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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810440073.0 (22)申请日 2018.05.10 (71)申请人 肖金量 地址 214156 江苏省无锡市惠山区阳山镇 人民西路18号研发大楼 (72)发明人 肖金量 (51)Int.Cl. A61K 31/427(2006.01) A61K 31/34(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (54)发明名称 一种斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂和用于 制备脑保护药物的应用 (57)摘要 本发明公开了一种。
2、斑蝥素衍生物用作MMP-9 抑制剂和用于制备脑保护药物的应用。 研究表 明， MMP-9在血脑屏障损伤中发挥了重要作用， 抑 制MMP-9有助于维持血脑屏障完整性， 减少不利 刺激对脑部损伤(MMP-2、 MMP-9在血脑屏障损伤 中的作用， 中国医学装备2008年第5卷第5期； VEGF和MMP-9与缺血性脑卒中关系的研究进展， 中国临床药理学与治疗学2015年第20卷第3期)。 MMP-9抑制剂可用于制备成脑保护的药物。 本发 明提供的斑蝥素衍生物可以通过抑制MMP-9表达 维持血脑屏障的完整性， 因而具备制成脑保护药 物的前景； 现有技术没有报道过上述斑蝥素衍生 物具备该作用， 也不存在。
3、技术启示， 对于本领域 技术人员而言是非显而易见的， 具备专利法规定 的创造性。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 108670967 A 2018.10.19 CN 108670967 A 1.如下斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂的医药用途， 化学结构式如下： 2.权利要求1所述的斑蝥素衍生物用于制备保护血脑屏障的药物的医药用途。 3.权利要求1所述的斑蝥素衍生物用于制备脑保护的药物的医药用途。 4.一种脑保护药物制剂， 其特征在于： 活性成分为权利要求1所述的斑蝥素衍生物， 还 含有药学上可以接受的辅料。 5.根据权利要求4所述的药物制剂， 其特征在于： 所述辅料包括液体辅料、 。
4、固体辅料或 半固体辅料等。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108670967 A 2 一种斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂和用于制备脑保护药物 的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 具体涉及一种斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂和用于制备 脑保护药物的应用。 背景技术 0002 MMP-9为血清基质金属蛋白酶-9， 又名明胶酶B。 基质金属蛋白酶(MMPs)是一种内 源性钙锌依赖性内切酶家族， 因其辅助因子为钙离子、 锌离子而得名。 目前已发现其家族有 28个成员， 分离鉴别编号为MMP-1MMP-28， 根据功能不同将其分为5大类： 胶原酶、 明胶酶、 基质水解酶、 膜。
5、型MMPs及其他MMPs。 其中MMP-9能够特异地水解细胞外基质(ECM)和基底膜 (BM)的化学成分型胶原、 型胶原、 黏连蛋白等， 其结构域从羧基端至氨基端依次为类血 红素结合蛋白酶区、 富含脯氨酸铰链区、 催化活性区、 前肽区和信号肽区等。 0003 研究表明， MMP-9在血脑屏障损伤中发挥了重要作用， 抑制MMP-9有助于维持血脑 屏障完整性， 减少不利刺激对脑部损伤(参考文献： MMP-2、 MMP-9在血脑屏障损伤中的作用， 中国医学装备2008年第5卷第5期； VEGF和MMP-9与缺血性脑卒中关系的研究进展， 中国临床 药理学与治疗学2015年第20卷第3期)。 MMP-9。
