一种发酵床生物活性垫料及其制备和应用方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103053432 B (45)授权公告日 2014.07.23 CN 103053432 B (21)申请号 201310004816.7 (22)申请日 2013.01.07 CGMCC No.5182 2011.07.28 A01K 1/015(2006.01) C12N 11/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (73)专利权人 湖南省微生物研究所 地址 410009 湖南省长沙市天心区新开铺路 18 号 (72)发明人 尹红梅 贺月林 张德元 许丽娟 王。

2、震 陈薇 吴迎奔 丁祥力 刘标 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 (54) 发明名称 一种发酵床生物活性垫料及其制备和应用方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种发酵床生物活性垫料及 其制备和应用方法， 包括以下重量百分比的原料 制成 ： 锯末 20%-50% ； 稻壳 20%-50% ； 农作物秸秆 20%-30% ； 辅料 2%-3% ； 发酵菌剂 0.1%-0.3% ； 本发 明发酵生物活性垫料主要作用是有效降解猪粪 尿， 改善养猪业对农村环境的污染。 发酵床垫料中 具有强大功能的有益微生物， 微生物在繁育过程 中可吸纳、 降解、 消化猪的排泄物， 使。

3、猪粪尿在发 酵床中得到原位降解， 消除了养猪业对农村环境 产生的面源污染。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 朱金龙 权利要求书 2 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书9页 (10)授权公告号 CN 103053432 B CN 103053432 B 1/2 页 2 1. 一种发酵床生物活性垫料， 其特征在于， 包括以下重量百分比的原料制成 ： 所述的锯末由灌木、 乔木的粉碎物的一种或两种组成 ； 所述的农作物秸秆由切断成12cm的稻草、 粉碎的玉米秸秆、 粉碎的棉秆中的一种或 几种的混合物组成 ； 所述的辅。

4、料由米糠、 麦麸和红糖中的一种或几种组成 ； 所 述 的 发 酵 菌 剂 是 由 枯 草 芽 孢 杆 菌 CGMCC1.1413 发 酵 产 物、 干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物、 蛋白酶充分混匀得到的 ； 其中有效活菌 数不少于 7.0109cfu/g， 蛋白酶活不少于 30U/g ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 50% 70%， 干酪乳杆菌菌数百分比为 30% 50% ； 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物制备 ： 首先， 将干酪乳杆菌经过斜面菌种活化、 种子培养 ； 。

5、然后固体发酵培养 ： 密封发酵桶中培养基装量为总体积的 70% 80%， 接种量占培养 基体积的 1.0% 2.0%， 发酵温度 32 35， 静止培养， 72 78 小时发酵完毕后菌数 含量在 4.0109cfu/g 5.0109cfu/g 之间 ； 培养基以麦麸为固态发酵基质， 添加 ： 葡萄 糖 3%， 蛋白胨 1%， K2HPO4.3H200.2%， MgSO4.7H200.1%， MnS040.025%， pH6.2 6.4， 湿度控制 在 65 70 ； 最后， 干酪乳杆菌发酵产物低温抽湿干燥， 水分不超过 10%， 产品含菌量在 7.0109cfu/g 8.0109cfu/g 之。

6、间。 2. 根据权利要求 1 所述的发酵床生物活性垫料， 其特征在于， 由 以下重量百分比的原料制成 ： 所 述 的 发 酵 菌 剂 是 由 枯 草 芽 孢 杆 菌 CGMCC1.1413 发 酵 产 物、 干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物、 蛋白酶充分混匀得到的 ； 其中有效活菌 数不少于 7.0109cfu/g， 蛋白酶活不少于 30U/g ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 60%， 干酪乳 杆菌菌数百分比为 40%。 3. 根据权利要求 1 所述的发酵床生物活性垫料， 其特征在于， 所述的枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 。

7、发酵产物制备 ： 首先， 将枯草芽孢杆菌经过斜面菌种活化、 摇瓶种子培养 ； 权 利 要 求 书 CN 103053432 B 2 2/2 页 3 然后进行发酵罐培养 ： 发酵罐中培养基装量为总体积的 40% 50%， 接种量占培养基体 积的 0.1% 0.3%， 发酵温度 35 37， 通空气 200rpm 220rpm 搅拌培养， 通气体积与 发酵液体积的比值 1:1 1.1:1， 罐压 0.03MPa 0.05MPa ； 发酵终点为芽孢数不低于总菌 数的90%， 且发酵液的活菌数在2.01010cfu/mL2.21010cfu/mL之间 ； 发酵罐培养基各 组分质量百分比为 : 葡萄糖 。

