技术领域
本发明涉及高纯度卵清白蛋白的生产方法，具体涉及卵清蛋白的的生物发酵、卵清蛋白的多孔膜分离、纯化、浓缩和冷冻干燥的生产方法。
背景技术
白蛋白，亦称清蛋白，广泛存在于人体的血液、淋巴、肌肉中、血浆白蛋白是血浆中含量最多，功能最为重要的一种蛋白质。血浆白蛋白的主要生理作用如下：（1）维持血浆胶体渗透压的恒、（2）血浆白蛋白的运输功能、（3）血浆白蛋白的其它生理作用。
许多急慢性疾病都可引起血浆白蛋白浓度降低，严重者可导致发生水肿，血容量减少，血浆蛋白运输功能下降等。在治疗上，除了对病症本身给予有效的药物治疗外，还须顾及血浆白蛋白浓度降低的纠正。
以往，纠正的惟一办法是静脉输入正常人体血浆制品或人体血浆白蛋白，虽也能迅速改善低白蛋白血症，但存在许多不利因素：①人体血浆制品来源奇缺，价格昂贵。②易引发并发症，其中最危险的是血源性病毒传染，如目前尚无有效治疗措施的艾滋病毒和丙型肝炎病毒传染。③外源性输注的血浆制品只是一种临时的替代品，在人体内起作用时间不长，无法激发调动人体自身血浆蛋白及组织蛋白的合成功能，所以，依靠输注外源性血浆制品纠正患者血浆白蛋白减少症只能作为一种临时性的应急措施，不是理想的、从根本上的纠正方法。④鸡蛋白蛋白（卵清蛋白）无论从分子结构到生物学功能上都与人血白蛋白非常接近或相似。鸡蛋白蛋白来源丰富，无病毒感染。因此，从鸡蛋清中生物分离和提取高纯度卵清白蛋白及其降解物卵清白蛋白多肽替代人血白蛋白将是未来生物医药行业一大潜在市场。
有关从鸡蛋清中直接分离纯化白蛋白方法国内很少有报道，国外报道很多，主要研究的是模拟鸡蛋清组分进行分离和纯化，真正用鸡蛋清进行分离和纯化的研究也不是很多，典型代表论文中都是有关于从鸡蛋清中分离提取溶菌酶和白蛋白的研究。其中，研究主要在于采用溶菌酶和牛白蛋白模拟鸡蛋清系统进行初步的研究，是提取溶菌酶和白蛋白产业化的基础研究。还有是采用阴离子琼脂糖（凝胶）交换柱的分离方法生产的溶菌酶、白蛋白的产品纯度、回收率都较高，但该技术极难规模化连续生产；另外的论文虽然也对1%的鸡蛋清进行分离，在pH4.8时透过率最高。pH4.8时是鸡蛋清中白蛋白的等电点，在此pH值下，当白蛋白浓度高于5克/升时，产品极易发生等电点沉淀，因此，该pH时不宜规模化生产。虽也有采用二步法从鸡蛋清中分离提取溶菌酶和白蛋白，该研究教系统的研究如盐浓度、pH等参数对分离过程的影响，但其结论是在pH2.5时进行分离和提取效果最好，而pH2.5时极易对蛋白质本身的结构造成伤害，从而导致其变性，同时该研究的连续可操作性、特别是产品的回收率没有研究和报道，说明了该研究局限性。再者对从鸡蛋中分离提取蛋白质虽做了大量系统的研究，比起其他上述几个研究有很多的优势，但离工业化生产还有相当大的差距，特别是在如可实现规模化生产的可持续性、提高产品回收率上没有进一步的研究。
发明内容
（一）要解决的技术问题
为了解决上述问题，本发明提出了一种卵清白蛋白的生产方法，该方法采用物理机械方法分离卵清和卵黄，在特定的浓度、温度、pH和离子浓度范围内对卵清液进行高效的生物发酵，对发酵后的卵清液采用膜分离和纯化，避免使用有毒、有害物质或有机溶剂，降低操作温度，提高产品产出率，几乎无废物排放，极大的降低操作成本，可很好的实施规模化工业生产高纯度卵清白蛋白。
（二）技术方案
一种卵清白蛋白的生产方法，该方法采用物理机械方法分离卵清和卵黄，在特定的浓度、温度、pH和离子浓度范围内对卵清液进行高效的生物发酵，对发酵后的卵清液采用膜分离和纯化，避免使用有毒、有害物质或有机溶剂，降低操作温度，提高产品产出率，几乎无废物排放，极大的降低操作成本，可很好的实施规模化工业生产高纯度卵清白蛋白；其生产方法的具体步骤如下：
