技术领域
本发明涉及对抑制轮状病毒感染有效的萃取物及发酵物的制备方法。该萃 取物是通过对麦芽或蘑菇进行热萃取而制得，该发酵物是通过乳酸菌发酵这 些萃取物而制得。具体地说，向麦芽或蘑菇中加入约10倍量的水，加热进行 热萃取，向该麦芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，于35℃～38℃发酵24小时， 得到乳酸菌麦芽发酵物或蘑菇发酵物。这些发酵物对抑制轮状病毒感染有效。
背景技术
所谓麦芽，是指麦子的种子出芽干燥后的产物，其可被称为“麦芽”或“麦 豆芽”。麦芽被用于制作韩国的辣椒酱或调味酱，大麦的麦芽也被用作啤酒的 原料。大家知道，生产麦芽时，芽的长度为自身的1.5倍左右时最为合适。 麦芽以富含消化酶闻名，过去在中医中，遇到消化不良症时作为消化开胃剂 使用。
香菇的学名被称为Lentinus edodes。香菇中所含的香菇嘌呤 (eritadenine)具有降低小鼠血液中的胆固醇和中性脂肪酸的作用。并且， 有报道说，香菇萃取物有增殖乳酸菌的作用(例如，参照下列非专利文献1)。
轮状病毒(Rotavirus)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，作为在发展中 国家或不发达国家里诱发急性小儿肠炎原因中最重要的因素而为人所知。轮 状病毒由抗原不同的6型(A-F)组成。A、B、C型的轮状病毒被发现存在于 人类和动物，D、E、F型只在动物中被发现。按血清不同区分的病毒型，相互 之间共通，或是具有交叉抗原。自从最早报道轮状病毒的存在以来，关于其 中A型的研究最为活跃，对其性质的调查也取得较大进展，几乎分布在所有 从人分离而来的菌株中。轮状病毒是引起小儿及牛、马、猪、猴等年幼动物 的急性腹泻及肠炎的主要原因。结合幼儿和儿童中零散发生的腹泻疾患，根 据世界保健机构的统计资料表明，地球上5岁以下的儿童中因腹泻死亡的儿 童人数每年达到500万名，其中有20％，即100多万名死于由轮状病毒引起的 腹泻。在美国，幼儿腹泻中的35％-50％起因于轮状病毒。而且，在发展中国家， 这个问题则更加严重，6-11个月的幼儿大约发生10次由轮状病毒引起的腹泻。 并且，90％的幼儿在24个月之前就具有轮状病毒抗体。以韩国汉城地区的小 儿腹泻人群为对象历时12个月对12种以上的诱发腹泻原因体进行调查的研 究报告显示，从腹泻人群的47％中检测出轮状病毒，出现频率最高。该值大大 超出世界保健机构的统计值20％，达到2倍以上。
轮状病毒由粪便经口感染，是引起不满2岁的幼儿发生急性传染性腹泻的 原因，此种感染状态通常称为幼儿胃肠炎或急性胃肠炎。由轮状病毒引起的 急性胃肠炎伴随有发热、呕吐、腹泻、呼吸器官异常等临床症状，在以韩国 为首的温带地区，在晚秋至初冬几乎都有发生，占此期间小儿腹泻患者的 70％-80％。从发现症状起在约第8天时病毒作为粪便大量排泄，每1g粪便中 发现1011个病毒。而且，6个月至2岁的幼儿感染此病毒最为频繁，感染时引 起脱水和代谢酸中毒。腹泻通常是在经感染轮状病毒后引起肠管粘膜细胞的 吸收功能障碍时出现。病毒感染小肠的绒毛细胞，在这些细胞的细胞质中增 殖，引起运送系统的障碍。由于受损细胞从肠管脱落，释放出大量的病毒， 因此粪便中便可发现病毒。由轮状病毒引起的腹泻，是由于受损细胞被没有 吸收功能的未成熟腺窝细胞取代而产生的钠和葡萄糖的吸收功能损伤造成 的。
因此，尽管开发并使用了相应于轮状病毒的疫苗，但由于副作用中断其使 用后，迄今为止仍没有令人满意的可替代药品。因此，人们盼望尽早开发出 能够抑制轮状病毒感染的物质。
