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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711424634.X (22)申请日 2017.12.25 (71)申请人 上海交通大学医学院附属第九人民 医院 地址 200011 上海市黄浦区制造局路639号 (72)发明人 柴蔚然 匡延平 温晓薇 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限 公司 31253 代理人 冯子玲 (51)Int.Cl. A61K 38/22(2006.01) A61K 31/573(2006.01) (54)发明名称 外源性MPA与hMG在制备动物模型药物中的 应用 (57)摘要 本。
2、发明提供了一种外源性MPA与hMG联合使 用在制备高孕激素状态下促排卵的动物模型的 药物中的应用， 所述的MPA的剂量为2.8-3.2mg/ kg/天， 所述的hMG为4.5-5.5IU/kg/天。 其旨在弥 补现有技术中高孕激素状态下促排卵的动物模 型的药物的空白， 为高孕激素状态下超促排卵方 案疗效及作用机制提供必要的实验基础。 权利要求书1页 说明书4页 附图8页 CN 107982520 A 2018.05.04 CN 107982520 A 1.外源性MPA与hMG联合使用在制备高孕激素状态下促排卵的动物模型的药物中的应 用， 其特征在于， 所述的MPA的剂量为2.8-3.2mg/k。
3、g/天， 所述的hMG为4.5-5.5IU/kg/天。 2.根据权利要求1所述的外源性MPA与hMG联合使用在制备高孕激素状态下促排卵的动 物模型的药物中的应用， 其特征在于， 所述的药物为灌胃干预药物。 3.根据权利要求1所述的外源性MPA与hMG联合使用在制备高孕激素状态下促排卵的动 物模型的药物中的应用， 其特征在于， 所述的MPA的浓度为25-30mg/ml， 所述的hMG的浓度为 15-25IU/ml。 4.一种根据权利要求1所述的高孕激素状态下促排卵的动物模型的检测方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： 步骤(1)： 检测所述动物模型的FSH、 LH、 E2和P水平， 初步观察和评。
4、价所述的动物模型的 构建情况； 步骤(2)： 使用HE染色， 观察所述的动物模型的卵巢形态和各级卵泡数占总卵泡数比 例， 进一步验证所述的动物模型的构建情况； 步骤(3)： 采用免疫组织化学法， 检测所述的动物模型的卵泡形态及激素受体表达， 最 终确定所述的动物模型是否构建成功。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107982520 A 2 外源性MPA与hMG在制备动物模型药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及疾病的动物模型构建领域， 具体涉及外源性MPA与hMG联合使用在制备 高孕激素状态下促排卵的动物模型的药物中的应用。 背景技术 0002 随着人们生活方式的改变， 不孕不。
5、育已成为仅次于癌症和心脑血管疾病的世界第 三大疾病。 不孕不育指一年未采取任何避孕措施， 性生活正常而没有成功妊娠， 分为男性不 孕和女性不孕。 目前， 我国育龄夫妇的患病率在12-15， 导致越来越多的不孕不育患者 寻求辅助生殖技术(ART)来孕育新生命。 控制性促排卵(COH)和体外受精/卵泡浆内单精子 显微注射(IVF/ICSI)是经典的ART过程， 然而， 在COH过程中面临的一系列问题已成为影响 IVF/ICSI成功的关键因素之一。 传统的COH方案是使用促性腺激素释放激素(GnRH)的类似 物或者拮抗剂联用hMG来促进卵泡发育及控制早发LH峰。 然而这些方案在抑制早发LH峰上 的效。