（1）将鸡蛋洗净，采用人工的方法将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清原液；
（2）用去离子水配置与上述（1）中蛋清原液同等体积的100mM NaCl溶液并加入到上述（1）中的鸡蛋清原液中配制成50%的鸡蛋清液体；
(3)用去离子水配制氧化酶溶液，其浓度为10g/L,并将配好的氧化酶溶液加入到上述（2）中50%的鸡蛋清溶液中；
(4)将上述(3)中50%含氧化酶鸡蛋清原液放在烧杯中用磁棒连续搅拌5小时；在搅拌的过程中将其温度控制在370C, pH值调节7.5左右；
(5)将上述经过（1）-(4)步骤调制好的鸡蛋清料液用几层叠加的医用纱布过滤一下，除去因在搅拌的过程中可能出现的蛋白积聚物或不溶物，收集滤过液；
(6)将上述(5)中的滤过液的pH值调节到10-11之内；
(7)将上述(6)中的滤过液采用70KDa的膜进行分离、提取；当滤过液的体积接近50%时，逐渐向原料液中加入100%的100mM的NaCl水溶液，当滤过液的体积达到100%时，停止过滤；
(8)将上述(7)中原料液（截留液）的pH值调到5.4-6.0之间；将pH 值5.4-6.0的原料液（截留液）继续采用70KDa的膜进行过滤的同时，不断向原料液中加入pH5.4-6.0之间100mM NaCl溶液；
(9)将上述(8)中的原料液（截留液）继续过滤，直至最后的原料液的体积浓缩到300-400ml，收集70KDa膜所有的滤过液；300-400ml截留液另作它用；
(10)调节上述步骤(9)中最后的所有的滤过液的pH值调到10-11之内；将调节pH 值后的滤过液采用30KDa膜设备进行分离和提取；当截留液的体积剩下50%的时候缓慢地向其中加入100%的pH10-11的离子水，洗脱溶液中的NaCl，此过程中维持截留液的体积几乎不变；
(11)向上述(10)中的50%不含NaCl的截留液继续缓慢加入pH3左右的酸性离子水，直至最后的截留液的pH值控制在5.4左右；
(12)继续浓缩上述(11)中的pH5.4左右的截留液直至最后的截留液的体积在200-300ml之间；分别回收截留液和滤过液；
(13)将上述(12)中的截留液用来生产卵清蛋白，滤过液用来生产溶菌酶；截留液用冷冻干燥的方法冷冻干燥得到淡黄色白蛋白粉末。
进一步的，步骤（1）所述的蛋清和蛋黄分开的方法在规模化生产的情况下采用自动打蛋机。
进一步的，白蛋白的产率及回收率达到71%。
（三）有益效果
本发明提出的一种卵清白蛋白的生产方法，与现有技术相比较，其具有以下有益效果：1、本发明的生产方法采用生物发酵与生物分离处理相结合，避免使用有毒、有害物质或有机溶，降低了能耗，提高了产出率，同时几乎没有污染排放；2、本发明的显著特性是操作容易、运行稳定、易于规模化生产，通过对鸡蛋白蛋白产品的分子量、纯度的测定，为其主要用于医药、保健品、生物材料、医用材料等提供了理论上的依据。
附图说明
图1为本发明的整体流程示意图。
图2为本发明实例1中生产的白蛋白产品的照片。
图3为本发明实例3中白蛋白产品用电泳测定的分子量及纯度图。
图4为本发明实例3中白蛋白产品用HPLC分析检测的图。
附图4中的标记的标注：1路是纯化的1g/l溶菌酶，2路是纯化的2g/l卵清白蛋白，3路是从sigma购买的标样蛋白质。
具体实施方式
如图1所示，一种卵清白蛋白的生产方法，该方法采用物理机械方法分离卵清和卵黄，在特定的浓度、温度、pH和离子浓度范围内对卵清液进行高效的生物发酵，对发酵后的卵清液采用膜分离和纯化，避免使用有毒、有害物质或有机溶剂，降低操作温度，提高产品产出率，几乎无废物排放，极大的降低操作成本，可很好的实施规模化工业生产高纯度卵清白蛋白；其生产方法的具体步骤如下：
