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一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102763662 B (45)授权公告日 2013.12.25 CN 102763662 B *CN102763662B* (21)申请号 201210177845.9 (22)申请日 2012.05.31 A01N 47/18(2006.01) A01N 43/90(2006.01) A01N 43/653(2006.01) A01N 47/38(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人中国农业大学地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (。

2、72)发明人刘西莉王茜毕扬周俞辛陈磊胡健刘鹏飞 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基 (57) 摘要本发明公开了一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基。该培养基为如下或所示：、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的；、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的。本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养。

3、基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。 (51)Int.Cl. 审查员李雪娇权利要求书 1 页说明书 6 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书1页说明书6页附图3页 (10)授权公告号 CN 102763662 B CN 102763662 B *CN102763662B* 1/1 页 2 1. 一种杀菌剂，其活性成分为如下 1）或 2）所示： 1）由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成；所述苯醚甲环唑、。

4、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100）； 2）由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成；所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100）。 2. 根据权利要求 1 所述的杀菌剂，其特征在于：所述 1）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为 10 ： 10 ： 50 ： 50，或 15 ： 20 ： 70 ： 70，或 20 ： 50 ： 100 ： 100 ；所述 2）。

5、所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为为 10 ： 10 ： 50 ： 50，或 15 ： 20 ： 70 ： 70，或 20 ： 50 ： 100 ： 100。 3. 一种用于分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et a1) 的培养基，为如下或所示：、是向白云豆培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 1）所示杀菌剂得到的；所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-20g/mL ；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL ；所述利福平在所。

6、述白云豆培养基中的浓度为 50g/ mL-100g/mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL ；、是向白云豆培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 2）所示杀菌剂得到的；所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-20g/mL ；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL ；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/ mL-100g/mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL。 4. 根据权利要求 3 所述的培养基，其特征在于：所述所示培养基中，所述。

7、苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为； 10g/mL、 15g/mL 或 20g/mL ；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ；所述所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL、 15g/mL或20g/mL ；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为10g/mL、 20g/mL或 50g/mL ；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为。

8、 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL。 5. 权利要求 3 或 4 所述培养基在分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 中的应用。 6.一种分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法，包括如下步骤：用权利要求 3 或 4 所述培养基培养样本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述样本为感染荔枝霜疫霉病菌的植物的叶片或果实。权利要求书 CN 1027636。

9、62 B 2 1/6 页 3 一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基技术领域 0001 本发明涉及一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基。背景技术 0002 荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是著名的岭南佳果，在北纬 18 31均有种植，分布遍及海南、广西、云南、福建、贵州、四川、广东、台湾等8省区。 2008年全国种植面积约 900 万亩，超过约 820 万亩的荔枝，成为种植面积最大的热带水果。我国的荔枝产量超过全球产量的60。荔枝霜疫霉病是荔枝一种主要病害，该病害可以危害荔枝的花和果，花期发病，造成大量的枯花，幼果期发病，引起落果。

10、，成熟期发病，引起果实腐烂。在鲜果运输销售期，此病继续发展，也严重影响鲜果的贮运和外销，进而影响了荔枝产业的可持续稳定发展。药剂防治是目前防治该病最有效的方法之一。 0003 荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 以菌丝体和卵孢子在病叶、病果及土壤中越冬，为翌年的初侵染病源。翌年春末夏初产生孢子囊，随风雨传播，孢子囊产生的游动孢子侵入寄主叶片和果实为害。为了对荔枝霜疫霉病菌进行相关研究，以及调查病原菌的越冬菌量和田间发病情况，做好病害的预测预报，通过分离而获得纯化的荔枝霜疫霉病菌是必要的。 0004。

11、常规的病原菌分离方法是植病研究方法介绍的用 75乙醇和 01% 升汞液表面消毒处理。实际工作中，在实验室进行分离的样本往往不是新鲜样品，是经田间采样后存放有一定时间的病残体，这些荔枝病组织中就不可避免的常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌的生长较荔枝霜疫霉病菌迅速，杂菌的菌丝常将荔枝霜疫霉病菌覆盖，而快速生长的细菌也会抑制荔枝霜疫霉病菌的生长。 0005 传统病原菌分离方法中，利用普通培养基从病组织中分离荔枝霜疫霉时，采集的病组织若不消毒或是消毒时间短，造成培养时有杂菌污染，达不到分离纯化的目的。若消毒时间太长，往往在杀死。

12、杂菌的同时，也会把要分离的病原菌杀死，造成病原菌分离率往往不太高。发明内容 0006 本发明的一个目的是提供一种杀菌剂、用于分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 的培养基、和分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 的方法。 0007 本发明所提供的杀菌剂，其活性成分为如下 1）或 2）所示： 0008 1）由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成； 0009 2）由苯。

