发明领域
本发明涉及包含三肽VPP、IPP和/或LPP的水解酪蛋白产物。 本发明还涉及所述水解酪蛋白产物的制备方法和使用水解酪蛋白产 物所生产的食品。
发明背景
高血压被认为是心血管疾病(CVD)的主要危险因子之一。其调节 血压的机制之一是肾素-血管紧张素系统。这是导致形成血管紧张素II 的一个级联反应，血管紧张素II具有强烈的血管收缩效应并因此具 有升高血压的效应。在该级联中一个关键酶即血管紧张素I转变酶 (ACE)的抑制，降低血管紧张素II的形成，并因而具有降低血压的效 应。长期人为干预研究已经表明，定期摄入少量ACE抑制剂能降低 CVD达25％(Gerstein等(2000)，The Lancet 355，253-259)。在一项安 慰剂-对照研究中，在高血压病人中显示出酸奶中VPP和IPP有降低 血压的效应(Hata，Y等(1996)，American Journal of Clinical Nutrition 64， 767-771)。
一种声称“适合轻度高血压人群”的市售发酵乳制品是Calpis 酸奶，Calpis酸奶是用瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和酿酒酵 母(Saccharomyces cervisiae)发酵的酸奶，其由日本的Calpis Food Industry公司生产。
另一种市售发酵乳制品是由芬兰的Valio公司生产的Evolus，其 声称这是“欧洲出现的第一例能降血压的功能性食品”。
这两种发酵乳制品都用瑞士乳杆菌菌株进行发酵。其产品中含 有能在体外抑制ACE的生物活性肽(VPP和IPP)，所述肽是由酪蛋白 水解产生的。与其它乳酸菌相比，瑞士乳杆菌是最有效的蛋白水解 乳杆菌之一。
由乳酸菌蛋白水解系统对酪蛋白的分解可以分为三步。第一步， 通过胞外蛋白酶进行酪蛋白水解，第二步，通过使用特殊的摄取机 制摄取二肽/三肽和寡肽(4-12个氨基酸残基)。最后一步，通过胞内 肽酶进一步降解肽，得到小肽和氨基酸供细菌生长。乳酸菌这一复 杂的蛋白水解系统在以下文献中有描述：Kunji等，(1996)，Molecular Microbiology 27，1107-1118。有关胞内肽酶系统的综述可参见 Christensen等，(1999)，Molecular Microbiology 76，217-246。
根据EP-A-1016709，需要生产与发酵乳中产生的乳酸含量相比 具有更高含量的乳三肽(lactotripeptides)的发酵乳。它提供了一株瑞士 乳杆菌菌株CM4，该菌株在发酵中每0.01g DL-乳酸获得30-50μg三 肽Val-Pro-Pro(VPP)和Ile-Pro-Pro(IPP)。在EP-A-1016709的表2中 显示，该菌株产生38.5μg/ml乳清VPP和23.5μg/ml乳清IPP，这相 当于如下文中定义的IPPeq值为140。
WO 01/034828公开了用酶从酪蛋白开始生产三肽VPP和/或IPP 的方法。在该方法中，用蛋白酶处理酪蛋白，产生中间体肽，然后 用肽酶消化中间体肽。在WO 01/034828中，最好的结果见实施例2， 在用木瓜蛋白酶和来自瑞士乳杆菌的肽酶水解酪蛋白时，得到VPP (收率为25％)和IPP(收率97.5％)，其收率均以β-酪蛋白计算。假定 脱脂奶粉中平均含量为30％重量的β-酪蛋白和15％重量的κ-酪蛋白， 则根据本文的应用，IPP收率以β-酪蛋白计算为97.5％的收率相当于 以β-酪蛋白和κ-酪蛋白之和计算为54％的收率。在其它实例中，报 道了更低的收率。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种具有高含量的三肽VPP、IPP和/ 或LPP的食品。对于WO 01/034828，其目的是提高三肽VPP和/或IPP 的收率。本发明的另一个目的是提供一种简单而低成本地制备包含 VPP、IPP和/或LPP的食品的方法。本发明的再一个目的是提供一 种味道良好的食品。
按照本发明所提供的制备包含三肽VPP、IPP和/或LPP的水解 酪蛋白产物的方法，就能达到这些目的中的一个或多个目的，其中 包含酪蛋白或酪蛋白片段的底物用酶进行处理，其中所述酶来源于 曲霉属(Aspergillus)，其中该酶浓度以酪蛋白计算为2-10％重量，并 且该酶具有高的蛋白水解活性。
按照一个优选的实施方案，所述酶包括内肽酶、外肽酶和蛋白 酶。
本发明还涉及水解酪蛋白食品，所述食品包含200μM或200μM 以上IPPeq，优选400μM或400μM以上IPPeq，IPPeq的定义见下文。 最好是水解酪蛋白食品没有苦味。