乳酸菌大致可分为乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属。若按年龄不同调查 肠内乳酸菌的变化会发现，出生后第3～4日出现双歧杆菌，第5日成为最有 优势的细菌。而且，断奶期结束后，厌氧菌和双歧杆菌成为优势，作为其他 乳酸菌的乳杆菌等则非常少。另外，随着年龄的增长，肠内细菌平衡紊乱， 曾经处于优势的双歧杆菌势力减弱，乳杆菌的势力则超过双歧杆菌。因此， 随着老龄化的发展，越来越有必要通过服用双歧杆菌以使肠内菌群与幼儿或 青壮年时期保持相同水平。作为韩国乳酸菌的短双歧杆菌K-110的最主要特 征是可对大肠癌、膀胱癌、腹水癌的进行有效治疗(例如，参照下述专利文 献1及非专利文献2)，能够对导致胃溃疡的幽门螺旋杆菌的成长进行抑制， 从而具有治疗胃部疾病的效果(例如，参照下述非专利文献3)。通常，作为 乳酸菌的生理活性作用，可以例举为抑制有害菌的增殖、缓和乳糖不耐性、 降低血清胆固醇、抗癌、免疫、改善腹泻及便秘、合成维生素等。双歧杆菌 在出生后第3～4日开始出现，第5日左右便成长为最具优势的细菌，原有的 大肠杆菌(E.coli)或作为其他乳酸菌的乳杆菌、链球菌等的数量减至百分之 一。这是因为只有母乳中存在促进双歧杆菌增殖的因子，从而可知，与作为 其他乳酸菌的乳杆菌相比，双歧杆菌是肠内菌群中最重要的细菌。
在以往的技术中就致力于使用乳酸菌制备酸奶等乳酸发酵制品，开发了很 多技术，不过这些技术几乎都是向奶中接种乳酸菌，再加入脱脂奶粉制作增 殖了乳酸菌的乳酸菌饮料的普遍方法。使用奶以外的谷类的乳酸菌饮料或是 生产乳酸的技术还可以举例如下：利用胚芽乳酸杆菌从植物和中药中得来的 乳酸发酵饮料(例如，参照下述专利文献2)、米胚芽饮料(例如，参照下述 专利文献3)、使用谷粒状的米制备乳酸发酵品的方法(例如，参照下述专利 文献4)、使用谷粉制备液体乳酸发酵品的方法(例如，参照下述专利文献5)、 用来自豆的成分生产乳酸的方法(例如，参照下述专利文献6)、用嗜酸乳杆 菌菌株生产乳酸菌原料粉末的方法(例如，参照下述专利文献7)、抑制胃肠 内的幽门螺旋杆菌增殖的乳酸菌(例如，参照下述专利文献8至10)，重金属 吸附能较高的乳酸菌菌株及使用该乳酸菌菌株的制品(例如，参照下述专利 文献11)、预防及改善代谢性骨疾患的使用了乳酸菌发酵的食品材料(例如， 参照下述专利文献12)。然而，关于对轮状病毒有效的乳酸菌研究却并未开展， 也没有相关专利。作为使用了蘑菇的乳酸菌发酵物的专利，可以例举含有蘑 菇粉末或蘑菇萃取物的乳酸菌培养液、使用此培养液的蘑菇乳酸发酵组合物 (例如，参照下述专利文献13)。此公报中，公开了使用包含脱脂奶粉、蘑菇 粉末(香菇粉末、紫芝粉末、食用伞菌粉末)、寡糖、糊精的乳酸菌培养液进 行发酵。不过，此技术与本发明中使用麦芽或香菇萃取物及其粉末自身时的 技术大不相同。
本发明的最大特点是，通过使用韩国乳酸菌短双歧杆菌K-110、市面上销 售的长双歧杆菌KCT3215、短双歧杆菌JCM1192、婴儿双歧杆菌JCM7007等乳 酸菌发酵麦芽和香菇，制备对导致腹泻的病毒—轮状病毒感染具有益效果的 发酵物。并且，这些发酵物也可以用于断奶食品或奶粉的原料、幼儿食品的 原料，还可以用作功能性食品的原料。
[专利文献1]大韩民国专利登录第0232639号公报
[专利文献2]大韩民国专利公开第2000-0055832号公报
[专利文献3]大韩民国专利申请第1996-042486号公报
[专利文献4]大韩民国专利公开92-16030号公报
[专利文献5]大韩民国专利公开97-14592号公报
[专利文献6]大韩民国专利申请10-1999-0017375号公报
[专利文献7]大韩民国专利登录148340号公报