13、醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成。 0010 上述杀菌剂，所述 1）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100），具体为 10 ： 10 ： 50 ： 50，或 15 ： 20 ： 70 ： 70，或 20 ： 50 ： 100 ： 100 ；说明书 CN 102763662 B 3 2/6 页 4 0011 上述杀菌剂，所述 2）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：。

14、（50-100），具体为 10 ： 10 ： 50 ： 50，或 15 ： 20 ： 70 ： 70，或 20 ： 50 ： 100 ： 100。 0012 本发明所提供的用于分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 的培养基，为如下或所示： 0013 、是向白云豆培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 1）所示杀菌剂得到的； 0014 、是向白云豆培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 2）所示杀菌剂得到的。 0015 上述所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/ mL-20g/。

15、mL，具体为 10g/mL、 15g/mL 或 20g/mL ；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL，具体为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL，具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/ mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL，具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ； 0016 上述所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/ mL-20g/mL，具体为 10g/mL、。

16、 15g/mL 或 20g/mL ；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL，具体为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL，具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/ mL ；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL，具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL。 0017 上述培养基在分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 中的应用也属于本发明的保护范围。 00。

17、18 本发明所提供的分离荔枝霜疫霉病菌 (Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 的方法，包括如下步骤：用上述任一所述培养基培养样本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述样本为感染荔枝霜疫霉病菌的植物的叶片或果实。 0019 本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。附图说明 0020 图 1 为三种抗生素对植株叶片表面细菌。

18、的抑制作用。 0021 图 2 为三种抗生素对果皮表面的细菌抑制作用。 0022 图 3 为荔枝霜疫霉病的症状（摄于广西北流）具体实施方式 0023 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0024 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0025 多菌灵原药购自安徽广信农化股份有限公司（安徽广信农化集团有限公司），其主要活性成分物质的化学名称是 N （2 苯骈咪唑基）氨基甲酸甲酯，通用名称为多菌灵，说明书 CN 102763662 B 4 3/6 页 5 分子式： C9H9N3O2。该药中主要活性成分物质的质量百分。

19、含量为 98.9 。 0026 苯醚甲环唑原药购自杭州宇龙化工有限公司。其主要活性成分物质的化学名称是顺，反 -3- 氯 -4-4- 甲基 -2-1H-1,2,4- 三唑 -1- 基甲基 )-1,3- 二哑戊烷 -2- 基 ) 苯基 4- 氯苯基醚 ( 顺，反比例约为 45:55)，通用名称是苯醚甲环唑。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为 96 。 0027 咪鲜胺原药（又叫咪鲜胺）购自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是 N- 丙基 -N-2-(2,4,6- 三氯苯氧基 ) 乙基 - 咪唑 -1- 甲酰胺，分子式： C15H16Cl3N3O2。。

20、该药中咪鲜胺的质量百分含量为 97 。 0028 青霉素、利福平、氯霉素、链霉素、硫酸新霉素和盐酸四环素均购自北京拓英坊科技有限公司。 0029 实施例 1、不同浓度的三种真菌抑制剂和六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用 0030 一、不同浓度的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用 0031 以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂，以丙铜或甲醇为苯醚甲环唑和咪鲜胺的溶剂，分别配制 5000g/mL 的三种药剂母液 10ml，三种药剂的称量量依次为 50.6mg、 52.0mg 和 51.5mg ；将这三种母液分别配制系列浓度为 50g/mL、 20g/mL 和 10g/mL 的多菌灵，。

21、咪鲜胺和苯醚甲环唑的带毒白云豆平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定荔枝霜疫霉对三种真菌抑制剂的敏感性。将荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于 25预培养 7d，用直径为 5mm 的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有三种药剂系列浓度的白云豆带毒平板中央（各浓度含等量有机溶剂），于 25下黑暗培养， 7d 后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径（菌落直径减去菌饼直径 5mm），每处理重复 3 次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率（%），抑制率 ( )=（对照菌落增长直径 - 处理菌落增长直径） /（。

22、对照菌落增长直径） 100。 0032 测定了供试的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的毒力，结果如表 1 所示，不同浓度的多菌灵对荔枝霜疫霉的抑制率均低于 10%，因此可以采用 10-50g/mL 的多菌灵作为选择性药剂；苯醚甲环唑 50g/mL 浓度的药剂对荔枝霜疫霉的抑制率在 20% 左右， 20g/mL 浓度的苯醚甲环唑对荔枝霜疫霉的生长反而有促进作用， 10g/mL 的浓度对荔枝霜疫霉也没有抑制作用，因此，可以采用 10-20g/mL 浓度的苯醚甲环唑作为选择性药剂；咪鲜胺 50g/mL 浓度的药剂对荔枝霜疫霉有促进作用，抑制率为 -68.7%。20 和 10g/m。