8、0.4 0.6， 淀粉 0.3 0.5， 豆饼粉 1.2 1.5， 硫 酸锰 0.0062， 酵母粉 0.8 1.0， 蛋白胨 0.3 0.5， 氯化铁 0.01， 磷酸二氢钾 0.3， 碳酸钙 0.1， 硫酸镁 0.05， 其余为水， pH7.2 7.4 ； 最后进行固体吸附 ： 发酵液与麦麸按 1:2 的重量比例吸附， 吸附后低温抽湿干燥， 水分 不超过 10%， 产品含菌量在 7.0109cfu/g 9.0109cfu/g 之间。 4. 根据权利要求 3 所述的发酵床生物活性垫料， 其特征在于， 枯草芽孢杆菌斜面菌种活化的培养基各组分质量百分比为 ： 蛋白胨 1%， NaCl0.5%， 。

9、酵 母膏 0.5%， 琼脂 1.5% 2.0%， 其余为水， pH7.2-7.4 ； 枯草芽孢杆菌摇瓶种子培养所用的摇瓶种子培养基是在枯草芽孢杆菌斜面菌种活化 的培养基中不加琼脂， 具体操作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于摇瓶种子液体培养基 中， 装量为 100mL 500mL， 转速为 180rpm 200rpm,35 37恒温培养 22 24h 后， 80水浴热处理 10 分钟， 即可。 5. 根据权利要求 1 所述的发酵床生物活性垫料， 其特征在于， 干酪乳杆菌斜面菌种活化的培养基为 MRS 固体培养基 ； 干酪乳杆菌的种子培养所需的种子培养基是在干酪乳杆菌斜面菌种活化的培养基 。

10、中不加琼脂， 具体操作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于种子液体培养基中， 装量为 200mL 500mL， 32 35静止培养 46 48h 后， 终止培养。 6. 权利要求 1-5 任一项所述的发酵床生物活性垫料的制备方法， 其特征在于， 依次包 括以下步骤 ： （1） 将锯末、 稻壳、 农作物秸秆、 辅料在太阳下暴晒 1 2d ； （2） 按所述的比例称取各原料 ； （3） 将辅料与发酵菌剂充分混合均匀， 稀释发酵菌剂 ； （4） 将步骤 （3） 得到的辅料与发酵菌剂的混合物与锯末、 稻壳和农作物秸秆混合物再次 充分混合均匀， 水分含量控制为 45 55% ； （5） 将混匀后的混。

11、合物料堆积发酵， 同时表面用麻袋覆盖， 待垫料中层温度达到 55 65时， 保持 3 5 天进行第一次发酵， 深翻一次， 把处于表层 20cm 和底部 20cm 的垫料放 到中间进行第二次发酵， 时间为 3 5 天， 待中层温度降至 35 45时 , 将堆积的垫料 耙平， 即得。 7. 权利要求 1-5 任一项所述的发酵床生物活性垫料的应用方法， 其特征在于， 用做猪 养殖的生物发酵床垫料。 权 利 要 求 书 CN 103053432 B 3 1/9 页 4 一种发酵床生物活性垫料及其制备和应用方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生物发酵床垫料， 尤其涉及用于猪养殖的生物发酵床垫料， 本。

12、发 明还涉及该发酵床垫料的制备方法和应用， 属于猪养殖领域。 背景技术 0002 近年来随着我国养猪业规模化、 集约化的迅猛发展， 猪粪尿及污水排放对环境的 污染日显严重。发酵床养猪是近年来从日本等国家引进的一项新兴养猪技术， 该技术是根 据微生态原理和微生物发酵理论， 将锯末、 稻壳、 粉碎的农作物秸秆、 微生物菌剂和米糠、 糖 等辅助发酵剂按一定比例混合均匀， 铺在猪舍发酵池内， 自然发酵， 形成微生物发酵床， 利 用发酵床中的微生物对畜禽粪尿 “原位降解” ， 达到生态环境 “零污染” 的新型养殖模式。发 酵床垫料是发酵床养猪关键的部分， 对垫料原料进行科学组合， 能达到减少管理强度， 。

