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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810569885.5 (22)申请日 2018.06.05 (71)申请人 田月秋 地址 200090 上海市杨浦区沈阳路41弄1号 304室 (72)发明人 田月秋 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王毓理 王锡麟 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 人-防御素1的应用 (57)摘要 一种人-防御素1的应用， 将HBD1用于制备 调节新生儿免疫应答成熟的调节。
2、物。 以促进CM- CSF和IL-4诱导的新生儿脐带血单核细胞 (Monocyte,Mo)向未成熟树突状细胞(Dendritic cell,DC)的分化， 并能够促进LPS诱导的脐带血 单核细胞来源的未成熟DC的成熟， 以及抑制脐带 血单核细胞来源的DC的凋亡， 促进脐带血来源 CD4+T细胞的增殖和活化， 以及促进脐带血来源 CD19+B细胞的活化。 权利要求书1页 说明书3页 附图6页 CN 108704120 A 2018.10.26 CN 108704120 A 1.一种人 -防御素1的应用， 其特征在于， 将HBD1用于制备调节新生儿免疫应答成熟的 调节物。 2.根据权利要求1所述的。
3、应用， 其特征是， 所述的调节物中HBD1的有效浓度为5ng/mL 1000ng/mL。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征是， 所述的HBD1的有效浓度为50ng/mL。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征是， 所述的治疗新生儿免疫应答成熟， 包括： 促进 CM-CSF和IL-4诱导的新生儿脐带血单核细胞向未成熟树突状细胞的分化、 促进LPS诱导的 脐带血单核细胞来源的未成熟DC的成熟、 抑制脐带血单核细胞来源的DC的凋亡、 促进脐带 血来源CD4+T细胞的增殖和活化和促进脐带血来源CD19+B细胞的活化。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征是， 所述的促进CM-CSF和IL。
4、-4诱导的新生儿脐带 血单核细胞向未成熟树突状细胞的分化， 包括： 上调共刺激分子(CD40,CD80,CD86)和MHCII的表达， 下调甘露糖受体(MR)的表达； 抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的非特异性吞噬和特异性吞噬作用； 经HBD1处理后的脐带血单核细胞来源的未成熟DC能够提高异体淋巴细胞细胞增殖 反应。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征是， 所述的促进LPS诱导的脐带血单核细胞来源 的未成熟DC的成熟， 包括： 上调CD83、 共刺激分子(CD40,CD80,CD86)和MHCII的表达； 经HBD1处理后的脐带血单核细胞来源的成熟DC能够提高异体淋巴细胞细胞增殖反 应。。
5、 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征是， 所述的抑制脐带血单核细胞来源的DC的凋 亡， 包括： 抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的早期凋亡； 抑制LPS诱导的脐带血单核细胞来源的成熟DC的早期凋亡和晚期凋亡。 8.根据权利要求4所述的应用， 其特征是， 所述的促进脐带血来源CD4+T细胞的增殖和 活化， 包括： 单独及协同PHA促进CD4+T细胞的增殖； 单独及协同促进CD4+T细胞表面CD25,CD69和CD40L的表达， 促进CD4细胞的活化。 9.根据权利要求4所述的应用， 其特征是， 所述的促进脐带血来源CD19+B细胞的活化， 包括： 单独及协同促进CD19+B细胞表面CD80。
6、和CD86的表达。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108704120 A 2 人 -防御素1的应用 技术领域 0001 本发明涉及的是一种生物医药和营养保健领域的技术， 具体是一种人 -防御素1 (Human -defensin 1， HBD1)在提高婴儿免疫力方面的应用。 背景技术 0002 新生儿被报道更容易发生感染， 这与其未发育成熟的免疫系统相关。 许多研究都 已证明新生儿的免疫系统(包括固有免疫和适应性免疫)与成人的有许多不同之处。 研究发 现， 母乳喂养可降低婴儿感染和过敏的发生。 人类母乳中含有许多免疫活性物质， 包括抗菌 物质、 免疫细胞和免疫调节物质等。 HBD1。
