基于癌抑制基因WT1的产物的癌抗原.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102198266 A (43)申请公布日 2011.09.28 CN 102198266 A *CN102198266A* (21)申请号 201110102882.9 (22)申请日 1999.07.30 218093/1998 1998.07.31 JP 99810209.1 1999.07.30 A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 株式会社国际癌症免疫研究所 地址 日本大阪府 (72)发明人 冈芳弘 杉山治夫 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商。

2、标事务所 11038 代理人 李英 (54) 发明名称 基于癌抑制基因 WT1 的产物的癌抗原 (57) 摘要 本发明涉及 Wilms 肿瘤癌抑制基因 WT1 的产 物， 以该氨基酸序列中包括与 I 类主要组织适合 性抗原 (MHC) 结合的锚定氨基酸在内的连续 7 30 个氨基酸构成的肽作为有效成分的癌抗原， 以 及含有它们的癌疫苗。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 16 页 CN 102198270 A1/1 页 2 1. 编码示于 SE。

3、Q ID NO ： 1 或 2 的蛋白质或其部分肽的核酸在制备癌症疫苗中的用途， 所述肽由序列号 2 所示氨基酸序列的 9 个连续氨基酸所组成， 其中 2 位上氨基酸残基是亮 氨酸或甲硫氨酸， 9 位上氨基酸残基是缬氨酸或亮氨酸， 该肽可结合 I 类 MHC 抗原。 2.权利要求1的用途， 其中的核酸编码示于SEQ ID NO ： 1或2的蛋白质用于所述制备。 3. 如权利要求 1 所述的用途， 其中的核酸编码的部分肽选自下组 ： 位置 126-134 ： Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(Db 126)， 位置 235-243 ： Cys Met Thr。

4、 Trp Asn Gln Met Asn Leu(Db 235)， 位置 187-195 ； Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(WH 187)， 位置 7-15 ： Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val， 位置 10-18 ： Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu， 位置 225-233 ： Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu， 位置 242-250 ： Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val， 位置 441-449 ： 。

5、Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu。 4. 如权利要求 3 所述的用途， 所说的部分肽为以下任意一种 ： Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5) Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu( 序列号 7) WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val( 序列号 8)。 5. 如权利要求 4 所述的用途， 所说的部分肽为 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5。

6、) 或 WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val( 序列号 8)。 权 利 要 求 书 CN 102198266 A CN 102198270 A1/8 页 3 基于癌抑制基因 WT1 的产物的癌抗原 0001 本申请是申请号 200410049270.8， 申请日 1999 年 7 月 30 日的同名申请的分案申 请。 技术领域 0002 本发明涉及 Wilms 肿瘤的癌抑制基因 WT1 的产物为基础的癌抗原。该癌抗原作为 针对白血病、 骨髓异形成综合症、 多发性骨髓瘤、 恶性淋巴瘤等血癌或实体瘤， 例如胃癌、 大 肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 胚细胞。

7、瘤、 肝癌、 皮肤癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 子宫癌、 子宫颈癌、 卵巢癌 等以及 WT1 表达的所有癌的抗癌疫苗上有用的。 背景技术 0003 用于排除异物的免疫机构一般包括与识别抗原作为抗原提示细胞作用的巨噬细 胞、 识别该巨噬细胞的抗原提示产生各种淋巴因子使其他 T- 细胞等活化的辅助 T 细胞、 通 过该淋巴因子的作用分化成抗体产生细胞的 B 淋巴细胞等有关的体液免疫以及接受抗原 提示分化成的杀伤 T 细胞攻击破坏靶细胞的细胞免疫。 0004 现在， 认为癌的免疫主要是与杀伤T细胞有关的细胞性免疫引起的。 在杀伤T细胞 引起的癌免疫中， 识别以主要组织适合抗原(Major Histoc。

8、ompatibility Complex， MHC)第 I 类与癌抗原形成的复合体形式提示的癌抗原的前体 T 细胞分化增殖生成的杀伤 T 细胞攻 击破坏癌细胞。这时， 癌细胞在其细胞表面提示 MHC 第 I 类抗原与癌抗原形成的复合体， 它 成为杀伤 T 细胞的靶细胞 (Cur.Opin， Immunol.， 5， 709， 1993 ； Cur.Opin， Immunol.， 5， 719， 1993 ； Cell， 82， 13， 1995 ； Immunol.Rev， 146， 167， 1995)。 0005 作为靶细胞的癌细胞上通过MHC第I类抗原提示的上述癌抗原可以认为是癌细胞 内。

