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1、10申请公布号CN104130977A43申请公布日20141105CN104130977A21申请号201410381401622申请日20140805C12N5/10200601C12Q1/0220060171申请人中国科学院昆明动物研究所地址650223云南省昆明市五华区教场东路32号72发明人赵旭东杨东代智王路74专利代理机构昆明今威专利商标代理有限公司53115代理人杨宏珍54发明名称一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用57摘要一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程技术领域。抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有ABCD结构的DN。
2、A构建物，其中A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因PURO序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是包括NESTIN基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、及荧光素酶报告基因LUCIFERASE。该抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选细胞毒性和诱导分化的物质。有益效果在于1、避免了传统的细胞转基因方法的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。2、获得抗肿瘤干细胞的化合物。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页10申请公布号CN104。
3、130977ACN104130977A1/1页21一种抗肿瘤药物筛选细胞模型，其特征在于该抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有ABCD结构的DNA构建物，其中A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因PURO序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因包括NESTIN基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、或者荧光素酶报告基因LUCIFERASE。2权利要求1所述的抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选抗肿瘤干细胞的细胞毒性和诱导分化的物质。权利要求书CN104130977A1/6页3一。
4、种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用技术领域0001本发明涉及一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程技术领域。背景技术0002癌症干细胞具有与组织干细胞类似的分子标记、自我更新和分化功能，在移植后能重现原癌症的组织学、分子生物学等特征，耐常规放疗和化疗，是癌症发生、复发和转移的主要原因，因此癌症干细胞正成为癌症研究的重要领域和癌症治疗的主要靶标。但目前的抗肿瘤药物主要用癌症细胞系筛选获得，缺乏针对肿瘤干细胞的药物，也缺乏良好的基于肿瘤干细胞的药物筛选模型。0003胶质母细胞瘤是最常见的脑肿瘤，恶性程度极高。随着癌症研究的进展，大部分癌症的治愈率和生存期都获得了明显改善，但胶质母细胞瘤病人。
5、的生存期在过去几十年中没有显著改观，平均仅约1年，迫切需要研发新的治疗药物。胶质母细胞瘤干细胞是最早确定的实体瘤干细胞之一，也是为数不多的在体外能稳定长期培养的肿瘤干细胞之一，为利用胶质母细胞瘤干细胞进行药物筛选奠定了基础。0004药物筛选模型是寻找和发现新药物的重要条件之一。目前抗肿瘤药物的筛选方法主要在包括体内和体外筛选方法，体内筛选方法成本高，操作难度大，不利于高通量的药物筛选；体外筛选方法主要是在分子和细胞水平上实现的，具有材料用量少，作用机制明确，易用于大规模筛选等优点，是药物筛选的主要方法。0005药物筛选细胞模型常用报告基因随机插入建立稳定细胞株，控制外源标记基因表达的启动子活性。
6、常受到整合位点附件基因组DNA的影响，因此标记基因的变化并不能完全反映内源基因的变化，影响药效的评价。0006综上所述，有必要建立良好的基于胶质母细胞瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选模型。发明内容0007本发明针对现有抗肿瘤药物筛选技术存在的不足，提供一种简便、快速、直接、经济的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其建立方法和应用。0008本发明的抗肿瘤药物的细胞模型，是从胶质母细胞瘤中分离的，定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有ABCD结构的DNA构建物，其中0009A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因PURO序列；0010胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是。