（1）将鸡蛋洗净，采用人工的方法将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清原液；
（2）用去离子水配置与上述（1）中蛋清原液同等体积的100mM NaCl溶液并加入到上述（1）中的鸡蛋清原液中配制成50%的鸡蛋清液体；
(3)用去离子水配制氧化酶溶液，其浓度为10g/L,并将配好的氧化酶溶液加入到上述（2）中50%的鸡蛋清溶液中；
(4)将上述(3)中50%含氧化酶鸡蛋清原液放在烧杯中用磁棒连续搅拌5小时；在搅拌的过程中将其温度控制在370C, pH值调节7.5左右；
(5)将上述经过（1）-(4)步骤调制好的鸡蛋清料液用几层叠加的医用纱布过滤一下，除去因在搅拌的过程中可能出现的蛋白积聚物或不溶物，收集滤过液；
(6)将上述(5)中的滤过液的pH值调节到10-11之间；
(7)将上述(6)中的滤过液采用70KDa的膜进行分离、提取；当滤过液的体积接近50%时，逐渐向原料液中加入100%的100mM的NaCl水溶液，当滤过液的体积达到100%时，停止过滤；
(8)将上述(7)中原料液（截留液）的pH值调到5.4-6.0之间；将pH 值5.4-6.0的原料液（截留液）继续采用70KDa的膜进行过滤的同时，不断向原料液中加入pH5.4-6.0之间100mM NaCl溶液；
(9)将上述(8)中的原料液（截留液）继续过滤，直至最后的原料液的体积浓缩到300-400ml，收集70KDa膜所有的滤过液；300-400ml截留液另作它用；
(10)调节上述步骤(9)中最后的所有的滤过液的pH值调到10-11之间；将调节pH 值后的滤过液采用30KDa膜设备进行分离和提取；当截留液的体积剩下50%的时候缓慢地向其中加入100%的pH10-11的去离子水，洗脱溶液中的NaCl，此过程中维持截留液的体积几乎不变；
(11)向上述(10)中的50%不含NaCl的截留液继续缓慢加入pH3左右的酸性离子水，直至最后的截留液的pH值控制在5.4左右；
(12)继续浓缩上述(11)中的pH5.4的截留液直至最后的截留液的体积在200-300ml之间；分别回收截留液和滤过液；
(13)将上述(12)中的截留液用来生产卵清蛋白，滤过液用来生产溶菌酶；截留液用冷冻干燥的方法冷冻干燥得到淡黄色白蛋白粉末。
其中，步骤（1）所述的蛋清和蛋黄分开的方法在规模化生产的情况下采用自动打蛋机。
其中，白蛋白的产率及回收率达到70%以上。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：依以下步骤生产鸡蛋膜蛋白：
(1)将34个鸡蛋（2kg）洗净,采用手工的方法将鸡蛋清和鸡蛋黄分离开来。收集鸡蛋清原液900ml。
(2)用去离子水配置与上述1中蛋清原液同等体积的100mM NaCl溶液并加入到上述1中的鸡蛋清原液中配制成50%的鸡蛋清液体。
(3)用去离子水配制100ml氧化酶溶液，其浓度为10g/L,并将配好的氧化酶溶液加入到上述2中50%的鸡蛋清溶液中。
(4)将上述3中50%鸡蛋清原液约1.8L（含氧化酶）放在5升的烧杯中用磁棒连续搅拌5小时。
(5)在搅拌的过程中将其温度控制在370C, pH值调节7.5左右。
(6)将上述经过1-4步骤调制好的鸡蛋清料液用几层叠加的医用纱布过滤一下，除去因在搅拌的过程中可能出现的蛋白积聚物或不溶物，收集滤过液。
(7)将上述6中的滤过液的pH值调节到10.