发明详述
除非另有说明，在本文中，重量百分比表示为相对于总重量的 百分比。
在本文中，应当理解，酶也包括不止一种酶的混合物。
通用的单字母代码通常用来描述氨基酸。
在本文中，应当理解，酪蛋白包括所有种类的酪蛋白，包括α- 酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白和κ-酪蛋白。值得注意的是，片段IPP 存在于β-酪蛋白和κ-酪蛋白两者之中。片段VPP和LPP却只存在于 β-酪蛋白中。
在本文中，底物当用作经酶处理的物质时，是指任何含有酪蛋 白和/或酪蛋白片段的物质。
在本文中，蛋白酶是任何一组切割蛋白质(多肽)的肽键而产生更 短的肽和氨基酸的酶。
在本文中，外肽酶定义为仅在多肽链末端附近起作用的酶。根 据其在N末端或C末端的作用位点，它们可分别分为氨肽酶或羧肽 酶。
在本文中，内肽酶定义为在多肽链内部区域而不在N末端和C 末端优先作用于肽键的酶。
在本文中，酶的高蛋白水解活性定义为依照本说明书实验部分 所测定，在水解时间为6小时、酶浓度以酪蛋白计算为5％重量时， 对应于水解度为20％或20％以上的蛋白水解活性。
优选酶的X-脯氨酰二肽基氨肽酶活性为400U/kg或400U/kg以 上，更优选700U/kg或700U/kg以上，甚至更优选1200U/kg或1200U/kg 以上。
肽Val-Pro-Pro缩写为VPP；肽Ile-Pro-Pro缩写为IPP；肽Leu- Pro-Pro缩写为LPP。在本文中，乳杆菌属(Lactobacillus)缩写为Lb。
本文定义的三肽VPP、IPP和/或LPP包括VPP、IPP、LPP以及 这三种肽的混合物。在本文中，通过将混合物中三肽的摩尔量相加 而计算出三肽VPP、IPP和/或LPP在混合物中的总摩尔量。
本发明的方法能得到具有不同活性的活性三肽VPP、IPP和 LPP。IC50，即导致ACE活性抑制50％的浓度，对于IPP来说为5μM， 对于VPP来说为9μM(Kohmura，M.等(1990)，Agricultural and Biochemical Chemistry，54，835-836和Nakamura，Y.等，(1995)，J.Dairy Sci.78，1253-1257)。对于LPP来说IC50的ACE抑制值为9.6μM (Maruyama S.等(1989)，Agricultural and Biochemical Chemistry，53， 1077-1081)。已经表明，LPP存在于玉米(玉米醇溶蛋白)水解产物中， 其在自发性高血压大鼠中具有抗高血压效应(M.Shinsuke等(1991)， Agric.Biol.55(5)，1407-1408)。
为了用一个单因数来表示这些活性肽IPP和VPP的总浓度，在 本文中使用了当量IPP浓度[IPPeq]，其定义如下并且优选用μM表示：
[IPPeq]＝[IPP]+5/9*[VPP] (1)
为了表示所有含有支链氨基酸-脯氨酸-脯氨酸序列(例如IPP、 VPP和LPP)的活性三肽的总浓度，在本文中也使用当量BPP浓度 (BPPeq)，其定义如下并且优选用μM表示：
BPPeq＝[IPP]+5/9*[VPP]+5/9.6*[LPP] (2)
本发明的方法包括将底物用源自曲霉的酶进行处理的步骤。在 本文中，底物定义为经酶处理的物质。
底物可以是任何适合作为人类食品、含有酪蛋白和/或酪蛋白片 段的物质。
优选的底物是奶。动物奶例如牛奶、羊奶、骆驼奶、马奶都可 以作为底物来使用。可使用脱脂奶。底物中固形物含量并未作具体 限定，但是通常为5-20％重量。底物可以是由水和奶配料(例如(脱脂) 奶粉)混合而制成的复原奶。底物中可以含有添加剂，例如糖类等， 只要这些添加剂不干扰酶处理和/或发酵即可。优选底物中可以使用 酪蛋白酸盐，例如酪蛋白酸钾和/或酪蛋白酸钙。
在一个优选的实施方案中，底物是发酵奶，其可以按照下文所 述的发酵方法来生产。在该优选的实施方案中，酪蛋白首先经过发 酵，然后进行酶处理。
另一个实施方案包括发酵和酶处理同时进行，例如向正在进行 发酵的发酵罐中加入源自曲霉的酶。