9、合成的抗原蛋白质被细胞内蛋白酶处理生成的约 8 12 个氨基酸构成的肽 (Cur.Opin， Immunol.， 5， 709， 1993 ； Cur.Opin.Immunol.， 5， 719， 1993 ； Cell， 82， 13， 1995 ； Immunol. Rev.， 146， 167， 1995)。 0006 现在， 对于各种癌进行了抗原蛋白质的检索， 证明是癌特异抗原的物质较少。 0007 Wilms 肿瘤的癌抑制基因 WT1(WT1 基因 ) 是根据对 Wilms 肿瘤、 无红彩、 泌尿生殖 器异常、 精神发达迟滞等并发的 WAGR 综合症的解析， 作为 Wilms 肿瘤的。

10、一种原因基因从染 色体 11p13 分离出的物质 (Gessler， M. 等， Nature， Vol.343， p.774-778(1990)， 基因组 DNA 通过约 50kb 由 10 个外显子构成， 其 cDNA 为约 3kb。由 cDNA 推测出的氨基酸序列如序 列号 1 所示 (Mol.Cell.Biol.， 11， 1707， 1991)。 0008 WT1 基因在人白血病中高度表达， 用 WT1 反义低聚物 (antisense oligomer) 处理 白血病细胞能够抑制其细胞增殖 ( 特开平 9-104627 号公报 ) 等提示 WT1 基因可以促进白 血病细胞的增殖。而。

11、且， WT1 基因在胃癌、 大肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 胚细胞癌、 肝癌、 皮肤癌、 膀 胱癌、 前列腺癌、 子宫癌、 子宫颈癌、 卵巢癌等实体瘤中高度表达 ( 特愿平 9-191635)， 判断 出 WT1 基因是白血病和实体瘤中新的肿瘤标识物。但是， 尚未证明 WT1 基因表达产物是作 为癌疫苗有用的癌特异抗原。 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A2/8 页 4 0009 发明公开 0010 因此， 本发明确认了 WT1 基因表达产物作为癌抗原的可能性， 提供了一种新型癌 抗原。 0011 本发明人为了解决上述问题进行了各种研究， 结果合成了 WT1 基。

12、因表达产物的 氨基酸序列中含有被预测在小鼠和人的 I 类 MHC 和 II 类 MHC 的结合中作为锚定氨基酸 (anchor amino acid) 起作用的至少 1 个氨基酸的连续 7 30 个氨基酸构成的多肽， 确认 这些肽与 MHC 蛋白质结合， 同时确认与 I 类 MHC 抗原结合时诱导杀伤 T 细胞， 而且对靶细胞 具有杀细胞效果， 从而完成了本发明。 0012 因此， 本发明提供小鼠 WT1 表达产物或含有其一部分的癌抗原。在优选的方式中， 本发明提供以与 WT1 的 cDNA 对应的序列号 1 所示的氨基酸序列中包括用于与 MHC 抗原结 合的锚定氨基酸在内的 6 30 个氨基。

13、酸构成的肽作为活性成分的癌抗原。 0013 而且本发明提供以与人 WT1 的 cDNA 对应的序列号 2 所示的氨基酸序列中包括用 于与 MHC 抗原结合的锚定氨基酸在内的 7 30 个氨基酸构成的肽作为活性成分的癌抗原。 0014 本发明还提供含有上述癌抗原的癌疫苗。 0015 附图的简单说明 0016 图 1 表示实施例 1 中用 Db126 肽免疫的细胞与非免疫细胞在流式细胞测量法中 CD4+细胞与 CD8+细胞的比例。 0017 图 2 是比较实施例 2 中用 Db126 肽免疫的细胞对于用 Db126 肽脉冲的靶细胞和未 脉冲的靶细胞的杀细胞作用。 0018 图 3 是与图 2 含义。