13、增加 养猪效益等目的。 0003 但目前发酵床养猪技术还不完善， 在该技术的示范中， 遇到了诸如缺乏来源广泛、 降解效果好的垫料配方等突出难题。 发明内容 0004 本发明的目的旨在提供一种来源广、 降解效果好的发酵床生物活性垫料及其制备 和应用方法。 0005 本发明的技术方案是通过以下方式实现的 ： 0006 一种发酵床生物活性垫料， 包括以下重量百分比的原料制成 ： 0007 锯末 20% 50% ； 0008 稻壳 20% 50% ； 0009 农作物秸秆 20% 30% ； 0010 辅料 2% 3% ； 0011 发酵菌剂 0.1% 0.3% ； 0012 所述的锯末由灌木、 乔木。

14、的锯木屑中的一种或者两种， 或者灌木、 乔木的粉碎物的 一种或两种组成 ； 竹子及工业胶合板的粉碎物不能用作发酵床锯末原料 ； 0013 所述的农作物秸秆由切断成12cm的稻草、 粉碎的玉米秸秆、 粉碎的棉秆中的一 种或几种的混合物组成 ； 农作物秸秆应无霉变 ； 0014 所述的辅料由米糠、 麦麸和红糖中的一种或几种组成 ； 0015 所述的发酵菌剂是由枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 发酵产物、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物、 蛋白酶充分混匀得到的 ； 其中有效活菌 数不少于 7.0109cfu/g， 蛋白酶活不少于 30U。

15、/g ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 50% 70%， 干酪乳杆菌菌数百分比为 30% 50%。 0016 所述的发酵床生物活性垫料优选由以下重量百分比的原料制成 ： 0017 锯末 30% ； 说 明 书 CN 103053432 B 4 2/9 页 5 0018 稻壳 47% ； 0019 粉碎至 1 2cm 的稻草 20% ； 0020 米糠 2.8% ； 0021 发酵菌剂 0.2% ； 0022 所述的发酵菌剂是由由枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 发酵产物、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物、 蛋白酶充分混匀得到的 ； 其。

16、中有效活菌 数不少于 7.0109cfu/g， 蛋白酶活不少于 30U/g ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比优选为 60%， 干 酪乳杆菌菌数百分比优选为 40%。 0023 上述发酵菌剂的具体制备方法， 包括以下步骤 ： 0024 1） 枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 发酵产物制备 0025 首先， 将枯草芽孢杆菌经过斜面菌种活化、 摇瓶种子培养 ； 0026 然后进行发酵罐培养 ： 发酵罐中培养基装量为总体积的 40% 50%， 接种量占培养 基体积的0.1%0.3%， 发酵温度3537， 通空气200rpm220rpm搅拌培养， 通气体积 与发酵液体积的比值 1:1 1.1:1， 罐压 。

17、0.03MPa 0.05MPa ； 发酵终点为芽孢数不低于总 菌数的90%， 且发酵液的活菌数在2.01010cfu/mL2.21010cfu/mL之间 ； 发酵罐培养基 各组分质量百分比为 : 葡萄糖 0.4 0.6， 淀粉 0.3 0.5， 豆饼粉 1.2 1.5， 硫酸锰 0.0062， 酵母粉 0.8 1.0， 蛋白胨 0.3 0.5， 氯化铁 0.01， 磷酸二氢 钾 0.3， 碳酸钙 0.1， 硫酸镁 0.05， 其余为水， pH7.2 7.4 ； 0027 最后进行固体吸附 ： 发酵液与麦麸按 1:2 的重量比例吸附， 吸附后低温抽湿干燥， 水分不超过 10%， 产品含菌量在 7。

18、.0109cfu/g 9.0109cfu/g 之间。 0028 步骤 1）所述的斜面菌种活化的培养基各组分质量百分比为 ： 蛋白胨 1%， NaCl0.5%， 酵母膏 0.5%， 琼脂 1.5% 2.0%， 其余为水， pH7.2-7.4 ； 0029 步骤 1） 所述的摇瓶种子的培养基是在步骤 1） 所述的斜面培养基中不加琼脂， 具体操作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于摇瓶种子液体培养基中， 装量为 100mL 500mL， 转速为 180rpm 200rpm,35 37恒温培养 22 24h 后， 80水浴热处理 10 分 钟， 即可。 0030 2） 干酪乳杆菌 (Lactoba。

19、cillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物制备 0031 首先， 将干酪乳杆菌经过斜面菌种活化、 种子培养 ； 0032 然后固体发酵培养 ： 密封发酵桶中培养基装量为总体积的 70% 80%， 接种量占培 养基体积的 1.0% 2.0%， 发酵温度 32 35， 静止培养， 72 78 小时发酵完毕后菌数 含量在 4.0109cfu/g 5.0109cfu/g 之间 ； 培养基以麦麸为固态发酵基质， 添加 ： 葡萄 糖 3%， 蛋白胨 1%， K2HPO4.3H200.2%， MgSO4.7H200.1%， MnS040.025%， pH6.2 6.4， 湿度控制在 65。