6、抑制剂可用于制备成脑保护的药物。 0004 斑蝥素是广泛存在于1500多种斑蝥体内中的一种天然防御性毒素。 斑蝥属芫青科 昆虫， 性寒味辛， 为剧毒中药材， 除具有抗癌活性外， 尚有抗病毒、 壮阳、 升高白细胞等多种 活性。 我国是世界上最早认识斑蝥药用价值的国家， 在 本草纲目 中就其形态、 习性及用法 有详细的记载。 临床观察表明， 斑蝥素有明显的抗癌作用， 对肝癌、 食道癌、 胃癌、 肺癌等均 有抑制效果。 由于斑蝥素毒性强烈， 口服斑蝥素会导致严重的胃肠溃疡， 泌尿器官小管的上 皮内层溃疡以及腹膜内腔毛细管充血， 继而出现严重的肝充血和水肿， 世界范围内对斑蝥 素进行了多种结构衍生化研。
7、究， 以期望对其 “减毒增效” 。 曾文南等于2006年较为系统地介 绍了斑蝥素及其衍生物的研究进展(参考文献： 斑蝥素及其衍生物的合成与活性研究进展， 有机化学2006年第26卷第5期)。 斑蝥素化学结构式如下： 0005 0006 斑蝥素及其衍生物的活性研究还在不停的研究， 不断有新的研究成果问世。 发明内容 0007 本发明旨在提供一种斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂和用于制备脑保护药物的应 用。 说 明 书 1/6 页 3 CN 108670967 A 3 0008 本发明的技术方案如下： 0009 如下斑蝥素衍生物用作MMP-9抑制剂的医药用途， 化学结构式如下： 0010 0011。
8、 上述斑蝥素衍生物用于制备保护血脑屏障的药物的医药用途。 0012 上述斑蝥素衍生物用于制备脑保护的药物的医药用途。 0013 一种脑保护药物制剂， 活性成分为上述斑蝥素衍生物， 还含有药学上可以接受的 辅料。 0014 优选地， 所述辅料包括液体辅料、 固体辅料或半固体辅料等。 0015 有益效果： 0016 本发明提供的斑蝥素衍生物可以通过抑制MMP-9表达维持血脑屏障的完整性， 因 而具备制成脑保护药物的前景； 现有技术没有报道过上述斑蝥素衍生物具备该作用， 也不 存在技术启示， 对于本领域技术人员而言是非显而易见的， 具备专利法规定的创造性。 附图说明 0017 图1为斑蝥素及其衍生物。
9、对MMP-9活性的影响； 0018 图2为斑蝥素及其衍生物对血脑屏障基底膜collagen表达的影响； 0019 图3为斑蝥素及其衍生物对血脑屏障通透性的影响。 具体实施方式 说 明 书 2/6 页 4 CN 108670967 A 4 0020 下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。 动物实验方法参照文献方法 (高兰等， 丁苯酞对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9活性和血脑屏障通透性的影响， 中风与神 经疾病杂志2012年2月第29卷第2期)。 0021 实施例1： 0022 一、 实验材料 0023 健康雄性Wistar大鼠， 体重25010g， 购自南京青龙山实验动物基地。 0024。
10、 MMP-9兔多克隆抗体购自武汉艾美捷科技有限公司， collagen兔多克隆抗体购 自武汉博士德生物工程有限公司。 0025 斑蝥素衍生物15化学结构式如下， 自制或购买， 纯度不低于95。 0026 0027 另设斑蝥素作为对比组。 0028 二、 实验方法 0029 1、 分组、 造模及给药方法 0030 大鼠随机分为假手术组、 缺血再灌注组、 药物治疗组(斑蝥素衍生物15治疗组、 斑蝥素对比组)。 各组分别在缺血再灌注24h各取5只大鼠进行血脑屏障通透性的研究， 同时 各组另各取5只大鼠进行MMP-9、 collagen型胶原免疫组化测定。 0031 参照Zea longa线栓法， 并。
11、加以改进制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。 10水 合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后， 仰卧固定， 常规消毒， 取颈部正中切口， 分离并暴露左 侧颈总及颈内、 外动脉。 小心分离迷走神经， 结扎左侧颈总及颈外动脉根部， 由左侧颈总动 说 明 书 3/6 页 5 CN 108670967 A 5 脉分叉处剪一小口插入头端烧圆涂蜡呈钝形的直径为0.245mm的尼龙鱼线， 线栓插入深度 约1820mm感有轻微阻力时停止， 扎紧并固定栓线， 缝合皮肤， 阻断血流2h后， 抽提栓线至 颈总动脉内实现再灌注。 假手术组除不插入尼龙鱼线外， 其余步骤同手术组。 选择苏醒后右 上肢屈曲、 行走时向右侧。