14、相同的图。 0019 图 4 中 A 表示实施例 3 中使用 Db126 肽诱导的 CTL 对于用 Db126 肽脉冲的 T2 细胞 的杀细胞效果， B 表示实施例 3 中使用 WH187 肽诱导的 CTL 对于用 WH187 肽脉冲的 T2 细胞 的杀细胞效果。 0020 图 5 表示由 Db126 肽诱导的 CTL 的表面标识物通过 FACS 解析的结果 (CD19 细胞 以及 CD3 细胞 )。 0021 图 6 表示 CD4 细胞以及 CD8 细胞与图 5 同样的图。 0022 图 7 表示 CD56 细胞与图 5 同样的图。 0023 图 8 表示 WH187 肽诱导的 CTL 的表。

15、面标识物通过 FACS 解析的结果 (CD19 细胞和 CD3 细胞 )。 0024 图 9 表示 CD4 细胞和 CD8 细胞与图 8 同样的图。 0025 图 10 表示 CD56 细胞与图 8 同样的图。 0026 图 11 表示抗 HLA-A2.1 抗体对 Db126 肽特异性 CTL 引起的对于用 Db126 肽脉冲的 T2 细胞的特异性细胞溶解的影响。 0027 图12是比较Db126肽特异性CTL对于表达WT1的靶细胞或不表达WT1的靶细胞的 细胞溶解活性。a 表示 E T 比为 7.5 1 的情况下的结果， b 表示 E T 比为 15 1 的 情况下的结果。 0028 图 1。

16、3 是比较 Db126 肽特异性 CTL 对于先天表达 WT1 的肿瘤细胞 (FBL3) 或不表达 WT1 的肿瘤细胞 (RMA) 的细胞溶解效果。 0029 图 14 是比较 Db126 肽特异性 CTL 对于用 WT1 基因胞质转移的细胞以及未进行胞 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A3/8 页 5 质转移的同一细胞的细胞溶解效果。 0030 图 15 表示 I 类抗 H-2 抗体对 Db126 肽特异性 CTL 的细胞毒性的影响。 0031 图 16 表示使用 Db126 肽作为疫苗使用， 免疫小鼠时的体内免疫效果。 0032 图 17 表示将表达 W。

17、T1 的质粒作为 DNA 疫苗投给小鼠时的免疫效果。 0033 图 18 是图 17 的对照， 是表示投给不表达 WT1 的质粒时不产生免疫效果的图。 0034 发明的实施方式 0035 本发明中， 作为设计癌抗原肽时的基础， 选择小鼠 I 类 MHC 的 Kb和 Db， 以及人 HLA 的 A*0201， 选择预测与它们具有高亲和性的肽。 0036 根据 Immunogenetics Vol.41， p.178-228(1995) 的记载， 预测与 Kb结合的锚定氨 基酸是 5 号的 Phe 和 Tyr 以及 8 号的 Leu 和 Met 等， 另外预测与 Db结合的锚定氨基酸是 5 号的 。

18、Asn 以及 9 号的 Met 和 Ile 等。 0037 另外， 已知癌细胞表面上 I 类 MHC 提示的癌抗原肽的大小为约 8 12 个。因此， 本发明的癌抗原肽是序列号1所示WT1基因产物的氨基酸序列中包括锚定氨基酸在内的连 续 7 30 个氨基酸构成的肽。氨基酸的数目优选为 8 12 个， 例如 8 或 9 个。 0038 在本发明中， 作为其具体例子， I 类 MHC 与 Kb结合的肽使用由 8 个氨基酸构成的下 述肽 ： 0039 Kb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu( 序列号 3) 0040 Kb 330 Cys Asn Lys Arg Ty。

19、r Phe Lys Leu( 序列号 4) 0041 I 类 MHC 与 Db结合的肽使用由 9 个氨基酸构成的下述肽 ： 0042 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5) 0043 Db 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met( 序列号 6) 0044 Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu( 序列号 7) 0045 上述序列中带下划线的氨基酸是被预测作为锚发挥作用的氨基酸。 0046 其次， 使用未提示抗原肽(empty)但表达Kb以及Db的细。