可以按常规方式进行酶处理。该方式包括向底物中加入酶(或酶 混合物)，并且在适合进行酶促水解的受控条件下维持所得反应混合 物。需要控制的条件包括温度、pH、反应时间和酶浓度。反应混合 物的温度优选为40-60℃，更优选45-55℃，最优选约50℃。反应混 合物的pH优选为5-9，更优选5.5-7，最优选6-6.5。酶浓度以酪蛋 白总重量计算为2-10％重量，更优选3-10％重量，最优选4-6％重量。 反应时间(水解时间)优选为2-50小时，更优选2-10小时，最优选4-8 小时。所用的酶应当来源于曲霉。我们已经惊奇地发现，用相对大 量的源自曲霉的酶来进行酪蛋白水解，所得三肽VPP、IPP和/或LPP 的量要高很多。优选所述酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在另一个优选的实施方案中，酪蛋白的水解可以用曲霉发酵步 骤来取代。在该优选的实施方案中，据信真菌曲霉在发酵中产生所 述酶，在原位进行酪蛋白水解。在该优选的实施方案中，应当以此 方式进行发酵，使得在原位产生大量的酶(包括内肽酶、外肽酶和蛋 白酶)。
本发明的食品定义为适合人类消费的产品，其中本发明的酪蛋 白水解产物作为一种配料，其用量为获得显著的ACE抑制效应的有 效量。
包括发酵在内的优选实施方案的描述
按照该优选实施方案，用于酶处理的底物是得自瑞士乳杆菌发 酵的发酵产物。因此，水解酪蛋白产物的制备方法任选包括发酵步 骤。
可在常规发酵罐中进行瑞士乳杆菌发酵，其中含有酪蛋白的原 料作为培养基，接种瑞士乳杆菌。含有酪蛋白的原料可以是任何含 有酪蛋白的材料，优选是也可用作如上定义的底物的材料，例如奶。
发酵步骤的条件规定如下。瑞士乳杆菌可以是任何瑞士乳杆菌 菌株。优选的菌株是产生大量三肽VPP和/或IPP的菌株。最优选瑞 士乳杆菌菌株CNRZ 244，该菌株保藏在Centre National de Recherches Zootechniques，Jouy-en-Josas，France。
发酵培养基中可任选加入其它微生物，只要能达到本发明目的 即可。例如，也可加入酵母以改良所得水解酪蛋白产物的风味和适 口性。
酵母菌株并未作具体限定，例如，可优选使用酵母属 (Saccharomyces)的酵母，例如酿酒酵母。可以根据所需结果来适当选 择酵母的含量。
对于培养基中所接种的瑞士乳杆菌的数量并未作具体限定。接 种量通常约为107-109个瑞士乳杆菌细胞。
发酵中可以加入瑞士乳杆菌，优选呈具有足够活性的预制起子 的形式。起子的最初细胞计数优选约为107-109个细胞/ml。
发酵罐中的物料(包括瑞士乳杆菌接种物和含酪蛋白原料)可以按 常规方式进行混合，以得到均匀的发酵培养基。
发酵最好在25-50℃、优选在35-45℃进行3-80小时、优选6-25 小时。优选发酵温度为38-42℃，因为在该温度范围内可生成最大量 的三肽VPP和/或IPP。
在发酵中，pH是生成三肽VPP和/或IPP的关键因素。因此， 在发酵的主要阶段，优选pH为4.3-4.9，更优选4.4-4.8，最优选 4.5-4.7。在本文中，发酵的主要阶段是指至少1小时或更长的发酵时 间。优选发酵中的pH在3小时或更长的发酵时间内是受控的，更优 选在5小时或更长时间内是受控的。
可以通过向发酵培养基中加入碱(或缓冲剂)来控制pH。所述碱 可以是任何适用于制备食品的碱。在本文中，这样的控制发酵称为pH 控制发酵。没有pH控制，在本文中称为自由酸化发酵。
在发酵期间，瑞士乳杆菌除此之外还产生乳酸。乳酸(HLa或LaH) 离解成质子即H+和乳酸根阴离子即La-(在本文中有时称为溶解的乳 酸盐，当存在其它来源的阳离子时，通常来源于碱或缓冲盐)。离解 量与溶液中的pH和乳酸的pKa有关。乳酸的pKa在25℃时为3.86(在 50℃时约为3.89)。以下等式(3)描述了pH、pKa和乳酸离解度之间的 关系。
pH＝pKa+log([La-]/[LaH]) (3)
等式(3)显示，当pH等于酸的pKa时，半数酸离解。在更高的pH 值时，大部分乳酸呈乳酸根阴离子形式。如果发酵液的pH值介于3.0 和4.5之间时，将会有大量乳酸呈未离解形式。实际上，在pH为3.0 时，游离乳酸(未离解的)与乳酸根离子的摩尔比在25℃时约为7.0； 而在pH约为4.5时，所述比值在25℃时约为0.23。
pH控制发酵的一个优选方案如下进行：接种后，(1)进行自由酸 化发酵，直到达到所需pH(范围为4.3-4.9)时，然后(2)进行pH控制 发酵，和任选(3)然后进行第二次自由酸化发酵，直到结束，例如在pH 3.5-4.0时。该方案的结果是，可以产生大量的当量IPP，同时在水解 酪蛋白产物中又保持相对低水平的盐。
优选所述碱为金属盐，所述金属在食物中是常见的，但是并不 会升高血压。优选所述碱为氢氧化物。优选不包括含钠碱，例如氢 氧化钠。更优选所述碱为选自以下的盐：钙盐、钾盐和/或镁盐。所 述碱的金属离子K+、Ca2+和/或Mg2+，作为pH控制发酵的结果，将 成为水解酪蛋白产物的组成部分并且可降低人的血压。