23、L 浓度的咪鲜胺对荔枝霜疫霉均没有抑制作用，所以也可以采用 10-50g/mL 的咪鲜胺为分离荔枝霜疫霉中使用的选择性药剂。 0033 表 1 三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用 0034 0035 二、不同浓度的六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用 0036 用灭菌水将六种抗生素均配制成 5104g/mL 的母液，将六种母液分别配制成浓度为 100g/mL、 50g/mL 的利福平、青霉素和氯霉素， 50g/mL 的链霉素， 30g/mL 和说明书 CN 102763662 B 5 4/6 页 6 20g/mL 的盐酸四环素， 100g/mL、 50g/mL 和 30g/m。

24、L 的硫酸新霉素的含药白云豆平板，以加有无菌水的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定荔枝霜疫霉对六种抗生素的敏感性。将荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于 25预培养 7d，用直径为 5mm 的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有六种药剂系列浓度的白云豆带毒平板中央（各浓度含等量无菌水），于 25下黑暗培养， 7d 后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径（菌落直径减去菌饼直径 5mm），每处理重复 3 次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率（%），抑制率 ( )=（对照菌落增长直径 - 处理菌落增长直径） /（对。

25、照菌落增长直径） 100。 0037 测定了不同浓度的六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用，结果见表 2，浓度为 100 和 50g/mL 的青霉素、利福平和氯霉素对荔枝霜疫霉均没有明显的抑制作用；而浓度为 30 和 20g/mL 盐酸四环素对荔枝霜疫霉均具有很强的抑制作用，抑制率可以达到 80% ；浓度为30g/mL、 50g/mL和100g/mL的硫酸新霉素药剂对荔枝霜疫霉都具有很强的抑制作用，最高可以达到 66.9%。链霉素对于荔枝霜疫霉具有很强的抑制作用，不能作为选择性药剂使用。综上所述，初步明确可以使用 50-100g/mL 的青霉素、利福平和氯霉素作为分离。

26、纯化荔枝霜疫霉选择性培养基中的抗生素成份。并拟进一步测定三种抗生素对环境中带菌土壤和辣椒组织上携带的细菌的抑制作用。 0038 表 2 使用六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用 0039 0040 实施例 2、三种抗生素对环境中细菌的抑制作用 0041 此试验是在实施例 1 结果的基础上对所选择的三种抗生素的检测。检验当采用对荔枝霜疫霉无抑制作用的抗生素浓度时，是否会有效抑制环境中的细菌。对于环境中细菌的检测，主要针对来自植株叶片以及发病果实果皮上的细菌，这是根据荔枝霜疫霉病菌的分离部位主要是病叶、病果决定的。首先，是对荔枝叶片表面细菌的抑制作用： 5 点取样法随机采取。

27、10 片荔枝叶片，剪碎放入 50ml 离心管中，加入 15ml 灭菌水， 200r/min 振荡 2 分钟，过滤取滤液，使用无菌水稀释 100，分别取 100l 涂布在 100g/mL、 50g/mL 的利福平、青霉素和氯霉素带毒白云豆平板上，以不带毒平板为对照，每处理 3 个重复， 2 天后观察其抑菌作用；然后从荔枝疫病发病严重的田间取 5 个病果，剥取果皮放入三角瓶中加入 100ml灭菌水， 200r/min振荡20min，取上清100l涂布在100g/mL、 50g/mL的利福平、青霉素和氯霉素的带毒白云豆平板上，以不带毒平板为对照，每处理 3 个重复。

28、， 2 天后观察上面的细菌形态以及菌落数的多少，以判断抗生素对环境中细菌的抑制作用。 0042 本研究在表 2 结果的基础之上，将初步选择可用的抗生素进行了其对叶片和果实上细菌的抑制作用试验，两个研究的结果一致，从图1和图2可以看出，与对照相比，青霉素和利福平的抑菌活性较强，可以基本达到抑菌的作用，由于环境中细菌种类的多样性，青霉素主要对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，所以可以看到图1和2中有少许零星菌落，判断说明书 CN 102763662 B 6 5/6 页 7 其为革兰氏阴性菌。而利福平杀菌谱广，从图1和2中可以看到，平板中只有少许真菌菌落；而。

29、图 1 和 2 表明，氯霉素抑菌活性差，在其浓度达到 100g/mL 时，与对照相比，抑菌效果不明显。因此，利福平可以配合青霉素使用，以达到更好的抑菌作用； 0043 综上所述，本发明筛选药剂的原则是对荔枝霜疫霉抑制率小于 20% 的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以看出，应用于从田间一次性分离荔枝霜疫霉菌的选择性培养基，可以选择的真菌抑制剂为多菌灵、苯醚甲环唑和咪鲜胺，浓度均为 10-50g/mL ；可以选择的抗生素类为青霉素和利福平，浓度均可采用 50-100g/mL。 0044 实施例 3、用。