20、胞线测定这些肽中Kb45以 及 Kb330 与 I 类 MHC 的 Kb的结合性， Db126、 Db221 和 Db235 与 I 类 MHC 的 Db的结合性。 0047 也就是说， 在 26下培养 RMA-S， 使 I 类 MHC 高度表达， 在 37下培养该培养细胞 与被测肽溶液 1 小时。这样， 不与肽结合的 MHC 分子变得不稳定， 从细胞表面消失， 仅残留 与肽结合的 I 类 MHC 分子。其次， 用识别 I 类 MHC(Kb， Db) 的荧光标识单克隆抗体给 RMA-S 细胞染色。最后， 通过 FACS 解析， 由每个细胞的平均荧光量计算结合解离常数 (Immunol. Let。

21、t.， 47， 1， 1995)。 0048 结果， 得到了下述结果。 0049 Kb 45 -4.5784838(log) 0050 Kb 330 -5.7617732 0051 Db 126 -6.2834968 0052 Db 221 -5.7545398 0053 Db 235 -6.1457624 0054 如上所述， 与 Kb或 Db具有强中度的结合亲和性 (kd 值 ) 但显示最高结合亲和性 的 Db126 肽在以后的实验中被使用。 0055 另外， 对于人， 根据 Immunogenetics Vol.41， p， 178-228(1995) 的记载， 预测与人 说 明 书 C。

22、N 102198266 A CN 102198270 A4/8 页 6 HLA-A*0201 结合的锚定氨基酸是 N- 末端至 2 号 Leu 和 Met 以及 N- 末端至 9 号 Val 和 Leu。 因此合成了人 WT1 蛋白质的氨基酸序列 (Mol.Coll.Biol.Vol.11， p.1707-1712， 1991)( 序 列号 2) 中符合上述条件的 9 个氨基酸构成的 2 种肽。 0056 Db 126 ； Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5) 0057 ( 与小鼠中 Db126 的序列相同 ) 0058 WH 187 ； Se。

23、r Leu Gly Glu Gln Gin Tyr Ser Val( 序列号 8) 0059 ( 下划线表示锚定氨基酸 ) 0060 如下所述测定上述肽与 HLA-A*0201 的结合能。 0061 在 37下培养上述肽与具有 empty 的 HLA-A*0201 的 T2 细胞 (J.Immunol.， 150， 1763， 1993 ； Blood， 88， 2450， 1996)1 小时后， 用识别 HLA-A2.1 的荧光标识单克隆抗体给 T2 细胞染色， 通过 FACS 解析， 由每个细胞的平均荧光量计算结合解离常数。 0062 结合能 0063 0064 2 种肽均具有中度以上的结。

24、合亲和性。 0065 使用上述 Db126 以及 WH187 作为与人 MHC 对应的肽， 进行以下试验。 0066 本发明还涉及以上述抗原为有效成分的癌疫苗。该疫苗可以用于 WT1 基因的表达 水平上升伴有的癌， 例如白血病、 骨髓异形成综合症、 多发性骨髓瘤、 恶性淋巴瘤等血癌， 胃 癌、 大肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 胚细胞癌、 肝癌、 皮肤癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 子宫癌、 子宫颈癌、 卵 巢癌等实体瘤的预防或治疗。 该疫苗可以通过口服给药或非口服给药， 例如腹腔内给药、 皮 下给药、 皮内给药、 肌肉内给药、 静脉内给药、 鼻腔内给药等形式给药。 0067 而且， 作为本发明疫苗的给。

25、药方法， 也可以从患者的末梢血收集单核细胞， 从中取 出分叶细胞， 用本发明的肽脉冲， 通过给患者皮下给药等返回到患者中的方法。 0068 疫苗除上述作为有效成分给药的肽之外， 还可以含有可药用的载体， 例如适当的 佐剂， 例如氢氧化铝等矿物胶 ； 溶血卵磷脂、 普朗尼克多元醇等表面活性剂 ； 聚阴离子 ； 肽 ； 或油乳浊液。或者， 也可以混合到脂质体中， 或含有多糖和 / 或疫苗中配合的其它集合体。 给药量一般每天 0.1g 1mg/kg。 0069 另外本发明中编码上述多肽疫苗的 DNA 也可以作为疫苗 (DNA 疫苗 ) 使用。也就 是说， 通过将编码 WT1 或其一部分的核酸， 优选。