6、果并不理想， 依然有0.34-38的发生率。 早发LH峰的出现会导致过早排卵和黄素 化， 进而导致促排卵周期取消率增加。 因此， 寻求更加安全、 有效的促排卵方案迫在眉行。 卵 泡期高孕激素促排卵(PPOS)是在冷冻胚胎移植和黄体期促排卵方案基础上创立， 在卵泡早 期口服MPA联用hMG达到了促排卵和抑制早发LH峰及OHSS的目的。 该方案在促排卵过程中， 无一例早发LH峰及OHSS的发生， 同时获得了较好的临床结局。 目前， PPOS方案已在临床得到 推广， 然而对其具体机制还不清楚， 需要建立相应的动物模型来探究其作用机制。 0003 卵巢是雌性的生殖器官， 其主要功能是产生类固醇激素及排。
7、卵。 卵巢作为类固醇 激素及卵泡发育的主要场所， 在促排卵过程中主要是通过外源性促性腺激素刺激卵巢， 在 下丘脑-垂体-卵巢轴的调控下， 改变体内类固醇激素的分泌， 促使多个卵泡发育为成熟的 卵母细胞并诱发排卵。 从1978年世界上第一例试管婴儿诞生以来， 多种促排卵方案应运而 生， 如短方案、 长方案、 超长方案、 微刺激方案等， 这些方案对卵巢的刺激程度均不同， 其导 致的卵巢过度刺激综合(OHSS)发生率也不同。 OHSS是一种医源性疾病， 发生率为0.6- 14。 在促排卵过程中， OHSS主要是由于多个卵泡发育、 雌激素水平过高等因素引起血液浓 缩、 肝肾功能损坏、 成人呼吸窘迫综合。
8、征等一系列并发症， 严重时会危害生命。 研究发现， OHSS的发生与促排卵中大剂量GnRH类似物的使用有关。 PPOS方案不同于传统促排卵方案， 该方案在促排过程中通过口服外源性孕激素MPA， 来代替GnRH类似物在促排卵过程中带来 的副作用， 使用该方案的患者无一例出现OHSS， 且具有便于临床应用和安全、 费用低等优 势， 因此， PPOS显示出更为广泛的应用前景。 0004 MPA是一种与孕酮结构相关的17 羟孕酮类衍生物， 作为人工合成的孕激素， 其具 有较高的促孕活性。 研究证实孕激素对下丘脑-垂体-性腺轴具有重要的调节作用， 其可通 过抗雌激素对下丘脑-垂体-性腺轴的正反馈作用而抑。
9、制脉冲性的GnRH和LH分泌， 从而达到 对早发LH峰的控制。 虽然传统研究认为， 卵巢内高孕激素环境下卵泡是无法生长的。 但后来 研究发现， 在女性的生理周期中至少发生两次卵泡波， 黄体期高的孕激素环境下依然有卵 泡可以生长发育。 并且在黄体期促排卵后行IVF-ET， 获得了47.8的妊娠率， 促排卵过程中 说 明 书 1/4 页 3 CN 107982520 A 3 无早发LH峰出现。 那么高孕激素促排卵对卵巢及卵泡有哪些影响， 以及其促排卵机制如何 呢？ 这正是目前需要解决的问题。 0005 到目前为止， 关于高孕激素状态下促排卵的动物模型的药物未见报道。 发明内容 0006 为了克服上。
10、述现有技术的不足， 方便对PPOS方案的机制进行充分研究， 本发明提 供了一种外源性MPA与hMG联合使用在制备高孕激素状态下促排卵的动物模型的药物中的 应用， 旨在弥补现有技术中高孕激素状态下促排卵的动物模型的药物的空白， 为高孕激素 状态下超促排卵方案疗效及作用机制提供必要的实验基础。 0007 本发明第一方面提供了一种外源性MPA与hMG联合使用在制备高孕激素状态下促 排卵的动物模型的药物中的应用， 所述的MPA的剂量为2.8-3.2mg/kg/天， 所述的hMG为4.5- 5.5IU/kg/天。 0008 较佳地， 所述的药物为灌胃干预药物。 0009 较佳地， 所述的MPA的浓度为2。
11、5-30mg/ml， 所述的hMG的浓度为15-25IU/ml。 0010 本发明第二方面提供了上述的高孕激素状态下促排卵的动物模型的检测方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： 0011 步骤(1)： 检测所述动物模型的FSH、 LH、 E2和P水平， 初步观察和评价所述的动物模 型的构建情况； 0012 步骤(2)： 使用HE染色， 观察所述的动物模型的卵巢形态和各级卵泡数占总卵泡数 比例， 进一步验证所述的动物模型的构建情况； 0013 步骤(3)： 采用免疫组织化学法， 检测所述的动物模型的卵泡形态及激素受体表 达， 最终确定所述的动物模型是否构建成功。 0014 一般来说， 所构建成功。