30、于分离荔枝霜疫霉病菌的白云豆选择培养基 0045 一、分离方法 0046 于 2009， 2010 年从福建、广东和海南在荔枝霜疫霉病发病严重地区采集病样，用于荔枝霜疫霉分离。田间辣椒疫霉的发病情况如图 2 所示。A. 叶片受害时，初期呈褐色小斑点，后逐步扩大为不规则黄褐色病斑，干枯死亡，造成大量落叶。 B.果实受害时，病斑多自果蒂开始发生，褐色呈不规则形，无明显边缘，潮湿时长出像霜一样的白色霉层。 0047 荔枝霜疫霉的分离方法按下述方法进行：在同一地区选择不同的田块，根据当地的发病严重程度采集荔枝霜疫霉病样（叶片、果实）进行分离。 0048 分离步。

31、骤：将发病叶片使用清水清理干净后充分晾干，切取病健交界处的小块组织接种在本发明的选择性培养基上，或将新鲜病果上的白色霜层即孢子囊挑至至本发明的选择性白云豆培养基上， 25黑暗培养，至有菌丝长出；如病果上的白色霜层不明显，可放于 4冰箱 1 天后于 25培养箱培养，出现霜层后立即按照上述方法分离。挑取菌丝转接到普通白云豆培养基上培养，待长满皿后置于 25下光暗交替培养 7 天左右，诱导其产生孢子囊；加入灭菌水于培养皿中，将其置于15光照处理60min后游动孢子释放；挑单游动孢子置于普通白云豆培养基上培养，至长出菌落，得到荔枝霜疫霉。对得到的荔枝霜。

32、疫霉进行鉴定。将真正的荔枝霜疫霉菌落保存在 PDA 试管斜面上，加适量的灭菌石蜡油置于室温下保存备用。 0049 用现有的荔枝霜疫霉病菌的鉴定进行鉴定。 0050 二、分离使用的培养基： 0051 （一）白云豆培养基：白云豆粉 60g、琼脂粉 12.5g，加蒸馏水定容至 1000mL，高压蒸汽灭菌， 121 C， 20min。 0052 （二）白云豆选择培养基 0053 对叶片或果实均使用如下培养基。 0054 在没有对多菌灵产生抗性的区域使用如下培养基： 0055 白云豆选择培养基：向未冷却的白云豆培养基中添加苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素，并用未。

33、冷却的白云豆培养基定容至 1 升；苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 15g/mL，多菌灵在白云豆选择培养基中的浓度为 20g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 70g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为 70g/ mL。 0056 白云豆选择培养基：与白云豆选择培养基基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 10g/mL，多菌灵在白云豆选择培养基中的浓度说明书 CN 102763662 B 7 6/6 页 8 为 10g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 50g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为。

34、50g/mL。 0057 白云豆选择培养基：与白云豆选择培养基基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 20g/mL，多菌灵在白云豆选择培养基中的浓度为 50g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 100g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为 100g/mL。 0058 在对多菌灵产生抗性的区域使用如下培养基： 0059 白云豆选择培养基：向未冷却的白云豆培养基中添加苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素，并用未冷却的白云豆培养基定容至 1 升；苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 15g/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养。

35、基中的浓度为 20g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 70g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为 70g/ mL。 0060 白云豆选择培养基：与白云豆选择培养基基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 10g/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养基中的浓度为 10g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 50g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为 50g/mL。 0061 白云豆选择培养基：与白云豆选择培养基基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基中的浓度为 20g/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养基中。

36、的浓度为 50g/mL，利福平在白云豆选择培养基中的浓度为 100g/mL，青霉素在白云豆选择培养基中的浓度为 100g/mL。 0062 三、分离及鉴定结果 0063 在进行如上各分离的过程中，白云豆选择培养基中均没有杂菌长出，只有荔枝霜疫霉病菌能生长，说明本发明的白云豆选择培养基抑制了杂菌生长，使荔枝霜疫霉病菌的分离更容易。本发明方法从开始将病变组织接种至选择性培养基上至有荔枝霜疫霉菌丝长出，一般只需要 3-4 天，大大缩短了分离时间，提高了分离效率。分离时间缩短，主要是因为本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生长，使荔枝霜疫霉病菌在培养基中。