26、将 DNA 插入适当的载体， 优选插入表达载体 中后， 投给动物， 可以产生癌免疫。其具体例子如实施例 9 所示。 实施例 0070 其次结合实施例说明本发明的肽作为癌抗原和癌疫苗是有用的。 0071 实施例 1 0072 在 C57BL/6 小鼠的腹腔内每周注射 2 次 Db126 肽 100g、 来源于猪的乳酸脱氢酶 (LDH)200g 以及弗罗因德不完全佐剂 0.5ml， 进行免疫处理。该免疫处理 1 周后摘出小鼠 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A5/8 页 7 的脾脏， 配制脾脏细胞的悬浮液。另一方面， 在 37下， 培养用 Db126 肽脉冲的同。

27、系小鼠的 放射线照射脾细胞和含有肽 50g/ml 的溶液 30 分钟， 作为抗原提示细胞。 0073 将上述免疫处理后的脾细胞与放射线照射脾细胞混合， 一同培养 5 日， 诱导配制 杀伤 T 细胞。另一方面， 用 Db126 肽脉冲 ( 与 100g/ml 的肽溶液在 37下培养 30 分钟 ) 的 Europium 标记 EL-4 细胞 ( 表达 Kb和 Db) 作为靶细胞， 采用常规方法， 按照下述操作进行 Killing 分析 ( 表 1)。 0074 结果， 以Db126脉冲的EL-4细胞作为靶时可见杀细胞效果， 但以未用Db126脉冲的 EL-4 细胞作为靶时， 几乎见不到杀细胞效果。

28、。 0075 表 1 0076 0077 E/T 比 40 1 0078 其次， 将 Killing 分析中具有显著杀细胞效果的脾细胞试样用荧光标识的抗 CD4 抗体和抗 CD8 抗体染色， 通过流式细胞测量法解析 CD4 和 CD8 的表达。 0079 结果， 如图 1 所示， 与非免疫对照细胞相比， 用 Db126 肽进行免疫处理的脾细胞中， 杀伤 T 细胞代表的 CD8+细胞增加， CD8+细胞对于辅助 T 细胞等代表的 CD4+细胞的比例反向 增加。 0080 实施例 2 0081 如下所述配制来源于C57BL/6小鼠骨髓的分叶细胞(dendritic cells， DC)。 按照 常。

29、规方法， 在 GM-CSF 存在下培养骨髓细胞， 配制来源于骨髓的分叶细胞 (J.Exp.Med.182， 255， 1995)。 0082 将培养7天后的分叶细胞与10M的OVAII(Ovalbumin II)以及1M的Db126肽 一同培养 3 小时后， 洗净。 0083 其次， 将上述 DC 细胞由皮内注射到 C57B1/6 小鼠的 foot pads 和 hands 上， 第 5 日取出所属淋巴结， 配制细胞悬浮液。另一方面， 配制用 Db126 肽脉冲、 放射线照射的 B7.1-RMA-S 细胞 ( 转染编码 Co-stimulatory moleculeB7.1 的基因的 RMA-。

30、S 细胞 )。 0084 其次， 通过混合培养上述来源于淋巴结的细胞悬浮液和 B7.1-RMA-S 细胞， 在体外 进行再刺激。 0085 其次， 在体外进行再刺激的第5天， 以 51Cr标记的RMA-S细胞作为靶， 进行Killing 分析。以再刺激第 5 天回收的淋巴细胞总体的 1/8 用作效应细胞时作为最大 E/T 比 (1.0)。 0086 如图 2 和图 3 所示， 用 Db126 肽免疫的来源于小鼠淋巴结的效应细胞杀死了用该 肽脉冲的靶细胞， 相反却没有杀死未用该肽脉冲的靶细胞。 0087 另外， 与实施例 1 同样用流式细胞测量法解析 CD4+细胞和 CD8+细胞的比为 CD4 。

