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一种铁皮石斛的组织培养方法.pdf

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文档编号：6679544

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1、(10)申请公布号 CN 102948368 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102948368 A *CN102948368A* (21)申请号 201210452289.1 (22)申请日 2012.11.13 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人安徽新津铁皮石斛开发有限公司地址 242300 安徽省宣城市宁国市经济开发区科技创业服务中心三楼 (72)发明人张建民朱新明 (74)专利代理机构安徽合肥华信知识产权代理有限公司 34112 代理人余成俊 (54) 发明名称一种铁皮石斛的组织培养方法 (57) 摘要本发明公开了一种铁皮石斛的。

2、组织培养方法，包括以下步骤：首先在播种培养基中黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发 25 35 天后，转接入原球茎增殖培养基中增殖培养 25 35 天，然后依次经过原球茎分化培养基中分化培养 40 50 天，继代培养基中继代培养 55 65 天，壮苗培养基中壮苗培养 55 65 天和生根培养基中生根培养4050天，本发明铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制，铁皮石斛种子无菌萌发率高达 96.8% 以上；本发明提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量。。

3、 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、播种：选取 4-6 个月龄的饱满蒴果，用 75% 酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为： 1/2MS+ 白糖 2%+ 马铃薯汁 15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发 25 35 天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达 96.30% ；（2）、原球茎增殖和分化：将。

4、步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养2535天，所述的原球茎增殖培养基配方为： 1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养 40 50 天，所述的原球茎分化培养基的配方为： 1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L） + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10% ；（3）、继代培养：将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养 55 65 天，所述的继代培养基的配方为： B5培养基 + 萘乙酸（0.5-1.。

5、0mg/L） + 白糖 2% ；（4）、壮苗生根培养：将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养 55 65 天，所述的壮苗培养基的配方为： B5培养基 + 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2% ；然后再接入生根培养基中生根培养 40 50 天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为： 1/2MS + 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2% ；所述的所有培养基均附加活性炭 0.5， pH 值调为 6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux， 10-12h/d）、温度 252、湿度 60-80%。 2. 根据权利要。

6、求 1 所述的铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于：所述的 MS 培养基的配方（mg/L）为： KNO3 1900 ； NH4NO3 1650 ； KH2PO4 170 ； MgSO47H2O 370 ； CaCl22 H2O 440 ； KI 0.83 ； H3BO3 6.20 ； MnSO44H2O 22.3 ； ZnSO47H2O 8.60 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H2O 37.30 ； FeSO47 H2O 27.80 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2.00 ；。

7、盐酸硫胺素 0.10 ；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50。 3. 根据权利要求 1 所述的铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于：所述的 B5培养基的配方（mg/L）为： KNO3 2500 ； (NH4)2SO4 134 ； NaH2PO4H2O 150 ； MgSO47 H2O 250 ； CaCl22 H2O 150 ； KI 0.75 ； H3BO3 3.0 ； MnSO44 H2O 10 ； ZnSO47H2O 2.0 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H2O 37.3。

8、； FeSO47 H2O 27.8 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2 ；盐酸硫胺素 0.1 ；盐酸吡哆醇 0.5 和烟酸 0.5。权利要求书 CN 102948368 A 2 1/3 页 3 一种铁皮石斛的组织培养方法技术领域 0001 本发明涉及一种铁皮石斛栽培方法技术，具体涉及一种铁皮石斛的组织培养方法。背景技术 0002 铁皮石斛是著名的石斛品种，具有独特的药用价值。秦汉时期的神农本草经记载铁皮石斛 “主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃” ；现代化学和药理研究表明，铁皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高达20%30%。

9、。因其所含的石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等成分具有增强机体的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，养阴生津，强肾益精，抑制肿瘤细胞，缓解体力疲劳等独特功效。但是由于野生铁皮石斛主要生长在崇山峻岭的悬崖峭壁之上，因其种子极小，每个蒴果含有大约 2000 粒种子，细如粉尘且无胚乳，在自然条件下萌发率极低，自然资源十分稀少。加上常年无节制采掘，野生资源日渐枯竭，自然产量不能满足目前市场需求。本申请人通过现代生物工程植物组织培养技术，实现了铁皮石斛种质资源的保护和种苗优质快繁，实现了铁皮石斛的合理生产开发应用。 0003 目前均采用植物组织培养技。

