对照组和DUSP12过表达组细胞均无明显着色，而当加入PA刺激后，与对照组相比，DUSP12过表达组细胞被油红O染色的细胞数目及着色程度显著减弱。
上述结果表明DUSP12过表达能够抑制PA及OA刺激导致肝细胞脂质沉积，DUSP12在肝脏脂肪变性的病理过程中起着保护作用，以DUSP12作为靶点可能为脂肪性肝损伤这类疾病提供新的治疗思路。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 双特异性磷酸酶12在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgggtttaa acggatccat gttggaggct ccgggcccga g 41
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggccctcta gactcgagtc atatttttcc tgtttgtgat ccc 43