31、CD8 1 1.4 1.7， 与非免疫小鼠细胞 ( 对照 ) 相比， 用 Db126 肽免疫的小鼠细 胞中 CD8+细胞增加， CD4+细胞 CD8+细胞的比 ( 对照细胞中为约 2 1) 在免疫的细胞中 逆转。 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A6/8 页 8 0088 实施例 3 0089 共同培养与肽 Db126 或 WH187(40g/ml) 培养 1 小时后用放射线照射的 T2 细胞 2104个与具有 HLA-A*0201 的健康人末梢单核细胞 1106个。一周后， 在上述共同培养 体系中加入与肽 (20g/ml) 培养 1 小时后用放射线照射的 。

32、T2 细胞， 进行再刺激。第二天， 在培养液中加入人 IL-2( 最终浓度 100JRU/ml)。 0090 以后， 用肽脉冲后经放射线照射的 T2 细胞反复刺激 5 次后， 以肽被脉冲的 T2 细胞 或肽未被脉冲的 T2 细胞作为靶， 进行 Killing 分析。另外， 对诱导的 CTL 的表面标识物进 行 FACS 解析。 0091 Killing 分析按照常规方法以用 Europium 标记的 T2 细胞脉冲肽得到的物质作为 靶进行。 0092 Effector ： Target 比 (E/T 比 ) 为 10 1 0093 共同培养时间 ： 3 小时 0094 培养液中的肽浓度 ： 5。

33、g/ml 0095 结果如图 4 所示。图 4 中 A 表示用 Db126 肽诱导的 CTL 对 Db126 肽脉冲的 T2 细胞 的杀细胞效果， 图4中B表示用WH187肽诱导的CTL对WH187脉冲的T2细胞的杀细胞效果。 0096 在任何一种场合下， 对于用肽脉冲的 T2 细胞均可见较强的杀细胞效果。 0097 FACS 解析的结果如图 5 10 所示。图 5 7 表示用 Db126 肽诱导的人 CTL 的结 果， 几乎所有的细胞都为 CD8 阳性。图 8 图 10 表示 WH187 肽诱导的人 CTL 的结果。CD4 阳性细胞和 CD8 阳性细胞数目几乎相同。 0098 实施例 4 0。

34、099 为了对 Db126 肽特异性 CTL 的细胞溶解活性的 MHC 限制性进行试验， 使用抗 HLA-A2.1 单克隆抗体以阻滞 CTL 对于用肽脉冲的 T2 细胞的细胞毒性活性。在 E/T 比为 5 1 时， 在对 HLA-A2.1 分子的阻滞单克隆抗体 (BB7.2) 存在下或不存在下， 测定用 Db126 肽脉冲的 T2 细胞的特异性细胞溶解。 0100 结果如图 11 所示。该图中符号 * 表示用抗 H-2Kb单克隆抗体代替抗 HLA-A2.1 单 克隆抗体的结果。如该图说明的那样， 通过添加 60g/ml 的抗 HLA-A2.1 单克隆抗体， 细胞 毒性下降至 T2 细胞的细胞溶。

35、解底数。同型的无关单克隆抗体 ( 抗 H-2Kb单克隆抗体 Y 3) 对 T2 细胞的溶解没有效果。 0101 实施例 5 0102 对于Db126肽特异性CTL是否能杀死先天表达WT1的HLA-A2.1阳性白血病细胞进 行试验。使用 TF1 细胞 ( 表达 WT-1， HLA-A2.1 阳性 )、 JY 细胞 ( 不表达 WT1， HLA-A2.1 阳 性 ) 以及 Molt-4 细胞 ( 表达 WT1， HLA-A2.1 阴性 ) 作为靶细胞， 在 E T 比为 7.5 1(a) 或 15 1(b) 时， 测定细胞毒性。 0103 结果如图 12 所示。Db126 肽特异性 CTL 对于先。