12、旋转或右侧肢体瘫痪的大鼠造模成功者进行后续实验。 0032 假手术组不给药。 药物治疗组于再灌注同时给予腹腔注射斑蝥素衍生物15或斑 蝥素50mg/kg， 模型组再灌注同时给予等剂量生理盐水。 0033 2、 免疫组织化学方法测定MMP-9蛋白及collagen型胶原 0034 缺血再灌注24h后用10水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠， 剪开胸腔暴露 心脏， 0.9生理盐水250ml心内灌注冲洗， 同时剪开右心耳至液体变清亮为止。 后用4多 聚甲醛溶液灌注固定， 取脑， 多聚甲醛溶液固定72h， 常规脱水， 石蜡包埋， 冠状切片。 具体操 作步骤参考说明书。 每张组织切片在缺血侧选。
13、5个不重复视野， 100倍镜下观察， 400倍下计 数。 记录其中胞浆被染成棕黄色的MMP-9阳性细胞数及collagen阳性微血管个数。 位于视 野边缘处的不完整细胞或微血管按照在视野中的面积进行估算统计。 0035 3、 伊文思兰方法标本采集 0036 各组动物在预订时间点处死前30min经舌下静脉注射伊文思蓝(2ml/kg， EB)。 大鼠 全身迅速变蓝。 30min后相应时间点处死大鼠， 0.9生理盐水心脏灌注至右心房流出清亮 液， 断头取脑， 放置于2ml无菌冻存管中， 液氮中保存备用。 0037 4、 血脑屏障通透性的测定 0038 用甲酰胺浸泡法测脑组织EB量。 电子天平分别把各。
14、组标本称重后置于甲酰胺溶液 (每100mg脑组织加入1ml甲酰胺)中， 45水浴24h， 1000r/min离心5min， 用吸管轻轻吸出上 清液， 可见光分光光度计( 632)测定上清液OD值， 甲酰胺做空白比色， 按公式计算脑组织 EB含量:脑组织EB含量( g/g)待测样品EB含量( g/ml)甲酰胺容量(ml)脑湿重(g)， 待测样品EB含量系根据标准曲线回归方程求得。 0039 5、 统计学方法 0040 采用SPSS 19.0统计软件。 计量资料均以均数标准差( s)表示， 多组数据比较 采用单因素方差分析， 任意两组之间的比较采用LSD检验， P0.05有统计学差异。 0041 。
15、三、 实验结果 0042 1、 斑蝥素及其衍生物对MMP-9活性的影响 0043 与假手术组相比， 缺血再灌注组脑内MMP-9阳性细胞数显著升高； 与缺血再灌注组 相比， 斑蝥素对比组脑内MMP-9阳性细胞数无显著变化(P0.05)， 斑蝥素衍生物15治疗 组脑内MMP-9阳性细胞数显著降低(P0.05)。 结果见表1和图1。 0044 表1斑蝥素及其衍生物对MMP-9活性的影响 说 明 书 4/6 页 6 CN 108670967 A 6 0045 0046 2、 斑蝥素及其衍生物对血脑屏障基底膜collagen表达的影响 0047 与假手术组相比， 缺血再灌注组collagen阳性血管计数。
16、显著降低； 与缺血再灌 注组相比， 斑蝥素对比组collagen阳性血管计数无显著变化(P0.05)， 斑蝥素衍生物1 5治疗组collagen阳性血管计数显著升高(P0.05)。 结果见表2和图2。 0048 表2斑蝥素及其衍生物对血脑屏障基底膜collagen表达的影响 0049 0050 3、 斑蝥素及其衍生物对血脑屏障通透性的影响 0051 与假手术组相比， 缺血再灌注组EB含量显著升高； 与缺血再灌注组相比， 斑蝥素对 比组EB含量无显著变化(P0.05)， 斑蝥素衍生物15治疗组EB含量显著降低(P0.05)。 结果见表3和图3。 0052 表3斑蝥素及其衍生物对血脑屏障通透性的影响 说 明 书 5/6 页 7 CN 108670967 A 7 0053 0054 上述结果表明， 本发明提供的斑蝥素衍生物可以通过抑制MMP-9表达维持血脑屏 障的完整性， 因而具备制成脑保护药物的前景。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108670967 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 108670967 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 108670967 A 10 。