优选发酵期间溶解氧(dO2)的水平为5％或更低。与高氧水平相 比，在低溶解氧水平下，三肽VPP和/或IPP的产量增加。发酵罐中 可以通入氮气等惰性气体，以便达到低溶解氧水平。
有利的是，在酶处理和任选发酵后，可以进行几个额外的工艺 步骤。例如可以通过冷却水解酪蛋白产物，使得例如固体乳酸钙和/ 或乳酸镁沉淀，从而将这些乳酸盐从水解酪蛋白中分离出来。水解 酪蛋白产物可以照原样使用，或者可以稀释，它可以浓缩，可以纯 化并且可以干燥，优选喷雾干燥或冷冻干燥。干燥的水解酪蛋白产 物在下文也称为水解酪蛋白固体。
按照本发明，相对大量的VPP、IPP和/或LPP分子可以从所述 底物中释放出来。优选VPP对其底物的摩尔收率为30％或30％以上， 优选40％或40％以上，更优选50％或50％以上。
VPP的摩尔收率定义为用实验(发酵和/或酶促水解)中产生的 VPP摩尔量除以实验开始之前含酪蛋白原料中存在的β-酪蛋白总量中 VPP片段的摩尔量所得到的百分数。类似计算可求出IPP和LPP的 摩尔收率。请注意，VPP序列和LPP序列存在于β-酪蛋白中，而IPP 序列存在于β-酪蛋白和κ-酪蛋白中。
IPP的摩尔收率优选为60％或60％以上，更优选75％或75％以 上，最优选80％或80％以上。
按照本发明的方法，可得到水解酪蛋白产物，所述产物包含三 肽VPP、IPP和/或LPP，其含量用当量IPP浓度[IPPeq]表示为200μM 或200μM以上，更优选400μM或400μM以上，甚至更优选600μM 或600μM以上，最优选700-3500μM。
优选在本发明水解酪蛋白产物的制备方法中，LPP的摩尔收率 为20％或20％以上，更优选45％或45％以上，甚至更优选80％或80％ 以上。优选本发明的食品包含25μM或更多LPP。
优选水解酪蛋白产物包含50-200mmol/kg K+和/或15-60mmol/kg Ca2+和/或6-25mmol/kg Mg2+，更优选100-150mmol/kg K+和/或30- 50mmol/kg Ca2+和/或10-25mmol/kg Mg2+，最优选110-135mmol/kg K+和/或35-45mmol/kg Ca2+和/或13-20mmol/kg Mg2+。这些离子的加入 将会具有抗高血压效应。
人类可消费水解酪蛋白产物或者源自它们的产品。它们也可以 在食品中用作食品配料。优选在这种情况下，食品中当量IPP浓度和 K+、Ca2+和Mg2+水平在本文为水解酪蛋白产物所限定的范围内。
本发明的水解酪蛋白产物或源自它们的食品可以通过巴氏消毒 或灭菌处理。
本发明的食品可以是任何食品类型。它们除加有水解酪蛋白产 物之外，还可包含适量的常用食品配料，例如香料、糖、水果、矿 物质、维生素、稳定剂、增稠剂等。优选所述食品是果汁产品、乳 制品或冷冻甜点食品。这些优选的食品类型在下文和实施例中有详 细描述。
· 果汁产品
本发明果汁产品的实例是得自柑橘类水果(例如橙子和葡萄柚)、 热带水果、香蕉、桃子、梨、草莓的果汁，其中固形物部分或全部 由水解酪蛋白固体组成。
· 乳制品
本发明乳制品的实例为牛奶、含乳抹酱(dairy spread)、奶油乳酪、 含乳饮品和酸奶，其中乳固形物部分或全部由水解酪蛋白固体组成。 水解酪蛋白产物可用作例如含乳饮品。也可加入香料或其它添加剂。 乳制品也可通过向水或乳品中添加水解酪蛋白而制得。
酸奶类制品的组成的实例是约50-80％重量水、0.1-15％重量水 解酪蛋白固体、0-15％重量乳清粉、0-15％重量糖(例如蔗糖)、0.01-1％ 重量酸奶培养物、0-20％重量水果、0.05-5％重量维生素和矿物质、0- 2％重量香料、0-5％重量稳定剂(增稠剂或胶凝剂)。
通常一份酸奶类制品可为50-250g，一般为80-200g。
· 冷冻甜点食品
对于本发明的目的，术语冷冻甜点食品包括含乳的冷冻甜点例 如冰淇淋、冻酸奶、含乳冰冻果汁(sherbet)、冰冻果汁(sorbet)、冻牛 奶(ice milk)和软质乳冻(frozen custard)、冰棒(water-ice)、意式冰糕 (granitas)和冻果泥(frozen fruit puree)。
优选冷冻甜点中固形物(例如糖、脂肪、香料等)含量大于3％重 量，更优选为10-70％重量，例如40-70％重量。
冰淇淋通常包含0-20％重量脂肪、0.1-20％重量水解酪蛋白固体、 甜味剂、0-10％重量脱脂乳成分和任选的成分，例如乳化剂、稳定剂、 防腐剂、香料、维生素、矿物质等，余量为水。通常冰淇淋中可搅 入空气例如至膨胀度为20-400％，更准确地讲为40-200％，并且冷冻 至-2℃至-200℃的温度，更准确地讲为-10℃至-30℃。冰淇淋通常包 含约0.1％重量的钙。