36、天表达 WT1 的 HLA-A2.1 阳性的白 血病细胞 TF1 具有显著的细胞毒性， 但对于 Molt-4( 表达 WT1， HLA-A2.1 阴性 ) 或 JY 细胞 ( 不表达 WT1， HLA-A2.1 阳性 ) 显示底数水平的细胞溶解。 0104 实施例 6 0105 对于 Db126 肽特异性 CTL 是否能识别并溶解先天表达 WT1 的肿瘤细胞进行试验。 对于表达 WT1 的肿瘤细胞 (FBL3) 或不表达 WT1 的肿瘤细胞 (RMA)( 图 13)， 或者转染 WT1 基 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A7/8 页 9 因的 C1498 。

37、细胞或未转染 WT1 基因的 C1498 细胞 ( 图 14)， 以图 13 和图 14 所示 E/T 比测定 特异性细胞溶解。 0106 如图 13 所示， Db126 肽特异性 CTL 溶解先天表达 WT1 的 FBL3 细胞， 不溶解不表达 WT1的RMA细胞。 而且如图14所示， 与不表达WT1的母C1498细胞相比， Db126肽特异性CTL 可以杀死转染小鼠 WT1 基因的 C1498 细胞。这样， 由于 CTL 引起的杀细胞可以确认靶向的 分子确实是 WT1 肽。这些结果表明 Db126 肽特异性 CTL 可以通过 WT1 蛋白质的细胞内加工 天然产生， 而且可以识别 WT1 表。

38、达细胞的 H-2Db分子上存在的 Db126 肽或有关的肽。 0107 实施例 7 0108 为了对 CTL 的细胞溶解活性是否为 MHC 限制性进行试验， 在 I 类 H-2 分子的抗体 存在下进行测定。也就是说， 在对 H-2Kb(28.13.3S)、 H-2Db(28.11.5S) 或 H-2Ld(MA143) 的 调整了效价的单克隆抗体存在下， 测定 Db126 肽特异性 CTL 引起的对于用 Db126 肽脉冲的 RMA-S 细胞的细胞溶解活性。使用同型的单克隆抗体作为对照单克隆抗体。 0109 结果如图 15 所示。随着 H-2Db的抗体浓度增加， 抑制 CTL 对于用 Db126。

39、 肽脉冲的 RMA-S 细胞的细胞溶解活性， 但是 H-2Kb或 H-2Ld的抗体不抑制 CTL 的细胞溶解活性。这些 结果表明 CTL 发挥 H-2Db限制性细胞溶解活性。 0110 实施例 8 0111 对于Db126肽引起的积极免疫是否会导致生物体内肿瘤免疫进行试验。 用Db126肽 脉冲的 LPS 活化脾细胞 ( 图 16 中的实线 )、 单纯 LPS 活化脾细胞 ( 网线 ) 或单纯磷酸缓冲 液 (PBS)( 虚线 ) 使小鼠 1 周免疫 1 次。进行 3 周的免疫后， 在腹腔内注射 3107个 FBL3 白血病细胞。 0112 结果如图 16 所示。用 Db126 肽免疫的小鼠克服。

40、了肿瘤挑战并生存下来， 非免疫小 鼠以及仅用 LPS 活化脾细胞免疫的小鼠不能拒绝肿瘤挑战而死亡。免疫小鼠和非免疫小鼠 两者均在上述腹腔内接种肿瘤细胞后 3 天观察到腹水。非免疫小鼠的腹水继续增加， 而且 小鼠死亡。 另一方面， 免疫小鼠的腹水缓慢减少， 小鼠完全拒绝肿瘤挑战， 并生存下来。 非免 疫小鼠时刻可以观察到自然的退化 (regression)。预测这种退化是特异性 CTL 对 Friend 白血病病毒 (FBL3 白血病细胞是由该病毒进行胞质转移形成的 ) 的自然诱导产生的。这是 因为这种 CTL 诱导在 C57BL/6 小鼠中时刻可以观察到。 0113 实施例 9DNA 疫苗 0。

41、114 给68周龄的C57BL/6小鼠每隔10天肌肉注射100g表达WT1的质粒DNA(将 小 鼠 WT1cDNA(Molecular and Cellular Biology， Vol.11， No.3， p.1701-1712(1991)， p.1709 的左栏 ) 的 Sau 3AI 片断连接在 CMV-IE 启动子上， 制作持续表达 WT1 的质粒 ) (Proc.Natl.Acod.Su， USA.， 92， 11105-11109(1995)， 共计 3 次。最后肌肉注射的 10 天后， 取出小鼠的脾， 调整脾细胞， 与表达WT1的mWT1C1498细胞(40Gy放射线照射)在37。