20、 70 ； 0033 最后发酵产物低温抽湿干燥， 水分不超过 10%， 产品含菌量在 7.0109cfu/g 8.0109cfu/g 之间。 0034 步骤 2） 所述的斜面菌种活化的培养基为 MRS 固体培养基 ； 0035 步骤 2） 所述的种子的培养基是在步骤 2） 所述的斜面培养基中不加琼脂， 具体操 作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于种子液体培养基中， 装量为 200mL 500mL， 32 35静止培养 46 48h 后， 终止培养。 说 明 书 CN 103053432 B 5 3/9 页 6 0036 3） 蛋白酶 ： 市场购买。 0037 4） 发酵菌剂复配 0038。

21、 由枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 发酵产物、 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) CGMCCNo.5182 发酵产物、 蛋白酶充分混匀得到。 0039 所述的发酵床生物活性垫料的制备方法， 依次包括以下步骤 ： 0040 （1） 将锯末、 稻壳、 农作物秸秆、 辅料在太阳下暴晒 1 2d ； 0041 （2） 按所述的比例称取各原料 ； 0042 （3） 将辅料与发酵菌剂充分混合均匀， 稀释发酵菌剂 ； 0043 （4） 将步骤 （3） 得到的辅料与发酵菌剂的混合物与锯末、 稻壳和农作物秸秆混合物 再次充分混合均匀， 水分含量控制为 45 55% ； 0044 （5。

22、） 将混匀后的混合物料堆积发酵， 同时表面用麻袋覆盖， 待垫料中层温度达到 55 65时， 保持 3 5 天进行第一次发酵， 深翻一次， 把处于表层 20cm 和底部 20cm 的 垫料放到中间进行第二次发酵， 时间为 3 5 天， 待中层温度降至 35 45时 , 将堆积 的垫料耙平， 即得。 0045 本发明所制备得到发酵床活性垫料散发曲香味， 无霉变， 无腐败臭味或其他异味。 0046 本发明发酵生物活性垫料主要具有以下几方面的优点 ： 0047 （1） 有效降解猪粪尿， 改善养猪业对农村环境的污染 0048 本发明发酵床垫料中具有强大功能的有益微生物， 微生物在繁育过程中 2-3 天内。

23、 可吸纳、 降解、 消化猪的排泄物， 使猪粪尿在发酵床中得到就地降解， 消除了养猪业对农村 环境产生的面源污染。特别是本发明发酵复合微生物菌剂添加蛋白酶后， 对粪尿中的有机 物降解效率更高， 除臭效果更好。发酵菌剂 （60% 菌数百分比的枯草芽孢杆菌 40% 菌数 百分比的干酪乳杆菌蛋白酶， 菌含量为 7.5109cfu/g， 蛋白酶为 40U/g） 接种到猪粪尿 提取液中反应 7 天后， 提取液达到基本无臭， 14 天后， 对 COD、 NH3、 H2S 去除率分别为 93.5%、 92.1%、 85.3% ； 把发酵菌剂 （60% 菌数百分比的枯草芽孢杆菌 40% 菌数百分比的干酪乳杆 菌。

24、蛋白酶， 菌含量为 7.5109cfu/g， 蛋白酶为 40U/g） 接种到实验室模拟条件下发酵床 中， 脱臭效果好， 在第 4 天时达到基本无臭， 温升变化与挥发性固体降解率都比其他试验组 效果好， 发酵 20d 时， 挥发分由 73.4% 下降至 58.1%。 0049 （2） 降低生产成本、 提高养殖效益 0050 本发明生物发酵床垫料含有高活力有益微生物 , 生猪在翻拱和添食垫料时将有 益微生物以及微生物产生的代谢物如菌体蛋白、 酶类、 抗生素等食入， 从而改善肠道微生态 环境， 维持肠道菌群的生态平衡， 刺激肠道局部免疫反应， 使机体的抗体水平和巨噬细胞的 活性大大提高， 有效改善机。