12、的动物模型的FSH升高， LH、 E2和P降低； FSHR高， LHR低。 动物 模型的FSH为16.163.2， LH为10.121.5、 E2为171.719.5和P为3.090.4。 0015 本发明的有益效果为： 0016 (1)本发明针对高孕激素状态下超促排卵方案成功的提供了一种高孕激素状态下 超促排卵动物模型的药物； 0017 (2)本发明中模型动物饲养周期短， 廉价易于饲养， 模型动物(小鼠)的干预过程与 人类干预过程类似， 可以通过多种检测手段， 观察模型构建后多项指标， 并以各项检测指 标， 确定模型是否构建成功； 0018 (3)本发明的动物模型生物学特性稳定， 可做病理形。
13、态学对比分析， 还可以进行统 计学处理、 分析； 0019 (4)本发明的动物模型构建周期短、 发展快， 重复性好， 不孕不育的治疗提供了新 工具， 为PPOS方案机制的探究提供了新材料。 附图说明： 0020 图1为本发明实施例中动物模型构建的流程图。 0021 图2A为本发明实施例中模型构建后血清激素FSH检测结果， 0022 图2B为本发明实施例中模型构建后LH检测结果， 说 明 书 2/4 页 4 CN 107982520 A 4 0023 图2C为本发明实施例中模型构建后E2检测结果， 0024 图2D为本发明实施例中模型构建后P检测结果。 0025 图3是本发明实施例中卵巢形态学检。
14、测。 0026 图4是本发明实施例中各级卵泡占总卵泡比图片。 0027 图5A为免疫组织化学法检测激素受体FSHR检测结果， 0028 图5B为免疫组织化学法检测激素受体LHR检测结果， 0029 图5C为免疫组织化学法检测激素受体ER检测结果， 0030 图5D为免疫组织化学法检测激素受体PR检测结果。 具体实施方式 0031 下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明， 以更好地理解本发明。 0032 实施例 0033 采用MPA和hMG的药物进行一种高孕激素状态下超促排卵的动物模型的构建方法， 流程如图1所示， 是通过如下步骤实现的： 0034 (1)选取6周龄的雌性小鼠， 于每日早8:。
15、00观察性周期， 连续观察两个性周期， 选取 性周期正常的小鼠作为模型构建对象； 0035 (2)将步骤(1)中选出的小鼠随机分成实验组、 正常对照组、 阴性对照组和阳性对 照组； 将MPA片碾磨成粉状， 用色拉油配制成30mg/ml的MPA悬浮液， 同时将hMG粉状配制成 20IU/ml的hMG液体， (MPA悬浮液和hMG液体的每日饲喂量)， 于每日早8:00灌胃， 连续灌胃5 天； 正常对照组以同等剂量的色拉油灌胃； 阴性对照组以同等剂量的MPA悬浮液灌胃； 阳性 对照组施以同等剂量的hMG； 0036 每日早8:00将小鼠从笼中取出， 将占有生理盐水的小棉签轻轻插入雌鼠阴道中， 并轻轻。
16、转动， 抽出涂到多聚甲醛包被的玻片上。 于光学显微镜下观察玻片上细胞形态， 根据 细胞形态判断性周期： 使用外源性MPA与hMG进行灌胃干预前， 连续观察两个性周期； 造模干 预第3天开始每天早8:00进行阴道脱落细胞涂片检查， 第5天实验组小鼠出现动情周期紊 乱， 提示药物起了一定作用， 开始进行检测。 0037 小鼠性周期经历动情的不同阶段时的不同表征如下： 0038 动情前期： 阴道细胞涂片可观察到大量有核上皮细胞； 0039 动情期： 大量无核角化上皮细胞， 间有少量有核上皮细胞， 无白细胞； 0040 动情后期： 在角化上皮细胞间出现白细胞； 0041 动情间期： 大量白细胞， 少量。
17、上皮细胞和粘膜粘液。 0042 上述所得高孕激素状态下超促排卵的动物模型的检测指标， 如下所示： 0043 (1)于早8:00观察小鼠的动情周期， 检测小鼠血清的FSH、 LH、 E2和P水平， 初步观察 和评价动物模型的构建情况， 结果如图2A、 2B、 2C、 2D所示， 图中各组分别为正常对照组， 阴 性对照组， 阳性对照组和模型组； 可见模型组相较于正常对照组和阴性对照组， 血清激素 FSH升高， LH、 E2和P水平降低； 0044 具体操作为： (a)实验标本收集： 收集外周血于1.5mL的Ep管备用； 收集双侧卵巢， 并将周围脂肪组织剔除， 精密天平秤取双侧卵巢湿重， 取各组单侧。