技术人员可以根据常识，使用适量的水解酪蛋白或源自水解酪 蛋白的产品(例如水解酪蛋白固体)作为配料，来生产本发明的其它食 品。所述食品的实例为烘焙食品、乳制品、快餐小吃等。
所述食品最好是含油和水的乳剂，例如抹酱(spread)。在本文中， 油水乳剂定义为包含油和水的乳剂，并且包括水包油水(O/W)乳剂和 油包水乳剂(W/O)以及更复杂的乳剂，例如水包油包水(W/O/W/O/W) 乳剂。在本文中，油定义为包括脂肪。
优选所述食品是抹酱、冷冻甜点或酱汁。
优选本发明的抹酱包含30-90％重量植物油。最好是抹酱的pH 为4.2-6.0。
实施例
IPP、IPPL、LPP和VPP含量的测定
使用HPLC-MRM-MS，以正ESI方式，对IPP、IPPL、LPP和 VPP进行定量测定。用HP1100(Agilent)的HPLC系统结合Quattro-II 三节四极质谱仪(Micromass UK)，对样品进行分析。将样品注入Varian 150×2.1mm Inertsil ODS-3柱(GL_Sciences进行预填充)。线性梯度洗 脱为：在46分钟内，从100％含0.1％三氟乙酸(TFA)的水至100％含 0.1％TFA的乙腈，流速为0.2ml/min，柱温为60℃。MS的离子源 是以正电子喷雾方式进行操作。在MRM中，监测产物离子m/z 213.1 和m/z 183.1，对于IPP和LPP的先驱离子m/z为326.3，对于VPP 为m/z 213.1和m/z 169.1和对于内标物UC13IPP为m/z 213.1和m/z 189.1.对于所有化合物，锥体电压和碰撞能量为20V和20eV。所 用的碰撞气体为氩气，碰撞气压为2.3×10-3mbar。对于每种化合物， 用各自相关内部校准曲线进行定量测定。
蛋白酶活性：
用试卤灵标记的通用蛋白酶酪蛋白(Universal Protease Casein) (Boehringer Mannheim)作为底物，测定酶混合物的蛋白酶活性。该测 定所根据的原理是：使用蛋白酶，通过降解试卤灵标记的酪蛋白， 试卤灵标记的肽随时间释放。
将50μL标记的底物溶液、50μL 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0) 和100μL合适稀释度的酶液混合，并在50℃保温60分钟。通过加入 三氯乙酸和离心(以14000rpm离心10分钟)，使剩余的试卤灵标记 的酪蛋白沉淀。将80μL上清液样品加入到120μL测定缓冲液(pH8.8) 中，然后在574nm读取吸光度。
按此方式，测定一种酶混合物的几个稀释度，绘制60分钟保温 后在574nm下获取的吸光度与酶混合物含量(μg)之间的线性曲线。 蛋白酶活性表示为任意单位(AU)，该单位是通过将线性曲线的斜率 乘以10000而计算出来的。蛋白酶的比活表示为任意单位/μg酶混合 物(AU/μg)。
X-脯氨酰二肽基氨肽酶活性：
使用1mM甘氨酸-脯氨酸-对硝基苯胺(GP-pNa)底物在100mM 磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的溶液，通过将合适稀释度的酶样品于50℃ 保温，并且监测其在405nm下的吸光度长达20分钟，来测定酶混 合物的X-脯氨酰二肽基氨基活性。使用的对硝基苯胺摩尔消光系数 为9620M-1cm-1，根据吸光度的增加计算单位酶活性。X-脯氨酰二肽 基氨基活性表示为U/kg。粗酶混合物每分钟转化1μMol GP-pNa表 示1U。
蛋白水解活性：
水解酪蛋白样品中游离氨基酸、肽和蛋白质的氨基总量的存在， 用来评价酶促水解和/或用乳酸菌发酵后的总蛋白水解。使用一种描 述于以下文献的食物蛋白水解产物中水解度的测定方法：Adler-Nissen J.in Agric.Food Chem.27，1256-1262(1979)。
将5μL样品、5μL亮氨酸标准品(0.25-2.5mM)或5μL去离子水， 加入到40μL 0.21M磷酸缓冲液(pH8.2)和40μL 0.1％重量TNBS液 中，然后在50℃避光保温60分钟。通过加入80μL 0.1M HCl猝灭反 应物。在340nm测定吸光度(Adler-Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food proteins.New York：Elsevier Applied Science Publishers，第110- 169页(1986))。