[专利文献8]大韩民国专利公开2002-0072486号公报
[专利文献9]大韩民国专利公开2002-0061040号公报
[专利文献10]大韩民国专利公开2002-0045496号公报
[专利文献11]大韩民国专利公开2000-0065010号公报
[专利文献12]大韩民国专利公开2002-0048959号公报
[专利文献13]大韩民国专利公开2002-0085159号公报
[非专利文献1]韩国食品科学会志，28(5)，947，(1996)
[非专利文献2]J.Microbiol.Biotechnol.9(3)，368(1999)
[非专利文献3]J.Microbiol.Biotechnol.10(4)，532(2000)
发明内容
本发明的目的在于提供了通过向麦芽或蘑菇中加水进行热萃取来制备对 抑制轮状病毒感染有效的萃取物的方法。
本发明的其他目的在于提供了通过向麦芽或蘑菇的热水萃取物或是向麦 芽香菇本身移植乳酸菌进行发酵来制备对抑制轮状病毒感染有效的乳酸菌发 酵物的方法。
本发明的其他目的还在于提供了含有对抑制轮状病毒感染有效的麦芽和 香菇萃取物及其乳酸菌发酵物作为材料的断奶食品、奶粉、幼儿食品、斋饭、 生吃食品、功能性食品。
为达到上述目的，本发明具有的特征为，通过向麦芽或蘑菇中加10倍量 的水并加热进行热萃取，制备对抑制轮状病毒感染有效的萃取物。
另外，本发明的特征还在于，通过向麦芽或蘑菇萃取物或是向麦芽或香菇 本身移植乳酸菌并于35℃～38℃发酵24小时，制备对抑制轮状病毒感染有效 的乳酸菌发酵物。
另外，本发明提供了以上述对轮状病毒感染具有抑制效果的麦芽和香菇萃 取物及其乳酸菌发酵物作为原料的断奶食品、奶粉、幼儿食品、斋饭、生吃 食品、功能性食品。
本发明可以利用麦芽或香菇萃取物以及经乳酸菌发酵上述萃取物而得到 的乳酸菌发酵物来制备对轮状病毒有效的制品，其中所述轮状病毒是造成腹 泻原因的病毒。并且，这些发酵物也可以用作断奶食品或奶粉的原料、幼儿 食品的原料、斋饭和生吃食品的原料，还可以用作功能性食品的原料。
具体实施方式
关于本发明的具体实施例，举例如下。并且，对本发明的简单变形或改变 也包含于本发明的范围之内，故本发明的保护范围根据权利要求进行明确。
实施例1 麦芽或蘑菇萃取物的制备
向500g麦芽或香菇中加10倍的水，加热进行热萃取。此操作反复进行两 次。然后，浓缩上清液，以此作为抑制轮状病毒的试料使用。
实施例2 采用乳酸菌的麦芽发酵物及蘑菇发酵物的制备
向按照实施例1的方法制备的麦芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，每1ml的 萃取物中移植108个乳酸菌，于35℃～38℃发酵24小时就得到乳酸菌发酵液。 以此发酵液作为试料使用。
实施例3 MA-104细胞的培养
用添加了10％的FBS、1％的抗生素-抗真菌剂混合液及3.5g/L的碳酸氢钠 的DMEM培养基(DulbeccoTs modified eagleTs medium)培养MA-104细胞。 当细胞在烧瓶中增殖到80％左右时，用0.25％的胰蛋白酶处理，分离细胞后继 续培养。培养细胞时，使用充满5％CO2的CO2温箱。
实施例4 轮状病毒保存液的制备
向组织培养烧瓶(25cm2)中等分加入2×106个MA-104细胞，放置于37 ℃的CO2温箱1小时使之贴壁，然后去掉培养液，用不含FBS的洗净用DMEM 培养液洗涤细胞表面2次。然后，向400μl的Wa病毒(Wa virus)溶液中 添加含有100μg/ml胰蛋白酶的感染性DMEM培养基20μl，于37℃活化30 分钟后，将病毒溶液均匀地涂在细胞的表面，于37℃感染1小时后除去，添 加5ml不含FBS但含有5μg/ml胰蛋白酶的感染性DMEM培养基，于37℃的 CO2温箱中培养5天。培养后确认细胞变性效果(CPE)，反复3次冷冻及快速 解冻后细胞膜完全破裂，于4℃、5000rpm的条件下离心分离20分钟，取含 有病毒的上清液于-70℃冷冻保存后使用。