18、卵巢置于10中性甲醛 固定， 进行常规石蜡包埋， 连续、 数套切片备用； (b)用ELISA法测定小鼠血清中FSH、 LH、 E2和 说 明 书 3/4 页 5 CN 107982520 A 5 P浓度， 按照试剂盒操作说明书进行测定。 具体操作如下： 将各种试剂至室温平衡半小时， 配 制洗涤液； 在预包被板上加标准片及血清， 同时设置空白孔； 加入抗原及抗体后混匀， 37 孵育1小时； 洗板后加入显色液显色； 酶标仪测定各孔OD值； 0045 (2)使用HE染色， 在光学显微镜下观察HE染色后卵巢组织并记录各级卵泡数， 观察 卵巢形态和各级卵泡数占总卵泡数比例， 进一步验证动物模型的构建情况。
19、， 如图3、 图4所 示， 模型组卵巢形态正常， 有3个以上发育正常的窦卵泡且无黄体生成； 模型组次级卵泡数 和窦卵泡数增加， 闭锁卵泡数与黄体数降低； 0046 (3)利用免疫组织化学法检测卵巢FSHR、 LHR、 ER和PR表达， 最终确定模型是否构建 成功， 分别如图5A、 5B、 5C、 5D所示； 0047 具体操作为： 将固定好的卵巢组织行脱水、 包埋、 切片后， 进行脱蜡处理； 抗原修复 后PBS洗2-3次， 每次5min； 加正常山羊血清封闭后一抗孵育， 在4冰箱中静置10h； 室温复 温3min后PBS洗3次， 每次5min后， 二抗孵育1小时洗片， 行DAB显色和苏木精复染。
20、， 最后， 进行 常规脱水、 透明、 封片。 0048 本发明的有益效果为： 0049 (1)本发明针对高孕激素状态下超促排卵方案成功的提供了一种高孕激素状态下 超促排卵动物模型的药物； 0050 (2)本发明中模型动物饲养周期短， 廉价易于饲养， 模型动物(小鼠)的干预过程与 人类干预过程类似， 可以通过多种检测手段， 观察模型构建后多项指标， 并以各项检测指 标， 确定模型是否构建成功； 0051 (3)本发明的动物模型生物学特性稳定， 可做病理形态学对比分析， 还可以进行统 计学处理、 分析； 0052 (4)本发明的动物模型构建周期短、 发展快， 重复性好， 不孕不育的治疗提供了新 工。
21、具， 为PPOS方案机制的探究提供了新材料。 0053 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述， 但其只是作为范例， 本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。 对于本领域技术人员而言， 任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。 因此， 在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改， 都应涵盖在本发明的范围内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107982520 A 6 图1 图2A 说 明 书 附 图 1/8 页 7 CN 107982520 A 7 图2B 图2C 说 明 书 附 图 2/8 页 8 CN 107982520 A 8 图2D 说 明 书 附 图 3/8 页 9 CN 107982520 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 4/8 页 10 CN 107982520 A 10 图5A 说 明 书 附 图 5/8 页 11 CN 107982520 A 11 图5B 说 明 书 附 图 6/8 页 12 CN 107982520 A 12 图5C 说 明 书 附 图 7/8 页 13 CN 107982520 A 13 图5D 说 明 书 附 图 8/8 页 14 CN 107982520 A 14 。