水解酪蛋白产物中存在的氨基总量表示为mM亮氨酸当量。
酶促水解和/或发酵酪蛋白产物中蛋白水解程度表示为水解度 (DH)，其定义如下：
水解度＝所切割的肽键数/蛋白中存在的肽键总数*100％
实施例1和2：水解乳的制备
通过在9％重量脱脂奶粉(Promex，Coberco，荷兰)中加自来水并 混合，然后灭菌，复原脱脂奶(9％SMP)。将无菌复原脱脂奶与0.16％ 重量(5％重量基于酪蛋白)真菌蛋白酶浓缩物(Fungal Protease Concentrate)(Genencor)或0.16％重量(5％重量基于酪蛋白)鲜味强化酶 (Umamizyme)(Amano)一起在50℃保温6小时(pH7.0)。这两种酶混 合物均来源于米曲霉，并且其组成为蛋白酶和肽酶。
实施例3-6和比较实施例A-I：水解发酵乳的制备
酪蛋白原料用瑞士乳杆菌CNRZ 244进行发酵，然后所得发酵 乳(在本文中也称为发酵乳底物)用表1中提到的酶进行处理。
发酵乳底物的制备：
将无菌脱脂奶(Yopper，Campina，荷兰)与4％的瑞士乳杆菌 CNRZ 244培养物(所述培养物一直在-80℃贮藏，作为上述脱脂奶的 完全生长培养物)在37℃保温24小时，然后用无菌10％甘油稀释至 终浓度为6％甘油。该预培养物(preculture)命名为预培养物-1。
用无菌脱脂奶(Yopper，Campina，荷兰)制备预培养物(预培养物- 2)，并且接种2％重量预培养物-1即瑞士乳杆菌CNRZ 244。使用顶 隙氮气吹扫，在厌氧条件下搅拌预培养物-2并在40℃保温24小时。
通过在9％重量脱脂奶粉(Promex，Coberco，荷兰)中加入自来水 并混合，然后灭菌，复原脱脂奶。在一个搅拌的反应罐中，在无菌 复原奶中接种2％重量预培养物-2。搅拌速度保持在150rpm并且监 测溶解氧和pH。
使用顶隙氮气吹扫来维持厌氧条件。在最初8小时发酵期间， 让奶液的pH从pH6.5降至pH4.6。在pH4.6时，使用氢氧化钙和 氢氧化钾的碱混合物，控制pH长达3.5小时。在该pH控制期后， 使pH重新降到4.0。
发酵后，发酵乳在75℃经巴氏消毒15秒。经巴氏消毒的发酵乳 制品在比较实施例A中称为发酵乳底物。
对于实施例3-6和比较实施例B-I，发酵乳底物与0.16％重量(5％ 重量基于酪蛋白)的含有蛋白酶和肽酶的不同酶混合物一起在50℃保 温6小时(pH7)。
表1：在实施例1-5和比较实验A-K中使用的酶混合物(蛋白酶和肽 酶混合物)及其在粗酶混合物中所测得的活性(ND＝未测定，NA＝未 用，BDL＝检出限以下) 实施 例/ 比较 实验 酶 来源： 供应商 蛋白水 解活性 (U/kg) X-脯氨 酰二肽基 氨肽酶活 性(U/kg) 1 2 A B C D E F G H I 3 4 5 K 真菌蛋白酶浓缩物 鲜味强化酶 NA Proleather FG-F Multifect P-3000 Multifect Neutral 肽酶R Protex 6L Promod 280P 胃蛋白酶P389P GC 106 Promod 194P 真菌蛋白酶浓缩物 鲜味强化酶 风味蛋白酶 (Flavourzyme) 米曲霉 米曲霉 瑞士乳杆菌发酵 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 枯草芽孢杆菌 解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 米根霉(Rhizopus oryzae) 地衣芽孢杆菌 (Bacillus lichiformis) 枯草芽孢杆菌 猪胃 黑曲霉(Aspergillus niger) 曲霉属(Aspergillus) 米曲霉 米曲霉 米曲霉 Genencor Amano NA Amano Genencor Amano Genencor Biocatalyst Biocatalyst Genencor Biocatalyst Genencor Amano Novozymes 1219 2112 NA 2618 2547 1603 ND 4287 ND BDL BDL 1025 1219 2112 357 730 2768 NA 107 23 26 ND 13 ND 0 13 483 730 2768 117