7、但不限于NESTIN基因；报告基因为但不限于绿色荧光蛋白基因EGFP，或YFP、RFP荧光蛋白，或荧光素酶LUCIFERASE。0011本发明的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，运用同源重组技术，将报告基因绿色荧光蛋白EGFP定点整合至肿瘤干细胞分子标记基因NESTIN启动子下游，建立药物的细胞毒性和分化诱导筛选平台。0012本发明的抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选抗肿瘤干细胞的细胞毒性和诱导分化说明书CN104130977A2/6页4的物质如小分子化合物、多肽。即0013将候选物质加入上述的培养细胞中，用高内涵设备或荧光显微镜检测药物组中报告基因的表达，并与对照组比较，所述对照组是不添加候选物质。
8、的上述细胞。如果测试组中报告基因表达细胞数低于对照组，就表明候选物质能够抑制肿瘤干细胞增殖或诱导细胞凋亡；如果单个细胞中报告基因表达水平降低则说明候选物质能够诱导肿瘤干细胞分化。0014本发明的抗肿瘤药物的细胞模型还能对筛选出的抗肿瘤干细胞物质进行进一步的细胞/动物实验，以确定这些物质在抗肿瘤药物研发中的前景。0015本发明的有益效果在于00161、避免了多拷贝转基因所致的基因组不稳定性、转基因插入会破坏内源基因、转基因所用启动子受插入位点两侧序列影响不能完全反映启动子活性变化的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。00172、具有简便、快速、直接、经济的优点。附图说明0018图1是将E。
9、GFP定点整合至NESTIN启动子下游的打靶示意图。0019图2A和图2B显示腺病毒感染肿瘤干细胞后荧光观察结果。0020图3A和图3B显示腺病毒感染肿瘤干细胞后PCR检测阳性克隆细胞。具体实施方式0021下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南SAMBROOK,J中所述的方法，或按照实验所用试剂或仪器说明书建议方法。0022一、构建物及载体0023所述构建物从5端到3端依次含有NESTIN启动子序列，报告基因序列，内部核糖体进入位点序列IRES或者自剪切2A肽序列,嘌呤霉素抗性基因序列PURO，转录终止信号序列POLYA和N。
10、ESTIN启动子下游序列。0024所述的报告基因包括绿色荧光蛋白GFP基因、红色荧光蛋白RFP基因或者荧光素酶基因LUCIFERASE。GFP作为一种标记蛋白，其内源荧光基团在受到蓝光激发时能高效发射清晰可见的绿光。所述的GFP还包括在野生型GFP基础上进行改进的蛋白，例如进行基因优化如去除隐蔽性内含子；或通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性。在本发明中，所述的GFP是增强型的绿色荧光蛋白EGFP，EGFP为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，与GFP具有很高的同源性，在表达后发光的效果更为理想。0025红色荧光蛋白RFP是从珊瑚虫中克隆的一种与绿色荧光。
11、蛋白GFP同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下会发出红色的荧光。与GFP相比，RFP具有激发和发射波长更长，细胞内成像背景更低的优点，但同时也有寡聚化、成熟缓慢的限制。所述的RFP还包括在野生型RFP基础上进行改进的蛋白，例如DSRED,MKATE2。0026所述的“荧光素酶报告基因”系统是以荧光素LUCIFERIN为底物来检测萤火虫荧光素酶REFLYLUCIFERASE活性的一种报告系统。它具有以下优点1内源性低，哺乳说明书CN104130977A3/6页5动物无内源性的荧光素酶表达；2灵敏度高，荧光素酶介导的化学发光反应效率高，发光强，易于检测；3检测范围广，幅度跨越大于107；4经济实惠，并。
12、且重复性好。0027所述的内部核糖体进入位点IRES是一段核酸序列，当这段核酸序列被翻译为RNA时，能折叠成类似于起始TRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始下游蛋白质序列的翻译。在本构建物中IRES位于绿色荧光蛋白序列和嘌呤霉素抗性基因序列之间，绿色荧光蛋白靠5帽子结构起始翻译，而嘌呤霉素则依靠IRES起始翻译。因此嘌呤霉素和EGFP的表达受同一启动子驱动。0028所述的自剪切2A肽源于口蹄疫病毒，是近年使用较多的一种构建多基因载体的工具。研究指出,通过串联方式将2A肽和基因置于同一个开放读码框中能够实现在同一启动子的调控下表达多个基因。0029所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通。
13、常存在于目的基因编码序列的上游，能够引导核酸序列转录为MRNA本发明所述的NESTIN启动子序列为肿瘤干细胞/神经干细胞内特异性启动子，因此由其驱动表达的EGFP及其PURO仅在肿瘤干细胞/神经干细胞内表达。0030所述的“转录终止信号序列”是指在结构基因DNA分子中用于终止转录作用的元件，又称终止子；终止子有一段GC富集区，随后又有一段AT富集区。在GC富集区内有一段反向重复序列，以致转录作用生成的MRNA在其相应序列中有互补形成的发卡结构。0031作为本发明的优选方式，所述的报告基因是EGFP，在不裂解细胞的情况下，能通过显微镜直接观察到细胞内EGFP的表达情况，从而判断细胞存活、生长的变。