25、体代谢， 有利于饲料转化率的提高、 从而大大降低生产成本。与 传统水泥地养猪比较 , 日增重提高 5.0% 8.0%, 料重比降低 5.0% 10.0%。 0051 （3） 充分利用农作物秸秆资源， 变废为宝 0052 农村中大部分农作物秸秆和加工副产品较大部分没有被资源化利用， 本发明能利 用农作物秸秆和加工副产品下脚料作为垫料， 且发酵床陈化垫料是优质有机肥的基质， 经 加工处理后是苗木、 花卉、 蔬菜等优质有机肥,废弃物得到资源化利用,可有效实现循环生 态农业。 说 明 书 CN 103053432 B 6 4/9 页 7 具体实施方式 0053 以下实施方式旨在进一步说明本发明， 而非。

26、限制本发明。 0054 本发明采用的 2 株菌株名称及菌种来源如下 ： 0055 枯草芽孢杆菌 (CGMCC1.1413)， 购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心 ； 0056 枯草芽孢杆菌主要特点 ： 好氧菌， 能产生淀粉酶、 蛋白酶等多种酶类。本发明选用 的菌株最适生长温度为 37， 接种到液体发酵培养基中， 48h 时产淀粉酶与蛋白酶活力分 别为 65.32u/mL、 29.56u/mL ； 对粪尿中的有机物降解效率高， 接种到猪粪尿提取液中反应 14 天后， 对 COD、 H2S、 NH3去除率分别为 90.2%、 79.7%、 53.5% ； 菌种发酵水平高， 发酵 24h 后 芽孢。

27、数不低于总菌数的 90%， 且发酵液的活菌数在 2.01010cfu/mL 以上。 0057 本发明的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） ， 从垃圾填埋场分离得到， 并于2011 年 7 月 28 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏， 保藏编号为 CGMCCNo.5182 ； 生物保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物 研究所。 0058 干酪乳杆菌主要特点 ： 进入动物机体后可以在肠道内大量存活， 具有较高耐酸和 耐胆盐的能力 , 在酸液处理后 （pH 值为 2.5 的磷酸盐缓冲液中处理 2h)） 的存活率能达到 80.2 。

28、， 在胆盐溶液处理后 （0.2% 的猪胆盐溶液处理 4h） 的存活率也能达到 47.3 ； 具有 调节肠内菌群平衡、 促进动物体的消化吸收等作用， 能有效地防治腹泻和提高机体免疫力 ； 特别对猪粪尿具有较好的除臭效果， 接种到猪粪尿提取液中反应 10 天后， 提取液达到基本 无臭， 14 天后， 对 COD、 NH3-N、 H2S 去除率分别为 58.7%、 90.3%、 62.3%。 0059 本发明发酵复合微生物菌剂的主要特点 ： 复合微生物菌剂结合两单菌株的优势以 及蛋白酶的催化功能， 不仅有机物降解率高， 而且脱臭效果好。把发酵菌剂 （60% 菌数百分 比的枯草芽孢杆菌 40% 菌数百。

29、分比的干酪乳杆菌蛋白酶， 菌含量为 7.5109cfu/g， 蛋 白酶为 40U/g） 接种到猪粪尿提取液中反应 7 天后， 提取液达到基本无臭， 14 天后， 对 COD、 NH3、 H2S去除率分别为93.5%、 92.1%、 85.3% ； 把发酵菌剂 （60%菌数百分比的枯草芽孢杆菌 40% 菌数百分比的干酪乳杆菌蛋白酶， 菌含量为 7.5109cfu/g， 蛋白酶为 40U/g） 接种到 实验室模拟条件下发酵床中， 脱臭效果好， 在第 4 天时达到基本无臭， 温升变化与挥发性固 体降解率都比其他试验组效果好， 发酵 20d 时， 挥发分由 73.4% 下降至 58.1%。 0060 。

30、本发明的干酪乳杆菌筛选过程如下 ： 0061 （1） 初筛方法 0062 按 10% 接种量接入所试菌株于发臭垃圾中， 以自来水作为对照， 分别于接种后 24 小时、 48 小时、 72 小时使用 GA10 型便携式氨气检测仪和 GA10 型便携式硫化氢检测仪检测 氨和硫化氢的浓度， 初步判断各菌株的除臭效果， 对经便携式检测仪测定有除臭能力的微 生物进行复筛实验。 0063 （2） 复筛方法 0064 降氨实验 ： 取 18mL 菌液于 2L 大烧杯中， 并加入 500mg/L 的氨水 2mL ； 再往大烧杯 中放入装有 20mL0.005N 硫酸吸收液的 50mL 小烧杯， 盖上双层塑料薄。