10、术快速繁育大量优质铁皮石斛组培苗，在不同的生产阶段调整培养基的营养成分。本发明所要解决的技术问题之一是在于提供一种铁皮石斛试管苗的快速繁育方法。发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种铁皮石斛的组织培养方法。 0005 本发明采用如下技术方案：铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：（1）、播种：选取 4-6 个月龄的饱满蒴果，用 75% 酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为： 1/2MS+ 白糖 2%+ 马铃薯汁 15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发 25 35 天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种。

11、子萌发率可达 96.30% ；（2）、原球茎增殖和分化：将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养2535天，所述的原球茎增殖培养基配方为： 1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养 40 50 天，所述的原球茎分化培养基的配方为： 1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L） + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10% ；（3）、继代培养：将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养 55 65 天，所。

12、述的继代培养基的配方为： B5培养基 + 萘乙酸（0.5-1.0mg/L） + 白糖 2% ；（4）、壮苗生根培养：说明书 CN 102948368 A 3 2/3 页 4 将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养 55 65 天，所述的壮苗培养基的配方为： B5培养基 + 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2% ；然后再接入生根培养基中生根培养 40 50 天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为： 1/2MS + 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2%。 0006 所述的所有培养基均附加活性炭 0.5， pH 值调为 6.1-。

13、6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux， 10-12h/d）、温度 252、湿度 60-80%。 0007 所述的 MS 培养基的配方（mg/L）为： KNO3 1900 ； NH4NO3 1650 ； KH2PO4 170 ； MgSO47H2O 370 ； CaCl22 H2O 440 ； KI 0.83 ； H3BO3 6.20 ； MnSO44H2O 22.3 ； ZnSO47H2O 8.60 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H2O 37.30 ； Fe。

14、SO47 H2O 27.80 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2.00 ；盐酸硫胺素 0.10 ；盐酸吡哆醇 0.50 和烟酸 0.50。 0008 所述的 B5培养基的配方（mg/L）为： KNO3 2500 ； (NH4)2SO4 134 ； NaH2PO4H2O 150 ； MgSO47 H2O 250 ； CaCl22 H2O 150 ； KI 0.75 ； H3BO3 3.0 ； MnSO44 H2O 10 ； ZnSO47H2O 2.0 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H。

15、2O 37.3 ； FeSO47 H2O 27.8 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2 ；盐酸硫胺素 0.1 ；盐酸吡哆醇 0.5 和烟酸 0.5。 0009 本发明的有益效果： 1、上述铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制。 0010 2、解决了铁皮石斛品种易退化和变异、种苗参差不齐等问题，生产的铁皮石斛试管苗品质较高，性状优良，一致性好，具有广阔的市场前景。 0011 3、使铁皮石斛种子无菌萌发率高达 96.8% 以上。 0012 4、提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛。

16、试管苗的石斛多糖含量，显著提高了铁皮石斛试管苗的质量，同时将试管苗的生长周期从原来的 18 个月缩短至 15 个月。 0013 具体实施方式 0014 实施例 1 ：铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：（1）、播种：选取 4-6 个月龄的饱满蒴果，用 75% 酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为： 1/2MS+ 白糖 2%+ 马铃薯汁 15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发 25 35 天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达 96.30% ；（2）、原球茎增殖和分化：将步骤（1）萌发的。

17、种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养2535天，所述的原球茎增殖培养基配方为： 1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养 40 50 天，所述的原球茎分化培养基的配方为： 1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L） + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L） + 白糖 2%+ 马铃薯汁 10% ；（3）、继代培养：说明书 CN 102948368 A 4 3/3 页 5 将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养 55 65 天，所述的继代培养基的配方为。

18、： B5+ 萘乙酸（0.5-1.0mg/L） + 白糖 2% ；（4）、壮苗生根培养：将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养 55 65 天，所述的壮苗培养基的配方为： B5+ 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2% ；然后再接入生根培养基中生根培养 40 50 天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为： 1/2MS + 萘乙酸（05-1.5mg/L） + 白糖 2%。 0015 所述的所有培养基均附加活性炭 0.5， pH 值调为 6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux， 10-12h/d）、温度 252、湿度。