14、化以及细胞分化情况。0032作为本发明的特别优选的方式，所述的构建物中，在报告基因的下游，还包括嘌呤霉素抗性基因PURO序列。当外源基因进入细胞后，发生同源重组的概率非常小，故常常运用抗生素选择标记来筛选整合了目的基因而带有抗性的细胞。PURO是药物筛选中运用非常广泛的抗生素之一，它对于上下游元件的影响小，能良好地用于细胞株的筛选和鉴定。0033在所述的构建物中，各元件之间以可操作的方式进行连接，各种功能性的操作性连接方式是生物领域常见的，为大众所熟知的。通常，各元件之间具有01000BP的间隔序列。0034本发明还提供了一种载体，所述的载体含有前面所述的构建物。所述的载体之一是腺病毒载体。作。
15、为本发明的优选方式，所述的腺病毒载体是PADBLOCK系列载体，更优选为PADBLOCKITDEST载体。在含有所述构建物的PADBLOCKITDEST载体包装为腺病毒后，对肿瘤干细胞感染率非常高，达100。0035所述的载体中还包含有一些对于EGFP表达以及对肿瘤干细胞生长没有负面左右的其他元件。0036二、细胞模型及用途0037所述细胞为体外培养细胞为哺乳类细胞，其为从人胶质瘤中分离肿瘤干细胞；并且所述细胞基因组内定点整合了前面所述的构建物。所述的细胞内的报告基因的表达受NESTIN启动子驱动，当抗肿瘤药物处理所述细胞后，报告基因的表达情况直接反映细胞存活、生长的变化以及细胞分化情况。00。
16、38作为本发明的优选方式，所述的细胞为人胶质瘤肿瘤干细胞。NESTIN蛋白能在人说明书CN104130977A4/6页6胶质瘤干细胞内特异性表达,因此受NESTIN启动子驱动的报告基因也在人胶质瘤干细胞内特异性表达。0039所述的细胞带有抗生素抗性，所述的抗生素抗性为嘌呤霉素PURO抗性，能良好地用于同源重组阳性细胞的筛选和鉴定。0040本发明的细胞作为细胞模型，用于筛选对肿瘤干细胞有毒性的药物，也用于筛选能引起肿瘤干细胞分化的药物。所述的药物包括天然药物、人工合成药物以及其他用于肿瘤治疗的纯净物和混合物。0041本发明的构建报告基因细胞模型经由下步骤得到；00421将报告基因序列连接到PEN。
17、TRU6载体上，获得包含报告基因序列的LR重组入门载体；00432将IRES序列或者2A肽序列连接到1获得的载体上，IRES或者2A肽序列位于报告基因终止密码子之后；00443将嘌呤霉素抗性基因PURO连接到2获得的载体上，PURO基因序列位于IRES或者2A肽序列序列下游，与报告基因一同受NESTIN启动子驱动，用于同源重组阳性细胞的筛选；00454将NESTIN启动子序列连接到3获得的载体上，NESTIN启动子序列位于报告基因上游，作为同源重组时的所需的5同源臂；00465将NESTIN启动子下游序列连接到4获得的载体上，NESTIN启动子下游序列位于PURO基因下游，作为同源重组时所需的。
18、3同源臂；00476将5得到的GATEWAY入门载体与腺病毒基因组载体PADBLOCKITDEST进行GATEWAY克隆的LR反应，获得包含所述构建物的PADBLOCKITDEST腺病毒载体；00487设计针对NESTIN第一外显子的转录激活因子样效应物核酸酶TALEN，验证其效率之后，克隆至GATEWAY入门载体PENTRU6中；00498将7所获得的GATEWAY入门载体与腺病毒基因组载体PADBLOCKITDEST进行GATEWAY克隆的LR反应，获得包含TALEN的PADBLOCKITDEST腺病毒载体；00509将6和8获得的腺病毒载体线性化后分别转染293A细胞，包装腺病毒；005。
19、110将9获得的腺病毒共同感染人胶质瘤肿瘤干细胞，培养感染后的细胞，PURO筛选3周后，在显微镜下挑取带报告基因的单克隆，培养成细胞系。0052筛选方法用途0053本发明所述的细胞为人肿瘤干细胞，筛选针对肿瘤干细胞的药物，药效是细胞毒性活性或者诱导细胞分化。0054本发明提供了一种基于肿瘤干细胞的药物毒性筛选模型。具体方法为将待筛选的药物加入到所述细胞模型中，同时设置未加药物的细胞模型为对照。用高内涵设备或荧光显微镜的设备检测报告基因表达情况。检测测试组中报告基因的表达，并与对照组比较；若该药物具有细胞毒性，则会引起细胞死亡、细胞增殖减少，报告基因阳性细胞数将减少。0055同时，本发明还提供了。
20、一种基于肿瘤干细胞的药物分化筛选模型。具体实施方法为将待筛选的药物加入到所述细胞模型中，同时设置未加药物的细胞模型为对照。用高内涵设备或荧光显微镜的设备检测报告基因表达情况。若测试药物诱导肿瘤干细胞分化，则单个细胞的报告基因表达强度会减弱。说明书CN104130977A5/6页70056实施例1含报告基因腺病毒载体的构建00571以PRLCMV质粒为模版，用PCR扩增得到POLYA元件片段，并在引物两端添加限制性内切酶NHEI，SALI位点。用限制性内切酶XBAI和SALI酶切GATEWAY入门载体PENTRU6，纯化回收后与PCR扩增的POLYA片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5A，12H。