31、膜密封。 0065 降硫化氢实验 ： 取 10mL 菌液于 2L 大烧杯中， 并加入 10mg/L 的硫化氢溶液 10mL， 再往大烧杯中放入装有 20mL 氢氧化镉吸收液的 50mL 小烧杯， 盖上双层塑料薄膜密封。 0066 以上处理均以等量的无菌水作为对照， 每个处理重复 3 次， 置于 30的培养箱中 说 明 书 CN 103053432 B 7 5/9 页 8 培养。24h 后， 取出小烧杯检测氨或硫化氢的浓度。氨的测定采用纳氏试剂比色法， 硫化氢 的测定采用亚甲基蓝比色法。 0067 按以上方法筛选到 1 株高效稳定的除臭菌株 B2。在实验室条件下， B2 对氨的去除 率在 88%。

32、 92%， 对硫化氢的去除率为 60% 65%。 0068 菌株 B2 在 MRS 琼脂培养基上菌落圆形， 中央凸起， 白色， 表面光滑， 质地均匀， 在 挑取菌体时有一定的黏性。革兰氏阳性， 不产芽孢， 菌体杆状， 两端方形， 呈单个或链状排 列。生化反应能发酵多种糖， 如葡萄糖 （酸） 、 果糖、 半乳糖、 甘露糖 ； 不液化明胶， 不产生 吲哚和硫化氢， 接触酶阴性 ； 最适生长温度 35。经 16S rDNA 测序分析， 为干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） ， 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏， 保藏编号为 CGMCC No.5182。 00。

33、69 实施例 1 ： 发酵菌剂的制备 0070 1） 枯草芽孢杆菌 CGMCC1.1413 发酵产物制备 0071 首先， 将枯草芽孢杆菌经过斜面菌种活化、 摇瓶种子培养 ； 0072 然后进行发酵罐培养 ： 发酵罐中培养基装量为总体积的 40% 50%， 接种量占培养 基体积的0.1%0.3%， 发酵温度3537， 通空气200rpm220rpm搅拌培养， 通气体积 与发酵液体积的比值 1:1 1.1:1， 罐压 0.03MPa 0.05MPa ； 发酵终点为芽孢数不低于总 菌数的90%， 且发酵液的活菌数在2.01010cfu/mL2.21010cfu/mL之间 ； 发酵罐培养基 各组分质。

34、量百分比为 : 葡萄糖 0.4 0.6， 淀粉 0.3 0.5， 豆饼粉 1.2 1.5， 硫酸锰 0.0062， 酵母粉 0.8 1.0， 蛋白胨 0.3 0.5， 氯化铁 0.01， 磷酸二氢 钾 0.3， 碳酸钙 0.1， 硫酸镁 0.05， 其余为水， pH7.2 7.4 ； 0073 最后进行固体吸附 ： 发酵液与麦麸按 1:2 的重量比例吸附， 吸附后低温抽湿干燥， 水分不超过 10%， 产品含菌量在 7.0109cfu/g 9.0109cfu/g 之间。 0074 步骤 1）所述的斜面菌种活化的培养基各组分质量百分比为 ： 蛋白胨 1%， NaCl0.5%， 酵母膏 0.5%， 。

35、琼脂 1.5% 2.0%， 其余为水， pH7.2-7.4 ； 0075 步骤 1） 所述的摇瓶种子的培养基是在步骤 1） 所述的斜面培养基中不加琼脂， 具体操作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于摇瓶种子液体培养基中， 装量为 100mL 500mL， 转速为 180rpm 200rpm,35 37恒温培养 22 24h 后， 80水浴热处理 10 分 钟， 即可。 0076 2） 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)CGMCC No.5182 发酵产物制备 0077 首先， 将干酪乳杆菌经过斜面菌种活化、 种子培养 ； 0078 然后固体发酵培养 ： 密封发酵桶中培养。

36、基装量为总体积的 70% 80%， 接种量占培 养基体积的 1.0% 2.0%， 发酵温度 32 35， 静止培养， 72 78 小时发酵完毕后菌数 含量在 4.0109cfu/g 5.0109cfu/g 之间 ； 培养基以麦麸为固态发酵基质， 添加 ： 葡萄 糖 3%， 蛋白胨 1%， K2HPO4.3H200.2%， MgSO4.7H200.1%， MnS040.025%， pH6.2 6.4， 湿度控制 在 65 70 ； 0079 最后发酵产物低温抽湿干燥， 水分不超过 10%， 产品含菌量在 7.0109cfu/g 8.0109cfu/g 之间。 0080 步骤 2） 所述的斜面菌种。