37、成为优势菌群，生长速度提高，从而加快了分离进程。 0064 从上述省市的荔枝霜疫霉病发病严重地区的病组织中共分离得到 68 株株荔枝霜疫霉病菌。均经过鉴定，且均为荔枝霜疫霉病菌。 0065 本发明针对目前不易直接从病残体中分离获得纯化的荔枝霜疫霉病菌，而传统病原菌分离纯化方法的过程繁琐，消毒时间难以控制，分离率低以及现有方法由于采用药剂杀菌谱范围小及药剂浓度不合适的问题，研发出了可一次性从田间分离荔枝霜疫霉的杀菌剂组合物，根据荔枝霜疫霉分离部位和采样地区施药历史的不同，用于荔枝霜疫霉分离培养的杀菌剂组合物中以真菌抑制剂苯醚甲环唑和细菌抑制剂利福平为主，加入的其它真菌抑制剂和细菌抑制剂（抗生素）可以有不同的组合。可选择的真菌抑制剂为咪鲜胺或多菌灵，浓度均为 10-50g/mL ；可以选择的抗生素类细菌抑制剂为青霉素，浓度为 50-100g/ mL。说明书 CN 102763662 B 8 1/3 页 9 图 1 说明书附图 CN 102763662 B 9 2/3 页 10 图 2 说明书附图 CN 102763662 B 10 3/3 页 11 图 3 说明书附图 CN 102763662 B 11 。

摘要
申请专利号：	CN201210177845.9	申请日：	20120531
公开号：	CN102763662B	公开日：	20131225
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A01N47/18,A01N43/90,A01N43/653,A01N47/38,A01P1/00,C12N1/14,C12R1/645	主分类号：	A01N47/18,A01N43/90,A01N43/653,A01N47/38,A01P1/00,C12N1/14,C12R1/645
申请人：	中国农业大学
发明人：	刘西莉,王茜,毕扬,周俞辛,陈磊,胡健,刘鹏飞
地址：	100193 北京市海淀区圆明园西路2号
优先权：	CN201210177845A
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司	代理人：	关畅
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内容摘要

本发明公开了一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基。该培养基为如下Ⅰ或Ⅱ所示：Ⅰ、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的；Ⅱ、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的。本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。

权利要求书

1.一种杀菌剂，其活性成分为如下1）或2）所示：1）由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成；所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100）；2）由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成；所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100）。 2.根据权利要求1所述的杀菌剂，其特征在于：所述1）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为10：10：50：50，或15：20：70：70，或20：50：100：100；所述2）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为为10：10：50：50，或15：20：70：70，或20：50：100：100。 3.一种用于分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et a1)的培养基，为如下Ⅰ或Ⅱ所示：Ⅰ、是向白云豆培养基中添加权利要求1或2中所述1）所示杀菌剂得到的；所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-20μg/mL；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL；Ⅱ、是向白云豆培养基中添加权利要求1或2中所述2）所示杀菌剂得到的；所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-20μg/mL；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL。 4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述Ⅰ所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为；10μg/mL、15μg/mL或20μg/mL；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL、20μg/mL或50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL、70μg/mL或100μg/mL；所述Ⅱ所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL、15μg/mL或20μg/mL；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL、20μg/mL或50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL、70μg/mL或100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL、70μg/mL或100μg/mL。 5.权利要求3或4所述培养基在分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)中的应用。 6.一种分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法，包括如下步骤：用权利要求3或4所述培养基培养样本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述样本为感染荔枝霜疫霉病菌的植物的叶片或果实。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基。

背景技术

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是著名的岭南佳果，在北纬18°～31°均有种植，分布遍及海南、广西、云南、福建、贵州、四川、广东、台湾等8省区。2008年全国种植面积约900万亩，超过约820万亩的荔枝，成为种植面积最大的热带水果。我国的荔枝产量超过全球产量的60％。荔枝霜疫霉病是荔枝一种主要病害，该病害可以危害荔枝的花和果，花期发病，造成大量的枯花，幼果期发病，引起落果，成熟期发病，引起果实腐烂。在鲜果运输销售期，此病继续发展，也严重影响鲜果的贮运和外销，进而影响了荔枝产业的可持续稳定发展。药剂防治是目前防治该病最有效的方法之一。

荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)以菌丝体和卵孢子在病叶、病果及土壤中越冬，为翌年的初侵染病源。翌年春末夏初产生孢子囊，随风雨传播，孢子囊产生的游动孢子侵入寄主叶片和果实为害。为了对荔枝霜疫霉病菌进行相关研究，以及调查病原菌的越冬菌量和田间发病情况，做好病害的预测预报，通过分离而获得纯化的荔枝霜疫霉病菌是必要的。

常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75％乙醇和0．1%升汞液表面消毒处理。实际工作中，在实验室进行分离的样本往往不是新鲜样品，是经田间采样后存放有一定时间的病残体，这些荔枝病组织中就不可避免的常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌的生长较荔枝霜疫霉病菌迅速，杂菌的菌丝常将荔枝霜疫霉病菌覆盖，而快速生长的细菌也会抑制荔枝霜疫霉病菌的生长。