19、60-80%。 0016 所述的 MS 培养基的配方（mg/L）为： KNO3 1900 ； NH4NO3 1650 ； KH2PO4 170 ； MgSO47H2O 370 ； CaCl22 H2O 440 ； KI 0.83 ； H3BO3 6.20 ； MnSO44H2O 22.3 ； ZnSO47H2O 8.60 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H2O 37.30 ； FeSO47 H2O 27.80 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2.00 ；盐酸硫胺素 0.10 ；盐酸吡。

20、哆醇 0.50 和烟酸 0.50。 0017 所述的 B5培养基的配方（mg/L）为： KNO3 2500 ； (NH4)2SO4 134 ； NaH2PO4H2O 150 ； MgSO47 H2O 250 ； CaCl22 H2O 150 ； KI 0.75 ； H3BO3 3.0 ； MnSO44 H2O 10 ； ZnSO47H2O 2.0 ； Na2MoO42 H2O 0.25 ； CuSO45 H2O 0.025 ； CoCl26 H2O 0.025 ； Na2EDTA2 H2O 37.3 ； FeSO47 H2O 27.8 ；肌醇 100 ；甘氨酸 2 ；盐酸硫胺素 0.1 ；盐酸吡哆醇 0.5 和烟酸 0.5。 0018 铁皮石斛种子无菌萌发率高达 96.8% 以上。提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量，显著提高了铁皮石斛试管苗的质量，同时将试管苗的生长周期从原来的 18 个月缩短至 15 个月。说明书 CN 102948368 A 5 。

摘要
申请专利号：	CN201210452289.1	申请日：	20121113
公开号：	CN102948368A	公开日：	20130306
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	安徽新津铁皮石斛开发有限公司
发明人：	张建民,朱新明
地址：	242300 安徽省宣城市宁国市经济开发区科技创业服务中心三楼
优先权：	CN201210452289A
专利代理机构：	安徽合肥华信知识产权代理有限公司	代理人：	余成俊
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内容摘要

本发明公开了一种铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：首先在播种培养基中黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，转接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，然后依次经过原球茎分化培养基中分化培养40～50天，继代培养基中继代培养55～65天，壮苗培养基中壮苗培养55～65天和生根培养基中生根培养40～50天，本发明铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制，铁皮石斛种子无菌萌发率高达96.8%以上；本发明提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量。

权利要求书

1.一种铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、播种：选取4-6个月龄的饱满蒴果，用75%酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为：1/2MS+白糖2%+马铃薯汁15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达96.30%；（2）、原球茎增殖和分化：将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，所述的原球茎增殖培养基配方为：1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养40～50天，所述的原球茎分化培养基的配方为：1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L）+ 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%；（3）、继代培养：将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养55～65天，所述的继代培养基的配方为：B培养基+ 萘乙酸（0.5-1.0mg/L）+白糖2%；（4）、壮苗生根培养：将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养55～65天，所述的壮苗培养基的配方为：B培养基+ 萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%；然后再接入生根培养基中生根培养40～50天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为：1/2MS +萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%；所述的所有培养基均附加活性炭0.5‰，pH值调为6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux，10-12h/d）、温度25±2℃、湿度60-80%。 2.根据权利要求1所述的铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于：所述的MS培养基的配方（mg/L）为：KNO1900；NHNO1650；KHPO 170；MgSO·7HO 370；CaCl·2 HO 440；KI 0.83；HBO6.20；MnSO·4HO 22.3；ZnSO·7HO 8.60；NaMoO·2 HO 0.25；CuSO·5 HO 0.025；CoCl·6 HO 0.025；Na·EDTA·2 HO 37.30；FeSO·7 HO 27.80；肌醇 100；甘氨酸 2.00；盐酸硫胺素 0.10；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50。 3.根据权利要求1所述的铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于：所述的B培养基的配方（mg/L）为：KNO2500；(NH)SO134；NaHPO·HO 150；MgSO·7 HO 250；CaCl·2 HO 150；KI 0.75；HBO 3.0；MnSO·4 HO 10；ZnSO·7HO 2.0；NaMoO·2 HO 0.25；CuSO·5 HO 0.025；CoCl·6 HO 0.025；Na·EDTA·2 HO 37.3；FeSO·7 HO 27.8；肌醇 100；甘氨酸 2；盐酸硫胺素 0.1；盐酸吡哆醇 0.5和烟酸 0.5。