7、是一种存在于人母乳中的多肽类物质， 高浓度的 HBD1可降低6个月内婴儿上呼吸道感染的发生率， 说明HBD1能够保护婴儿免于感染。 发明内容 0003 本发明针对现有技术都是针对于HBD1对于成人免疫细胞的免疫调节作用， 提出一 种人 -防御素1的应用， 将HBD1用于制备促进婴儿免疫力的调节物， 以促进CM-CSF和IL-4诱 导的新生儿脐带血单核细胞(Monocyte,Mo)向未成熟树突状细胞(Dendritic cell,DC)的 分化， 并能够促进LPS诱导的脐带血单核细胞来源的未成熟DC的成熟， 以及抑制脐带血单核 细胞来源的DC的凋亡。 0004 本发明是通过以下技术方案实现的： 。
8、0005 本发明涉及一种人 -防御素1的应用， 将HBD1用于制备调节新生儿免疫应答的调 节物。 0006 所述的调节物优选为液态形式。 0007 所述的应用， 进一步包含HBD1在所述调节物中的有效浓度。 0008 所述的有效浓度为5ng/mL1000ng/mL， 优选为50ng/mL。 0009 所述的调节新生儿免疫应答， 包括： 促进CM-CSF和IL-4诱导的新生儿脐带血单核 细胞(Monocyte,Mo)向未成熟树突状细胞(Dendritic cell,DC)的分化、 促进LPS诱导的脐 带血单核细胞来源的未成熟DC的成熟、 抑制脐带血单核细胞来源的DC的凋亡。 0010 所述的促进。
9、CM-CSF和IL-4诱导的新生儿脐带血单核细胞(Monocyte,Mo)向未成熟 树突状细胞(Dendritic cell,DC)的分化， 包括： 0011 上调共刺激分子(CD40,CD80,CD86)， MHCII的表达， 下调甘露糖受体(MR)的表 达； 0012 抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的非特异性吞噬和特异性吞噬作用； 0013 经HBD1处理后的脐带血单核细胞来源的未成熟DC能够提高异体淋巴细胞增殖 反应。 0014 所述的促进LPS诱导的脐带血单核细胞来源的未成熟DC的成熟， 包括： 0015 上调CD83， 共刺激分子(CD40,CD80,CD86)， MHCII的表。
10、达； 0016 经HBD1处理后的脐带血单核细胞来源的成熟DC能够提高异体淋巴细胞细胞增 说 明 书 1/3 页 3 CN 108704120 A 3 殖反应。 0017 所述的抑制脐带血单核细胞来源的DC的凋亡， 包括： 0018 抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的早期凋亡； 0019 抑制LPS诱导的脐带血单核细胞来源的成熟DC的早期凋亡和晚期凋亡。 附图说明 0020 图1为实施例中流式细胞术检测细胞表面抗原的表达情况示意图； 0021 图2为实施例中流式细胞术法检测细胞的非特异性和特异性吞噬情况示意图； 0022 图3为CFSE染色-流式细胞术法检测异体CD4+T淋巴细胞的增殖情况示。
11、意图； 0023 图中： A为流式示意图， 未成熟树突状细胞与异体脐带血单个核细胞的比例为1: 10； B为统计图； 0024 图4为实施例中经LPS诱导后流式细胞术检测细胞表面抗原的表达情况示意图； 0025 图5为CFSE染色-流式细胞术法检测经/不经LPS诱导的DC刺激异体CD4+T淋巴细胞 的增殖情况； 0026 图中： A为流式示意图， 成熟的树突状细胞与异体脐带血单个核细胞的比例为1: 10； B为统计图； 0027 图6为Elisa法测定对照组及HBD1处理过的mDC的细胞因子的分泌情况示意图； 0028 图7A为HBD1处理能够抑制脐带血单核细胞来源的imDC的早期凋亡情况示意。
12、图； 图 7B为HBD1处理能够抑制LPS诱导的脐带血单核细胞来源的mDC的早期凋亡和晚期凋亡情况 示意图。 具体实施方式 实施例1 0029 本实施例涉及一种基于HBD1制备得到的婴儿配方调节物在促进CM-CSF和IL-4诱 导的新生儿脐带血单核细胞向未成熟树突状细胞的分化方面的应用。 0030 如图1所示， 利用GM-CSF和IL-4在体外条件下诱导人新生儿脐带血来源的单核细 胞向未成熟树突状细胞分化的过程中， 不加HBD1的设置为对照组(CTR)， 加入HBD1(50ng/ mL)共培养可上调共刺激分子(CD40,CD80,CD86)， MHCII的表达， 下调甘露糖受体(MR)的表 达。