传统病原菌分离方法中，利用普通培养基从病组织中分离荔枝霜疫霉时，采集的病组织若不消毒或是消毒时间短，造成培养时有杂菌污染，达不到分离纯化的目的。若消毒时间太长，往往在杀死杂菌的同时，也会把要分离的病原菌杀死，造成病原菌分离率往往不太高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种杀菌剂、用于分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培养基、和分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法。

本发明所提供的杀菌剂，其活性成分为如下1）或2）所示：

1）由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成；

2）由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成。

上述杀菌剂，所述1）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100），具体为10：10：50：50，或15：20：70：70，或20：50：100：100；

上述杀菌剂，所述2）所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为（10-20）：（10-50）：（50-100）：（50-100），具体为10：10：50：50，或15：20：70：70，或20：50：100：100。

本发明所提供的用于分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al) 的培养基，为如下Ⅰ或Ⅱ所示：

Ⅰ、是向白云豆培养基中添加权利要求1或2中所述1）所示杀菌剂得到的；

Ⅱ、是向白云豆培养基中添加权利要求1或2中所述2）所示杀菌剂得到的。

上述Ⅰ所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10μg/mL-20μg/mL，具体为10μg/mL、15μg/mL或20μg/mL；所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-50μg/mL，具体为10μg/mL、20μg/mL或50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL，具体为50μg/mL、 70μg/mL或100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50μg/mL-100μg/mL，具体为50μg/mL、70μg/mL或100μg/mL；

上述Ⅱ所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为 10μg/mL-20μg/mL，具体为10μg/mL、15μg/mL或20μg/mL；所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为10μg/mL-50μg/mL，具体为10μg/mL、20μg/mL或50μg/mL；所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50μg/mL-100μg/mL，具体为50μg/mL、 70μg/mL或100μg/mL；所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为 50μg/mL-100μg/mL，具体为50μg/mL、70μg/mL或100μg/mL。

上述培养基在分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法，包括如下步骤：用上述任一所述培养基培养样本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述样本为感染荔枝霜疫霉病菌的植物的叶片或果实。

本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。

附图说明

图1为三种抗生素对植株叶片表面细菌的抑制作用。

图2为三种抗生素对果皮表面的细菌抑制作用。

图3为荔枝霜疫霉病的症状（摄于广西北流）

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

多菌灵原药购自安徽广信农化股份有限公司（安徽广信农化集团有限公司），其主要活性成分物质的化学名称是N－（2－苯骈咪唑基）－氨基甲酸甲酯，通用名称为多菌灵，分子式：C9H9N3O2。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为98.9﹪。

苯醚甲环唑原药购自杭州宇龙化工有限公司。其主要活性成分物质的化学名称是顺，反-3-氯-4-[4-甲基-2-1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-二哑戊烷-2-基)苯基4-氯苯基醚(顺，反比例约为45:55)，通用名称是苯醚甲环唑。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为96﹪。

咪鲜胺原药（又叫咪鲜胺）购自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-1-甲酰胺，分子式： C15H16Cl3N3O2。该药中咪鲜胺的质量百分含量为97﹪。

青霉素、利福平、氯霉素、链霉素、硫酸新霉素和盐酸四环素均购自北京拓英坊科技有限公司。

实施例1、不同浓度的三种真菌抑制剂和六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用

一、不同浓度的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用

以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂，以丙铜或甲醇为苯醚甲环唑和咪鲜胺的溶剂，分别配制5000μg/mL的三种药剂母液10ml，三种药剂的称量量依次为50.6mg、52.0mg 和51.5mg；将这三种母液分别配制系列浓度为50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的多菌灵，咪鲜胺和苯醚甲环唑的带毒白云豆平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定荔枝霜疫霉对三种真菌抑制剂的敏感性。将荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于25℃预培养7d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有三种药剂系列浓度的白云豆带毒平板中央（各浓度含等量有机溶剂），于25℃下黑暗培养，7d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径（菌落直径减去菌饼直径5mm），每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率（%），抑制率(％)=[（对照菌落增长直径-处理菌落增长直径） /（对照菌落增长直径）]×100。

测定了供试的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的毒力，结果如表1所示，不同浓度的多菌灵对荔枝霜疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50μg/mL的多菌灵作为选择性药剂；苯醚甲环唑50μg/mL浓度的药剂对荔枝霜疫霉的抑制率在20%左右， 20μg/mL浓度的苯醚甲环唑对荔枝霜疫霉的生长反而有促进作用，10μg/mL的浓度对荔枝霜疫霉也没有抑制作用，因此，可以采用10-20μg/mL浓度的苯醚甲环唑作为选择性药剂；咪鲜胺50μg/mL浓度的药剂对荔枝霜疫霉有促进作用，抑制率为-68.7%。20 和10μg/mL浓度的咪鲜胺对荔枝霜疫霉均没有抑制作用，所以也可以采用10-50μg/mL 的咪鲜胺为分离荔枝霜疫霉中使用的选择性药剂。