37、活化的培养基为 MRS 固体培养基 ； 0081 步骤 2） 所述的种子的培养基是在步骤 2） 所述的斜面培养基中不加琼脂， 具体操 说 明 书 CN 103053432 B 8 6/9 页 9 作 ： 取活化的新鲜斜面菌种一环， 接种于种子液体培养基中， 装量为 200mL 500mL， 32 35静止培养 46 48h 后， 终止培养。 0082 实施例 2 发酵床垫料的制备 0083 （1） 将锯末、 稻壳、 稻草太阳下暴晒 1 2d ； 0084 （2） 将稻草切断成 1 2cm ； 0085 （3） 按以下重量称取各原料 ： 0086 锯末 32kg， 稻壳 43kg， 稻草 22k。

38、g， 红糖 2.8kg， 复合微生物发酵菌剂 0.2kg （实施例 1 制备的发酵产物和蛋白酶混合， 其中有效活菌含量为 8.0109cfu/g， 蛋白酶活为 35U/g。 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 60%， 干酪乳杆菌菌数百分比为 40%。 ） 0087 （4） 将红糖与发酵菌剂充分混合均匀， 稀释发酵菌剂 ； 0088 （5） 在发酵池内将锯末、 稻壳及稻草混合均匀， 然后将发酵菌剂稀释物与以上垫料 混合物再次混合均匀， 水分含量控制在 50% 左右 ； 0089 （6） 将混匀后的混合物料堆积发酵， 同时表面用麻袋覆盖， 待垫料中层温度达到 55 65时， 保持 3 5 天， 深翻一次，。

39、 尽量把第一次未完全发酵的， 靠近外面 20cm 和底 部20cm的垫料放到中间进行第二次发酵， 再继续发酵35天， 待中层温度降至3540 时 , 将堆积的垫料耙平， 即得。 0090 实施例 3 发酵床垫料的制备 0091 （1） 将锯末、 稻壳、 棉杆太阳暴晒 1 2d ； 0092 （2） 将棉杆粉碎 ； 0093 （3） 按以下重量称取各原料 ： 0094 锯末 36kg， 稻壳 40kg， 棉杆 21kg， 红糖 2.7kg， 复合微生物发酵菌剂 0.3kg （实施例 1 制备的发酵产物和蛋白酶混合， 其中有效活菌含量为 7.7109cfu/g， 蛋白酶活为 37U/g。 枯草芽孢。

40、杆菌菌数百分比为 50%， 干酪乳杆菌菌数百分比为 50%。 ） 0095 （4） 将红糖与发酵菌剂充分混合均匀， 稀释发酵菌剂 ； 0096 （5） 在发酵池内将锯末、 稻壳及棉秆粉混合均匀， 然后将发酵菌剂稀释物与以上垫 料混合物再次混合均匀， 垫料水分含量控制在 50% 左右 ； 0097 （6） 将混匀后的混合物料堆积发酵， 同时表面用麻袋覆盖， 待垫料中层温度达到 55 65时， 保持 3 5 天， 深翻一次， 尽量把第一次未完全发酵的， 靠近外面 20cm 和底 部20cm的垫料放到中间进行第二次发酵， 再继续发酵35天， 待中层温度降至3540 时 , 将堆积的垫料耙平， 即得。。

41、 0098 试验例 1 菌剂在实验室模拟条件下对发酵床中猪粪便降解能力 0099 1、 菌剂用实施例 1 制备的发酵产物、 蛋白酶等按照以下菌数百分比配制 0100 100%枯草芽孢杆菌 ； 100%干酪乳杆菌 ； 40%枯草芽孢杆菌60%干酪乳杆 菌 ； 50%枯草芽孢杆菌50%干酪乳杆菌 ； 60%枯草芽孢杆菌40%干酪乳杆菌 ； 70% 枯草芽孢杆菌30%干酪乳杆菌 ； 80%枯草芽孢杆菌20%干酪乳杆菌 ； 60%枯草芽孢 杆菌 40% 干酪乳杆菌蛋白酶。 0101 所有试验组菌剂总含量都为 7.5109cfu/g， 蛋白酶为 40U/g。 0102 2、 试验方法 0103 将30%。