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛栽培方法技术，具体涉及一种铁皮石斛的组织培养方法。

背景技术

铁皮石斛是著名的石斛品种，具有独特的药用价值。秦汉时期的《神农本草经》记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”；现代化学和药理研究表明，铁皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高达20%～30%。因其所含的石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等成分具有增强机体的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，养阴生津，强肾益精，抑制肿瘤细胞，缓解体力疲劳等独特功效。但是由于野生铁皮石斛主要生长在崇山峻岭的悬崖峭壁之上，因其种子极小，每个蒴果含有大约2000粒种子，细如粉尘且无胚乳，在自然条件下萌发率极低，自然资源十分稀少。加上常年无节制采掘，野生资源日渐枯竭，自然产量不能满足目前市场需求。本申请人通过现代生物工程植物组织培养技术，实现了铁皮石斛种质资源的保护和种苗优质快繁，实现了铁皮石斛的合理生产开发应用。

目前均采用植物组织培养技术快速繁育大量优质铁皮石斛组培苗，在不同的生产阶段调整培养基的营养成分。本发明所要解决的技术问题之一是在于提供一种铁皮石斛试管苗的快速繁育方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛的组织培养方法。

本发明采用如下技术方案：

铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）、播种：选取4-6个月龄的饱满蒴果，用75%酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为：1/2MS+白糖2%+马铃薯汁15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达96.30%；

（2）、原球茎增殖和分化：

将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，所述的原球茎增殖培养基配方为：1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养40～50天，所述的原球茎分化培养基的配方为：1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L）+ 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%；

（3）、继代培养：

将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养55～65天，所述的继代培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸（0.5-1.0mg/L）+白糖2%；

（4）、壮苗生根培养：

将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养55～65天，所述的壮苗培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%；然后再接入生根培养基中生根培养40～50天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为：1/2MS +萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%。

所述的所有培养基均附加活性炭0.5‰，pH值调为6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux，10-12h/d）、温度25±2℃、湿度60-80%。

所述的MS培养基的配方（mg/L）为：KNO3 1900；NH4NO3 1650；KH2PO4 170；MgSO4·7H2O 370；CaCl2·2 H2O 440；KI 0.83；H3BO3 6.20；MnSO4·4H2O 22.3；ZnSO4·7H2O 8.60；Na2MoO4·2 H2O 0.25；CuSO4·5 H2O 0.025；CoCl2·6 H2O 0.025；Na2·EDTA·2 H2O 37.30；FeSO4·7 H2O 27.80；肌醇 100；甘氨酸 2.00；盐酸硫胺素 0.10；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50。

所述的B5培养基的配方（mg/L）为：KNO3 2500；(NH4)2SO4 134；NaH2PO4·H2O 150；MgSO4·7 H2O 250；CaCl2·2 H2O 150；KI 0.75；H3BO3 - 3.0；MnSO4·4 H2O 10；ZnSO4·7H2O 2.0；Na2MoO4·2 H2O 0.25；CuSO4·5 H2O 0.025；CoCl2·6 H2O 0.025；Na2·EDTA·2 H2O 37.3；FeSO4·7 H2O 27.8；肌醇 100；甘氨酸 2；盐酸硫胺素 0.1；盐酸吡哆醇 0.5和烟酸 0.5。

本发明的有益效果：

1、上述铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制。

2、解决了铁皮石斛品种易退化和变异、种苗参差不齐等问题，生产的铁皮石斛试管苗品质较高，性状优良，一致性好，具有广阔的市场前景。

3、使铁皮石斛种子无菌萌发率高达96.8%以上。

4、提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量，显著提高了铁皮石斛试管苗的质量，同时将试管苗的生长周期从原来的18个月缩短至15个月。

具体实施方式

实施例1：铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：