表1三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用

二、不同浓度的六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用

用灭菌水将六种抗生素均配制成5×104μg/mL的母液，将六种母液分别配制成浓度为100μg/mL、50μg/mL的利福平、青霉素和氯霉素，50μg/mL的链霉素，30μg/mL 和20μg/mL的盐酸四环素，100μg/mL、50μg/mL和30μg/mL的硫酸新霉素的含药白云豆平板，以加有无菌水的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定荔枝霜疫霉对六种抗生素的敏感性。将荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于25℃预培养7d，用直径为 5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有六种药剂系列浓度的白云豆带毒平板中央（各浓度含等量无菌水），于25℃下黑暗培养，7d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径（菌落直径减去菌饼直径5mm），每处理重复3 次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率（%），抑制率(％)= [（对照菌落增长直径-处理菌落增长直径）/（对照菌落增长直径）]×100。

测定了不同浓度的六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用，结果见表2，浓度为100 和50μg/mL的青霉素、利福平和氯霉素对荔枝霜疫霉均没有明显的抑制作用；而浓度为30和20μg/mL盐酸四环素对荔枝霜疫霉均具有很强的抑制作用，抑制率可以达到 80%；浓度为30μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的硫酸新霉素药剂对荔枝霜疫霉都具有很强的抑制作用，最高可以达到66.9%。链霉素对于荔枝霜疫霉具有很强的抑制作用，不能作为选择性药剂使用。综上所述，初步明确可以使用50-100μg/mL的青霉素、利福平和氯霉素作为分离纯化荔枝霜疫霉选择性培养基中的抗生素成份。并拟进一步测定三种抗生素对环境中带菌土壤和辣椒组织上携带的细菌的抑制作用。

表2使用六种抗生素对荔枝霜疫霉的抑制作用

实施例2、三种抗生素对环境中细菌的抑制作用

此试验是在实施例1结果的基础上对所选择的三种抗生素的检测。检验当采用对荔枝霜疫霉无抑制作用的抗生素浓度时，是否会有效抑制环境中的细菌。对于环境中细菌的检测，主要针对来自植株叶片以及发病果实果皮上的细菌，这是根据荔枝霜疫霉病菌的分离部位主要是病叶、病果决定的。首先，是对荔枝叶片表面细菌的抑制作用：5点取样法随机采取10片荔枝叶片，剪碎放入50ml离心管中，加入15ml灭菌水， 200r/min振荡2分钟，过滤取滤液，使用无菌水稀释100×，分别取100μl涂布在 100μg/mL、50μg/mL的利福平、青霉素和氯霉素带毒白云豆平板上，以不带毒平板为对照，每处理3个重复，2天后观察其抑菌作用；然后从荔枝疫病发病严重的田间取5 个病果，剥取果皮放入三角瓶中加入100ml灭菌水，200r/min振荡20min，取上清100μl 涂布在100μg/mL、50μg/mL的利福平、青霉素和氯霉素的带毒白云豆平板上，以不带毒平板为对照，每处理3个重复，2天后观察上面的细菌形态以及菌落数的多少，以判断抗生素对环境中细菌的抑制作用。

本研究在表2结果的基础之上，将初步选择可用的抗生素进行了其对叶片和果实上细菌的抑制作用试验，两个研究的结果一致，从图1和图2可以看出，与对照相比，青霉素和利福平的抑菌活性较强，可以基本达到抑菌的作用，由于环境中细菌种类的多样性，青霉素主要对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，所以可以看到图1和2中有少许零星菌落，判断其为革兰氏阴性菌。而利福平杀菌谱广，从图1和2中可以看到，平板中只有少许真菌菌落；而图1和2表明，氯霉素抑菌活性差，在其浓度达到 100μg/mL时，与对照相比，抑菌效果不明显。因此，利福平可以配合青霉素使用，以达到更好的抑菌作用；

综上所述，本发明筛选药剂的原则是对荔枝霜疫霉抑制率小于20%的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以看出，应用于从田间一次性分离荔枝霜疫霉菌的选择性培养基，可以选择的真菌抑制剂为多菌灵、苯醚甲环唑和咪鲜胺，浓度均为10-50μg/mL；可以选择的抗生素类为青霉素和利福平，浓度均可采用50-100μg/mL。