表2：在实施例1-5和比较实施例A-I中蛋白酶与肽酶混合物所进行 的保温实验结果(ND为未测定，NA为未用)： 实 施 例 底物 IPPL 浓度 (μM) VPP 浓度 (μM) IPP 浓度 (μM) LPP 浓度 (μM) IPPeq (μM) BPPeq (μM) β-酪蛋 白的 VPP摩 尔收率 β-酪蛋白 和κ-酪蛋 白的IPP 摩尔收率 β-酪蛋 白的 LPP摩 尔收率 水解度为 DH 1 2 A B C D E F G H I 3 4 5 9％SMP 9％SMP 9％SMP 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 发酵乳 2 0 23 13 13 33 25 14 17 26 0 3 0 0 293 350 96 49 56 44 45 89 81 91 90 88 427 320 331 413 83 40 40 58 62 38 76 85 87 99 421 354 207 367 0 0 0 0 0 0 0 0 54 88 285 375 493 608 136 67 71 82 87 87 121 135 137 148 658 532 601 799 136 67 71 82 87 87 121 135 165 194 807 727 67％ 80％ 22％ 11％ 13％ 10％ 10％ 20％ 19％ 21％ 21％ 20％ 98％ 73％ 53％ 66％ 13％ 6％ 6％ 9％ 10％ 6％ 12％ 13％ 14％ 16％ 67％ 56％ 47％ 84％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 12％ 20％ 65％ 86％ 39％ 55％ ND 19％ 14％ 19％ 23％ 15％ 6％ 3％ 3％ 28％ 37％ 52％
实施例1-5的结果表明，乳和发酵乳与来自曲霉、特别是米曲 霉的酶混合物一起保温，得到高水平的IPP、LPP和VPP。
在实施例1-5中，发现对β-酪蛋白的LPP摩尔收率大于20％。
实施例1、2、4和5都显示出高水平的IPP、VPP和LPP，并且 因此测定出高相应IPPeq值和BPPeq值。在这些实施例中，所述酶 来源于米曲霉。
实施例2显示，可以通过将复原奶与鲜味强化酶(Amano)一起保 温，得到高水平的IPP、LPP和VPP。另外，在实施例2中，发现VPP 和LPP的高摩尔收率分别为80％和84％。
在实施例4中，在发酵乳与真菌蛋白酶浓缩物(Genencor)一起保 温后，所有存在于β-酪蛋白中的VPP几乎完全释放出来，表现出98％ 的摩尔收率。
实施例1、2、4和5中总蛋白水解的高数值符合37-55％的乳蛋 白的高水解度。
在实施例1-5中，发现非常低的IPPL或者不存在。在保温期间， 所形成的大多数IPPL都转化成IPP。
比较实施例B-H显示，在与蛋白酶和肽酶混合物一起保温后， 与发酵乳底物中存在的浓度相比，生物活性肽IPP和VPP的浓度降 低(实施例A)。在比较实施例B-H中，显示没有LPP的形成。
实施例6和7：乳饮品和发酵乳饮品的制备
按照实施例1和4所获得的水解酪蛋白产物用于制备乳饮品和 发酵乳饮品。
乳饮品在巴氏消毒的脱脂奶中含有12.5％重量水解酪蛋白产物 和以下配料：4.5％重量蔗糖(CSM，荷兰)、1％重量果糖糖浆(Sensus，荷 兰)、2％重量杂果果浆(Multifruit Fruitpulp)(Wild，荷兰)、0.1％重量 酸奶香料ZD-49492(Quest，荷兰)、0.03％重量水果香料037-00330-11 (Givaudan，瑞士)、0.1％重量奶油香料U33162(Danisco，丹麦)和0.8％ 重量Genu Pectine YM-115-H(CPKelco，丹麦)。
当配料混合后，乳饮品以150bar匀浆，然后在75℃巴氏消毒15 秒。
乳饮品的口味良好。没有尝到苦味。
实施例8：含水解酪蛋白固体的酸奶饮品的制备
如下所述，制备水解酪蛋白固体：
在反应罐中加入10％重量酪蛋白酸钙(DMV，荷兰)，在85℃巴 氏消毒20分钟，冷却至50℃，在厌氧条件下，与0.5％重量鲜味强 化酶(Amano)一起在50℃保温6小时。
保温后，用80％重量乳酸(Purac，荷兰)，将水解产物的pH从pH 6.2调到pH4，然后通过将水解产物在95℃加热20分钟，灭活剩余 的酶。冻干前，将水解产物贮藏于-20℃。
冻干后，如上所述，通过HPLC-MRM-MS，分析三肽VPP、IPP 和LPP的含量。水解酪蛋白固体含有：1677.2μg/g VPP；2664.6μg/g IPP和2019.5μg/g LPP(6次测定的平均值)。