实施例5 乳酸菌及发酵物对轮状病毒感染的抑制效果的测定
以0.25％的胰蛋白酶处理后从烧瓶中分离MA-104细胞，以洗净用DMEM培 养基洗涤2次后，调节细胞数至3×105个，用感染性DMEM培养基将按实施例 4方法同样制备的Wa病毒贮存液稀释500倍。向96孔板中，涂布浓度调至 0.4mg/ml的麦芽或香菇萃取物(实施例1)、50μl的麦芽或香菇发酵物(实 施例2)、50μl Wa病毒稀释液及3×105cell/ml的MA-104细胞100μl，于 37℃的CO2温箱培养5天后，观察细胞变性效果(CPE)并测定对轮状病毒感 染的抑制活性。乳酸菌对轮状病毒感染的抑制效果的结果，如表1所示，与 市面上销售的长双歧杆菌KCT3215、短双歧杆菌JCM1192、婴儿双歧杆菌 JCM7007等乳酸菌相比，短双歧杆菌K-110显示出了最出色的效果。
[表1]
乳酸菌对轮状病毒感染的抑制效果 乳酸菌 人感染Wa轮状病毒 50％感染抑制浓度 (mg/ml) 动物感染SA11轮状病毒 50％感染抑制效果 长双歧杆菌KCT 3215 ＞0.1 ＞0.1 短双歧杆菌JCM 1192 ＞0.1 ＞0.1 婴儿双歧杆菌JCM 7007 ＞0.1 ＞0.1 短双歧杆菌K-110 0.074 0.072
向实施例1的麦芽或蘑菇萃取物的制备中得到的麦芽或香菇的萃取物及 实施例2的麦芽或蘑菇萃取物中移植乳酸菌，每1ml的萃取物中移植108个乳 酸菌，于35℃～38℃发酵24小时得到乳酸菌发酵液。测定此乳酸菌发酵液的 抗轮状病毒效果，在表2中表示了其结果。而且，以对轮状病毒最有效的短 双歧杆菌K-110发酵麦芽和香菇制得的发酵液，显示出比单独的麦芽或单独 的乳酸菌更出色的抑制轮状病毒感染的效果。另外，表中虽未显示，嗜酸乳 杆菌、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.casei)、婴儿双歧 杆菌(B.infantis)和长双歧杆菌(B.longum)等的效果则低于本发明的发酵 液。
[表2]
乳酸菌发酵物对轮状病毒感染的抑制效果 样品 人感染Wa轮状病毒 50％感染抑制浓度 (mg/ml) 动物感染SA11轮状病毒 50％感染抑制效果 麦芽 0.08 0.09 麦芽发酵物 0.05 0.04 香菇 0.12 0.11 香菇发酵物 0.06 0.05
将乳酸菌生产的细胞壁成分和细胞质成分的最终浓度调至0.1mg/ml，测 定这些乳酸菌的抑制感染效果，表3表示了其结果。如表3所示，与乳酸菌 细胞壁相比，细胞质成分显示出更出色的效果。从此结果可以看出，无论乳 酸菌是活菌还是死菌，都可以使用能够用水或有机溶剂萃取的细胞质成分。
[表3]
乳酸菌对Wa轮状病毒感染的抑制效果 乳酸菌 抑制率(％) 细胞质部分 细胞壁部分 长双歧杆菌KCT 3215 14.3 28.6 短双歧杆菌JCM 1192 28.6 14.3 婴儿双歧杆菌JCM 7007 14.4 14.3 短双歧杆菌K-110 85.7 28.6
我们认为，这样的乳酸菌或乳酸菌发酵液有益于预防轮状病毒感染及治疗 轮状病毒性腹泻。并且，考虑到轮状病毒性腹泻发生于断奶期的儿童，通过 向断奶食品中添加此发酵干燥物来进行摄取，就能够预防轮状病毒性腹泻， 而这种轮状病毒性腹泻占断奶期腹泻的50％。