实施例3、用于分离荔枝霜疫霉病菌的白云豆选择培养基

一、分离方法

于2009，2010年从福建、广东和海南在荔枝霜疫霉病发病严重地区采集病样，用于荔枝霜疫霉分离。田间辣椒疫霉的发病情况如图2所示。A.叶片受害时，初期呈褐色小斑点，后逐步扩大为不规则黄褐色病斑，干枯死亡，造成大量落叶。B.果实受害时，病斑多自果蒂开始发生，褐色呈不规则形，无明显边缘，潮湿时长出像霜一样的白色霉层。

荔枝霜疫霉的分离方法按下述方法进行：在同一地区选择不同的田块，根据当地的发病严重程度采集荔枝霜疫霉病样（叶片、果实）进行分离。

分离步骤：将发病叶片使用清水清理干净后充分晾干，切取病健交界处的小块组织接种在本发明的选择性培养基上，或将新鲜病果上的白色霜层即孢子囊挑至至本发明的选择性白云豆培养基上，25℃黑暗培养，至有菌丝长出；如病果上的白色霜层不明显，可放于4℃冰箱1天后于25℃培养箱培养，出现霜层后立即按照上述方法分离。挑取菌丝转接到普通白云豆培养基上培养，待长满皿后置于25℃下光暗交替培养7天左右，诱导其产生孢子囊；加入灭菌水于培养皿中，将其置于15℃光照处理60min 后游动孢子释放；挑单游动孢子置于普通白云豆培养基上培养，至长出菌落，得到荔枝霜疫霉。对得到的荔枝霜疫霉进行鉴定。将真正的荔枝霜疫霉菌落保存在PDA试管斜面上，加适量的灭菌石蜡油置于室温下保存备用。

用现有的荔枝霜疫霉病菌的鉴定进行鉴定。

二、分离使用的培养基：

（一）白云豆培养基：白云豆粉60g、琼脂粉12.5g，加蒸馏水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121°C，20min。

（二）白云豆选择培养基

对叶片或果实均使用如下培养基。

在没有对多菌灵产生抗性的区域使用如下培养基：

白云豆选择培养基Ⅰ：向未冷却的白云豆培养基中添加苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素，并用未冷却的白云豆培养基定容至1升；苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为15μg/mL，多菌灵在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为20μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为70μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为70μg/mL。

白云豆选择培养基Ⅱ：与白云豆选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为10μg/mL，多菌灵在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为10μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为50μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为50μg/mL。

白云豆选择培养基Ⅲ：与白云豆选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为20μg/mL，多菌灵在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为50μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为100μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为100μg/mL。

在对多菌灵产生抗性的区域使用如下培养基：

白云豆选择培养基Ⅰ：向未冷却的白云豆培养基中添加苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素，并用未冷却的白云豆培养基定容至1升；苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为15μg/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为20μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为70μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅰ中的浓度为70μg/mL。

白云豆选择培养基Ⅱ：与白云豆选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为10μg/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为10μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为50μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅱ中的浓度为50μg/mL。

白云豆选择培养基Ⅲ：与白云豆选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于：苯醚甲环唑在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为20μg/mL，咪鲜胺在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为50μg/mL，利福平在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为100μg/mL，青霉素在白云豆选择培养基Ⅲ中的浓度为100μg/mL。

三、分离及鉴定结果

在进行如上各分离的过程中，白云豆选择培养基中均没有杂菌长出，只有荔枝霜疫霉病菌能生长，说明本发明的白云豆选择培养基抑制了杂菌生长，使荔枝霜疫霉病菌的分离更容易。本发明方法从开始将病变组织接种至选择性培养基上至有荔枝霜疫霉菌丝长出，一般只需要3-4天，大大缩短了分离时间，提高了分离效率。分离时间缩短，主要是因为本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生长，使荔枝霜疫霉病菌在培养基中成为优势菌群，生长速度提高，从而加快了分离进程。

从上述省市的荔枝霜疫霉病发病严重地区的病组织中共分离得到68株株荔枝霜疫霉病菌。均经过鉴定，且均为荔枝霜疫霉病菌。

本发明针对目前不易直接从病残体中分离获得纯化的荔枝霜疫霉病菌，而传统病原菌分离纯化方法的过程繁琐，消毒时间难以控制，分离率低以及现有方法由于采用药剂杀菌谱范围小及药剂浓度不合适的问题，研发出了可一次性从田间分离荔枝霜疫霉的杀菌剂组合物，根据荔枝霜疫霉分离部位和采样地区施药历史的不同，用于荔枝霜疫霉分离培养的杀菌剂组合物中以真菌抑制剂苯醚甲环唑和细菌抑制剂利福平为主，加入的其它真菌抑制剂和细菌抑制剂（抗生素）可以有不同的组合。可选择的真菌抑制剂为咪鲜胺或多菌灵，浓度均为10-50μg/mL；可以选择的抗生素类细菌抑制剂为青霉素，浓度为50-100μg/mL。