13、， 每组6个样本， 结果用平均荧光强度标准误表示。 0031 如图2所示， 通过上述培养得到CTR组和HBD1组中的未成熟树突状细胞， 分别与乳 胶微球(Latex Beads)以及FITC-葡聚糖(FITC-Dextran)来共培养0,60,120分钟后， 以分别 评估树突状细胞的非特异性吞噬(胞饮)以及特异性吞噬(甘露糖受体(MR)受体介导的吞 噬)能力。 结果发现， HBD1能够抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的非特异性吞噬和特异 性吞噬作用。 0032 如图3所示， 通过上述培养得到CTR组和HBD1组中的未成熟树突状细胞， 分别与异 体淋巴细胞共培养做混合淋巴细胞培养实验(Mix 。
14、lymphocyte reaction， MLR)， 通过CFSE 染色-流式细胞术法检测异体CD4+T淋巴细胞的增殖情况， 检测两组未成熟树突状细胞刺激 异体T淋巴细胞增殖的能力， 结果用发生增殖的CD4+T细胞的百分比标准误表示。 0033 结果表明， HBD1培养的脐带血单核细胞来源的未成熟DC能够更好的促进异体淋巴 说 明 书 2/3 页 4 CN 108704120 A 4 细胞细胞增殖反应。 实施例2 0034 本实施例涉及一种基于HBD1制备得到的婴儿配方调节物在体外条件下促进LPS诱 导的脐带血单核细胞来源的未成熟DC的成熟方面的应用。 0035 本实施例通过LPS进一步诱导未。
15、成熟的树突状细胞的成熟， 成熟的树突状细胞细 胞表面抗原CD83,共刺激分子(CD40,CD80,CD86)， MHCII的表达升高； 但丧失其吞噬能力。 此 外， 成熟的树突状细胞刺激异体T淋巴细胞增殖的能力增强。 0036 如图4所示， 本实施例通过上述培养得到单核细胞来源的未成熟树突状细胞， 加入 LPS诱导树突状细胞的成熟。 在诱导成熟的同时加入HBD1设置为实验组HBD1， 未加入HBD1设 置为对照组。 0037 结果表明， HBD1可协同LPS促进树突状细胞的成熟， 上调CD83,共刺激分子(CD40, CD80,CD86)和MHCII的表达。 0038 如图5所示， 通过上述培。
16、养得到CTR组和HBD1组中的成熟树突状细胞， 分别按照1： 1000,1:100,1:10的比例， 与来自异体的去掉单核细胞的脐带血单个核细胞(5105/孔)共 培养做混合淋巴细胞培养实验， 通过CFSE染色-流式细胞术法检测异体CD4+T淋巴细胞的增 殖情况， 检测两组成熟树突状细胞刺激异体T淋巴细胞增殖的能力， 每组样本数量为8个， 结 果用发生增殖的CD4+T细胞的百分比标准误表示。 0039 结果表明， HBD1处理过的脐带血单核细胞来源的成熟DC能够更好的促进异体淋巴 细胞细胞增殖反应。 0040 如图6所示， Elisa法测定对照组及HBD1处理过的mDC的细胞因子的分泌情况。 。
17、结果 表明， 与对照组相比， HBD1处理组TNFa,IL-6 and IL-10的分泌都没有明显差别。 说明HBD1 不能影响LPS诱导的脐带血单核细胞来源的成熟DC分泌上述细胞因子。 实施例3 0041 本实施例涉及一种基于HBD1制备得到的婴儿配方调节物在抑制脐带血单核细胞 来源的DC的凋亡方面的应用。 0042 所述的婴儿配方调节物中的有效成分HBD1的含量为50ng/mL。 0043 如图7所示， HBD1处理能够抑制脐带血单核细胞来源的未成熟DC的早期凋亡； HBD1处理能够抑制LPS诱导的脐带血单核细胞来源的成熟DC的早期凋亡和晚期凋 亡。 0044 上述具体实施可由本领域技术人。
18、员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同 的方式对其进行局部调整， 本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所 限， 在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。 说 明 书 3/3 页 5 CN 108704120 A 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/6 页 6 CN 108704120 A 6 图3 说 明 书 附 图 2/6 页 7 CN 108704120 A 7 图4 说 明 书 附 图 3/6 页 8 CN 108704120 A 8 图5 说 明 书 附 图 4/6 页 9 CN 108704120 A 9 图6 说 明 书 附 图 5/6 页 10 CN 108704120 A 10 图7 说 明 书 附 图 6/6 页 11 CN 108704120 A 11 。