酸奶饮品含有60％重量低脂酸奶(Melkan，荷兰)；9％重量蔗糖 (CSM，荷兰)；0.35％重量AMD 783果胶(Danisco，丹麦)；1.23％重 量水解酪蛋白固体；0.025％重量树莓502824A(Firmenich，瑞士)和 29.4％重量去离子水。
当所有配料在酸奶中混合后，将酸奶饮品以150bar匀浆并在75 ℃巴氏消毒15秒。
酸奶饮品中最终VPP、IPP和LPP含量分别为66μM、100μM 和76μM。含有1.23％重量水解酪蛋白固体的酸奶饮品的口味良好， 没有尝到苦味。
实施例9-12：用不同水平的酪蛋白和脱脂奶粉制备水解酪蛋白和复原奶
通过将酪蛋白底物在含合适水平的酪蛋白酸钙(DMV，荷兰)的自 来水中混合，制备3.2％重量；6％重量和10％重量酪蛋白底物。通过 在18％重量脱脂奶粉(Coberco，荷兰)中加入自来水并混合，制备高脱 脂奶(18％SMP)底物。所有底物、18％SMP和酪蛋白底物都在50℃ 保温6小时。在保温前，调节pH到pH7.0。所有底物都与鲜味强化 酶(Amano)一起保温，酶混合物与酪蛋白的比值为5％重量。
表3.在实施例9-12中使用鲜味强化酶用不同水平的酪蛋白和脱脂奶 粉所进行的保温实验结果 实施例 底物 VPP 浓度 (μM) IPP 浓度 (μM) LPP 浓度 (μM) IPPeq (μM) BPPeq (μM) β-酪蛋 白的 VPP摩 尔收率 β-酪蛋白 和κ-酪蛋 白的IPP 摩尔收率 β-酪蛋白 的LPP 摩尔收率 水解度 为DH 9 10 11 12 3.2％ 酪蛋白 6.0％ 酪蛋白 10.0％ 酪蛋白 18％SMP 294 473 703 541 417 732 1000 628 343 566 794 522 580 995 1391 929 758 1289 1804 1201 67％ 58％ 51％ 62％ 66％ 62％ 51％ 50％ 78％ 69％ 58％ 60％ 59％ 55％ 57％ 46％
实施例9、10和11的结果清楚地表明，增加量的酪蛋白底物导 致产生更高水平的生物活性肽VPP、IPP和LPP，并且导致非常高的 相应的IPPeq值和BPPeq值。随着酪蛋白底物水平的增加，酪蛋白 中VPP、IPP和LPP的摩尔收率下降，尽管在最高水平的酪蛋白底 物(10％重量)的所得摩尔收率仍然超过50％。
实施例13-15和比较实施例J：用不同的酶/底物比值制备水解酪蛋白
在这些保温中使用的底物含有10％重量酪蛋白，并且通过将合 适水平的酪蛋白酸钙(DMV，荷兰)在自来水中混合来制备。在50℃ 保温6小时，在保温之前，不调节pH。用鲜味强化酶(Amano)酶混 合物进行所有保温过程，所用的酶混合物与酪蛋白的比值为1％重量； 2.5％重量；4％重量和5％重量。
表4：在实施例13-15和比较实施例J中用不同的酶/底物比值所进行 的保温实验结果 实 施 例 酶/底物 的比值 VPP 浓度 (μM) IPP 浓度 (μM) LPP 浓度 (μM) IPPeq (μM) BPPeq (μM) β-酪蛋白 的VPP 摩尔收率 β-酪蛋白和κ- 酪蛋白的IPP 摩尔收率 β-酪蛋白中 LPP的摩 尔收率 水解度 为 DH J 13 14 15 1.0％ 2.5％ 4.0％ 5.0％ 84 398 727 986 166 730 1005 983 72 543 810 814 213 951 1409 1531 250 1234 1831 1955 6％ 29％ 53％ 72％ 8％ 37％ 51％ 50％ 5％ 40％ 59％ 59％ 29％ 42％ 47％ 52％
实施例13-15和比较实施例J的结果表明，需要酶与底物比值超 过1％，才能在酪蛋白底物上得到高收率的VPP、IPP和LPP。
也得到了非常高水平的VPP、IPP和LPP。在实施例15中，得 到了最高水平的VPP、IPP和LPP，相当于IPPeq值为1531μM，BPPeq 值为1955μM。
比较实施例K：用风味蛋白酶制备水解酪蛋白
按照实施例15(只是在这次使用不同的酶混合物)，使用酶与底 物比值为5％(以酪蛋白计算)，来进行比较实施例K。用风味蛋白酶 (Novozymes)来替代鲜味强化酶(Amano)，与10％酪蛋白溶液一起保 温。保温后，测定生物活性肽VPP和水解度。风味蛋白酶酶混合物 的一些特征见表1。
表5.用风味蛋白酶与10％酪蛋白所进行的保温实验结果 实施例 底物 酶/底物 比值 VPP浓度 (μM) β-酪蛋白的 VPP摩尔收率 水解度 DH K 10％酪蛋白 5％ 16 1％ 45％
结果表明，除了高蛋白水解活性外，需要相对高的X-脯氨酰二 肽基氨肽酶活性，才能得到高水平的活性三肽VPP。