(8)将上述7中的滤过液采用70 Kda的超滤膜设备过滤，当滤过液的体积接近900ml时，逐渐向原料液中加入900ml的100mM的NaCl水溶液，当滤过液的体积达到1.8L时，停止过滤。
(9)将上述8中原料液（截留液）的pH值调到5.4-6.0之间。
(10)将上述9中pH 值5.4-6.0的原料液（截留液）继续采用70KDa的膜进行过滤的同时不断向原料液中加入1.8L pH5.4-6.0之间100mM NaCl溶液。
(11)将上述10中的原料液（截留液）继续过滤，直至最后的原料液的体积浓缩到300-400ml.收集8-11步骤中70KDa膜所有的滤过液（约4L）。300-400ml截留液另作它用。
(12)调节上述步骤11中最后的所有的滤过液的pH值调到10.
(13)将上述12中调节pH 值后的滤过液（约4L）采用30KDa膜设备进行分离和提取。当截留液的体积剩下300-500ml的时候缓慢地向其中加入600-1000ml的pH10的离子水（主要用于洗脱溶液中的NaCl），此过程中维持截留液的体积几乎不变。
(14)向上述13中的300-500ml截留液(不含NaCl)继续缓慢加入pH3左右的酸性离子水，直至最后的截留液的pH值控制在5.4左右。
(15)继续浓缩上述14中pH5.4左右的截留液直至最后的截留液的体积在200-300ml之间。分别回收截留液和滤过液。
(16)将上述13中截留液用来生产卵清蛋白，滤过液用来生产溶菌酶。
(17)将上述15中的截留液用冷冻干燥的方法冷冻干燥得到淡黄色白蛋白粉末34.5克，白蛋白的产率（回收率71%）。
实施例2：依以下步骤生产鸡蛋膜蛋白
（1）将35个鸡蛋(2kg)洗净,采用手工的方法将鸡蛋清和鸡蛋黄分离开来。收集鸡蛋清原液900ml。
（2）用去离子水配置与上述1中蛋清原液同等体积的100mM NaCl溶液并加入到上述1中的鸡蛋清原液中配制成50%的鸡蛋清液体。
（3）用去离子水配制100ml氧化酶溶液，其浓度为10g/L,并将配好的氧化酶溶液加入到上述2中50%的鸡蛋清溶液中。
(4)将上述3中50%鸡蛋清原液约1.8L（含氧化酶）放在5升的烧杯中用磁棒连续搅拌4小时。
(5)在搅拌的过程中将其温度控制在370C, pH值调节7.5左右。
(6)将上述经过1-4步骤调制好的鸡蛋清料液用几层叠加的医用纱布过滤一下，除去因在搅拌的过程中可能出现的蛋白积聚物或不溶物，收集滤过液。
(7)将上述6中的滤过液的pH值调节到10.5.