21、后挑取菌落，抽提质粒，并进行酶切鉴定。经鉴定连接成功的质粒记为PENTRPOLYA0058POLYA引物序列0059SEQ10060ACGTGTCGACAGTTCTAGATCAAGATCTATAGCGGCCGCTTCGAGCAGA0061SEQ20062TGTCATGCTAGCACTACTAGTATCGGATCCTTATCGATTTTAC00632以以肿瘤干细胞基因组为模版，用PCR方法扩增NESTIN启动子下游序列，得到同源重组所需的下游同源臂3ARM，并在引物两侧添加限制性内切酶酶切位点BAMHI和SPEI。用限制性内切酶BAMHI和SPEI双酶切PENTRPOLYA载体，纯化回收后与PC。
22、R扩增的NESTIN3ARM片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5A，12H后挑取菌落，抽提质粒，并进行酶切鉴定。经鉴定连接成功的质粒记为PENTRPOLYA3ARM0064NESTIN3ARM片段引物序列0065SEQ3ATCTGGATCCGACGAGCAGGATGGAGGGCT0066SEQ4ATCTACTAGTGCAGAGTTGCCATCACCTACACC00673以QRICH2SHCTR载体为模版，用PCR方法扩增得到EGFP2APURO片段，并在引物两侧添加限制性内切酶酶切位点XBAI和NOTI。以肿瘤干细胞基因组为模版，用PCR方法扩增NESTIN启动子序列，得到同源重组所需的上游同。
23、源臂5ARM，并在引物两侧添加限制性内切酶酶切位点SALI和NHEI。用限制性内切酶SALI和NOTI双酶切ENTRPOLYA3ARM载体，纯化回收后与PCR扩增的NESTIN5ARM和EGFP2APURO三片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5A，12H后挑取菌落，抽提质粒，并进行酶切鉴定。经鉴定连接成功的质粒记为PENTRNESEGFPPURO质粒示意图见图100684将构建的入门载体PENTRNESEGFPPURO与腺病毒载体PADBLOCKITDEST进行GATEWAY的LR反应，得到含所述构建物的腺病毒载体PAD/BLOCKITDESTNESEGFPPURO0069NESTIN5ARM。
24、片段引物序列0070SEQ5TGACGTCGACACCTGAAGTCAGGAGTTCAAACC0071SEQ6TCTAGCTAGCTGACCCACTGAGGATGGACA0072EGFP2APURO片段引物序列0073SEQ7GCTATCTAGAGGTTTAGTGAACCGTCAGG0074SEQ8GTAAGCGGCCGCTCCGGAACGCGTTCAGGCA0075实施例2含所述构建物的腺病毒包装00761用PACI单酶切腺病毒载体PAD/BLOCKITDESTNESEGFPPURO，线性化载体，通过酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，回收线性化片段00772培养293A细胞于35CM平板，待细胞汇合度。
25、生长至80，转染线性化质粒PAD/BLOCKITDESTNESEGFPPURO。所用试剂为LIPOFECTAMINE2000INVITROGEN说明书CN104130977A6/6页800783转染1015D后，待出现大面积噬菌斑时，收集上清和细胞；在37度水浴和80反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒颗粒。00794将收集的病毒颗粒再次感染293A细胞，扩增腺病毒00805感染7D后，再次收集上清和细胞，如步骤3的方法裂解。00816用BIOMIGA腺病毒纯化试剂盒ADENOVIRUSPURICATIONMINIPREPKIT纯化浓缩步骤5所收集病毒。00827提取病毒基因组，REALTIM。
26、EPCR检测腺病毒滴度0083鉴定病毒所用引物0084SEQ9GCCATTACCTTTGACTCTTCTGT0085SEQ10CCTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAGTATC0086实施例3利用腺病毒建立筛药细胞系0087设计针对NESTIN第一外显子的TALEN，并将TALEN序列克隆至腺病毒载体PADBLOCKITDEST中，然后如实施例2所述方法，将这两个载体包装为腺病毒，记为PADBLOCKNESTALENL和PADBLOCKNESTALENR。0088PADBLOCKNESTALENL、PADBLOCKNESTALENR和PAD/BLOCKITDESTNESEGFPPURO三。
27、个腺病毒按照111混合后，感染从人胶质瘤中分离的肿瘤干细胞株。4天后见绿色荧光表达图2A和图2B。利用有限稀释法分离单细胞，并加入1UG/ML的嘌呤霉素PURO筛选。培养20天后提取细胞基因组，利用跨同源臂的引物PCR鉴定阳性克隆图3A和图3B。将鉴定的阳性克隆细胞扩大培养并冻存。0089跨5同源臂鉴定引物序列0090SEQ13CCACCCTACCTCTTTAGGGGA0091SEQ14CTGCGGACCAGTTATCATCCG0092跨3同源臂鉴定引物序列0093SEQ15AGAAGAACGGCATCAAGGTGA0094SEQ16TCCTTGGTCTCAGCCATTTCTA。说明书CN104130977A1/2页9图1图2A图2B说明书附图CN104130977A2/2页10图3A图3B说明书附图CN104130977A10。