42、下共 同培养 6 天后， 使用表达 WT1 的 C1498(PM5G-mWT1) 和不表达 WT1 的 C1498(PM5G) 作为靶细 胞， 进行 Killing 分析 ( 用 Europium 标记 )。另外， C1498 是不表达 WT1 的小鼠骨髓性白血 病细胞株。 0115 诱导产生了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)， 它可以杀死表达WT1的C1498(PM5G-mWT1) 细胞， 但不杀死不表达 WT1 的细胞。 0116 结果如图 17 所示。 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A8/8 页 10 0117 作为对照， 进行与上述相同的试验， 用不表。

43、达 WT1( 不具有 WT1cDNA) 的质粒 代替表达 WT1 的质粒给小鼠肌肉注射。与上述试验同样采取脾细胞， 用表达 WT1 的 C1498(PM5G-mWT1) 体外刺激后， 进行 killing 分析。 0118 如图 18 所示， 不具有 WT1cDNA 的对照质粒 DNA 的肌肉注射没有诱导 WT1 蛋白特异 性 CTL。 0119 上述结果证明本发明的肽确实发挥癌抗原的作用， 诱导增殖针对癌细胞的杀伤 T 细胞 ( 癌细胞伤害性 T 细胞 )。因此， 本发明的癌抗原肽作为针对伴有 WT1 基因表达上升的 白血病和实体瘤的癌疫苗是有用的。 0120 本发明还包括下述内容 ： 01。

44、21 1、 癌抗原， 以癌抑制基因 WT1 的产物或其一部分肽作为活性成分。 0122 2、 如项目 1 所述的癌抗原， 以序列号 1 的氨基酸序列中包括用于与 MHC 分子结合 所必需的锚定氨基酸在内的 7 30 个连续氨基酸构成的肽为活性成分， 或者以序列号 2 的 氨基酸序列中包括用于与 MHC 分子结合所必需的锚定氨基酸在内的 7 30 个连续氨基酸 构成的肽作为活性成分。 0123 3、 如项目 1 或 2 所述的癌抗原， 所说的抗原是带来癌抑制基因 WT1 高度表达的癌 抗原。 0124 4、 如项目 1 或 2 所述的癌抗原， 所说的癌为白血病、 骨髓异形成综合症、 恶性淋巴 瘤。

45、、 多发性骨髓瘤、 胃癌、 大肠癌、 肺癌、 乳腺癌、 胚细胞癌、 肝癌、 皮肤癌、 膀胱癌、 前列腺癌、 子宫癌、 子宫颈癌或卵巢癌。 0125 5、 如项目 1 至 4 中任意一项所述的癌抗原， 所说的肽为以下任意一种 ： 0126 Kb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu( 序列号 3) 0127 Kb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu( 序列号 4) 0128 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5) 0129 Db 221 Tyr Ser Ser Asp。

46、 Asn Leu Tyr Gln Met( 序列号 6) 0130 Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu( 序列号 7) 0131 WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val( 序列号 8) 0132 6、 如项目 5 所述的癌抗原， 所说的肽为 0133 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu( 序列号 5) 或 0134 WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val( 序列号 8) 0135 7、 癌疫苗， 含有项目。

47、 1 至 6 中任意一项所述的癌抗原。 说 明 书 CN 102198266 A CN 102198270 A1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102198266 A CN 102198270 A2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 102198266 A CN 102198270 A3/3 页 13 序 列 表 CN 102198266 A CN 102198270 A1/16 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A2/16 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102。

48、198270 A3/16 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A4/16 页 17 图 4 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A5/16 页 18 图 5 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A6/16 页 19 图 6 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A7/16 页 20 图 7 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A8/16 页 21 图 8 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A9/16 页 22 图 9 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A10/16 页 23 图 10 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A11/16 页 24 图 11 说 明 书 附 图 CN 102198266 A CN 102198270 A12/16 页 25 图 12 说 明 书 附 图 CN 102198266 A。