(8)将上述7中的滤过液采用70 Kda的超滤膜设备过滤，当滤过液的体积接近900ml时，逐渐向原料液中加入900ml的100mM的NaCl水溶液，当滤过液的体积达到1.8L时，停止过滤。
(9)将上述8中原料液（截留液）的pH值调到5.4-6.0之间。
(10)将上述9中pH 值5.4-6.0的原料液（截留液）继续采用70KDa的膜进行过滤的同时不断向原料液中加入1.8L pH4.8-6.0之间100mM NaCl溶液。
(11)将上述10中的原料液（截留液）继续过滤，直至最后的原料液的体积浓缩到300-400ml.收集8-11步骤中70KDa膜所有的滤过液（约4L）。300-400ml截留液另作它用。
(12)调节上述步骤11中最后的所有的滤过液的pH值调到10.5
(13)将上述12中调节pH 值后的滤过液（约4L）采用30KDa膜设备进行分离和提取。当截留液的体积剩下300-500ml的时候缓慢地向其中加入600-1000ml的pH10.5的离子水（主要用于洗脱溶液中的NaCl），此过程中维持截留液的体积几乎不变。
(14)向上述13中的300-500ml截留液(不含NaCl)继续缓慢加入pH3左右的酸性离子水，直至最后的截留液的pH值控制在5.4左右。
(15)继续浓缩上述14中pH5.4左右的截留液直至最后的截留液的体积在200-300ml之间。分别回收截留液和滤过液。
(16)将上述13中截留液用来生产卵清蛋白，滤过液用来生产溶菌酶。
(17)将上述15中的截留液用冷冻干燥的方法冷冻干燥得到淡黄色白蛋白粉末36.2克，白蛋白的产率（回收率74.5%）。
实施例3：依以下步骤生产鸡蛋膜蛋白
(1)将34个鸡蛋(2kg)洗净,采用手工的方法将鸡蛋清和鸡蛋黄分离开来。收集鸡蛋清原液900ml。
(2)用去离子水配置与上述1中蛋清原液同等体积的100mM NaCl溶液并加入到上述1中的鸡蛋清原液中配制成50%的鸡蛋清液体。
(3)用去离子水配制100ml氧化酶溶液，其浓度为10g/L,并将配好的氧化酶溶液加入到上述2中50%的鸡蛋清溶液中。
(4)将上述3中50%鸡蛋清原液约1.8L（含氧化酶）放在5升的烧杯中用磁棒连续搅拌5小时。
(5)在搅拌的过程中将其温度控制在370C, pH值调节7.5左右。
(6)将上述经过1-4步骤调制好的鸡蛋清料液用几层叠加的医用纱布过滤一下，除去因在搅拌的过程中可能出现的蛋白积聚物或不溶物，收集滤过液。
(7)将上述6中的滤过液的pH值调节到11.
(8)将上述7中的滤过液采用70 Kda的超滤膜设备过滤，当滤过液的体积接近900ml时，逐渐向原料液中加入900ml的100mM的NaCl水溶液，当滤过液的体积达到1.8L时，停止过滤。
(9)将上述8中原料液（截留液）的pH值调到5.4-6.0之间。
(10)将上述9中pH 值5.4-6.0的原料液（截留液）继续采用70KDa的膜进行过滤的同时不断向原料液中加入1.8L pH5.4-6.0之间100mM NaCl溶液。
(11)将上述10中的原料液（截留液）继续过滤，直至最后的原料液的体积浓缩到300-400ml.收集8-11步骤中70KDa膜所有的滤过液（约4L）。300-400ml截留液另作它用。
(12)调节上述步骤11中最后的所有的滤过液的pH值调到11.
(13)将上述12中调节pH 值后的滤过液（约4L）采用30KDa膜设备进行分离和提取。当截留液的体积剩下300-500ml的时候缓慢地向其中加入600-1000ml的pH11的离子水（主要用于洗脱溶液中的NaCl），此过程中维持截留液的体积几乎不变。
(14)向上述13中的300-500ml截留液(不含NaCl)继续缓慢加入pH3左右的酸性离子水，直至最后的截留液的pH值控制在5.4左右。
(15)继续浓缩上述14中pH5.4左右的截留液直至最后的截留液的体积在200-300ml之间。分别回收截留液和滤过液。
(16)将上述13中截留液用来生产卵清蛋白，滤过液用来生产溶菌酶。
(17)将上述15中的截留液用冷冻干燥的方法冷冻干燥得到淡黄色白蛋白粉末36.6克，白蛋白的产率（回收率75.3%）。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围。