42、锯末、 47%稻壳、 20%稻草与2.8%米糠的混合垫料铺入面积4m2的发酵槽中， 说 明 书 CN 103053432 B 9 7/9 页 10 高度为 50cm， 压实。称取占垫料质量 20的新鲜猪粪于垫料中， 按 0.2% 的接种量将以上 8 种微生物菌剂喷洒到有机垫料中， 充分搅拌均匀， 水分保持在55左右。 同时按上述方法加 入垫料与猪粪， 不添加菌剂， 设为未接种对照CK。 在实验室模拟条件下测定不同菌剂对发酵 床中猪粪便降解效果， 主要结果如下 ： 0104 （1） 菌剂脱臭能力 0105 从表 1 可以看出， 复合菌剂脱臭能力比单菌株强 ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 50 70。

43、%， 干酪乳杆菌菌数百分比为 30 50% 菌剂组合比其他比例组合脱臭效果好 ； 在复 合菌剂里添加蛋白酶有益于脱臭能力提高， 接种菌剂试验组在第 4 天时达到基本无臭， 优于其他试验组。 0106 表 1 臭度变化 0107 0108 注 ： Ms0 无臭味 ； Msl 勉强感觉到臭味 ； Ms2 微弱的臭气味 ； Ms3 明显的臭气味 ； Ms4 很强的臭气味 ； Ms5 难以忍受的臭气味。 0109 （2） 有机物降解效果 0110 挥发性固体的变化反映了发酵过程中有机物的降解情况， 是发酵过程中重要特性 值之一。温度是微生物活性的直接衡量指标， 可直接反映发酵效果的好坏。从表 2、 表。

44、 3 可 以看出 ： 复合菌剂对有机物降解能力比单菌株强 ； 枯草芽孢杆菌菌数百分比为5070%， 干 酪乳杆菌菌数百分比为3050%菌剂组合对有机物降解能力比其他比例组合强 ； 在复合菌 剂中添加蛋白酶有益于提高有机物降解能力， 接种菌剂试验组温升变化与挥发性固体降 解率都比其他试验组效果好， 发酵 20d 时， 挥发分由 73.4% 下降至 58.1%。 0111 从以上数据可以初步得出 ： 枯草芽孢杆菌菌数百分比为 50 70%， 干酪乳杆菌菌 数百分比为 30 50% 的菌剂组合较佳， 且在组合中适当添加蛋白酶有利于猪粪便的降解。 0112 表 2 温度变化 （） 0113 说 明 书。

45、 CN 103053432 B 10 8/9 页 11 0114 表 3 固体挥发分百分比变化 （%） 0115 0116 试验例 2 本发明发酵床活性垫料在某猪场的应用效果试验 0117 2011 年 8 月 21 日 11 月 21 日在某养猪场将本发明实施例 2-3 所制备的发酵床 垫料转入发酵床， 应用到猪舍。 按产期， 体重相近， 雌雄比例大致各半的原则， 选择同品种同 批次 30 头平均体重 (16.844.62)kg 的三元杂交 （大 长 大） 猪， 每头猪打上耳标， 随 机分成 3 组。试验组为对照组， 传统水泥地栏舍饲养生猪， 试验、 组分别为本发明实 施例 2 与例 3 所。

46、制备的发酵床垫料制成的发酵床饲养生猪 , 实验效果如下 : 0118 (1) 对猪舍环境的影响 0119 表 4 猪舍中 NH3和 H2S 平均浓度 0120 0121 从表4可以看出,试验组、 组两试验组猪舍内NH3平均浓度均极显著低于对照 组组 (P 0.01) ； 试验组 H2S 浓度极显著低于对照组 (P 0.01)。据此认为， 本发明发 酵床垫料养猪降低了猪舍内 NH3、 H2S 等有害气体的浓度， 为猪的生长发育提供适宜的环境。 0122 (2) 对猪平均日增重的影响 0123 从表 5 可以看出 : 组、 组、 组猪只日均增重分别为 650.890.05g、 702.880.09。

47、g、 697.780.06g， 试验组、 组与对照组比较猪只日均增重分别提高了 7.9%、 7.2%。 0124 (3) 对猪采食量及料重比的影响 0125 从表 5 可以看出 : 组、 组、 组猪只均日采食量分别为 1789.950.23g、 1749.290.15g、 1751.950.36g， 料重比分别为 2.75:1、 2.48:1、 2.51:1。试验组、 组 说 明 书 CN 103053432 B 11 9/9 页 12 与对照组比较料重比分别降低 9.8%、 8.7%。据此认为 , 本发明发酵床垫料养猪可提高饲 料利用率， 有效促进猪的生长。 0126 表 5 生猪生产性能结果 0127 说 明 书 CN 103053432 B 12 。