利用马尾松种子获取无菌苗的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103210845 B (45)授权公告日 2015.01.07 CN 103210845 B (21)申请号 201310149982.6 (22)申请日 2013.04.26 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 广西壮族自治区林业科学研究院 地址 530002 广西壮族自治区南宁市邕武路 23 号 (72)发明人 谭健晖 陈虎 杨章旗 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 CN 201601959 U,2010.10.13, 全文 . CN 201957411 U,2011.09.07, 全文 。

2、. CN 202587804 U,2012.12.12, 全文 . CN 102884974 A,2013.01.23, 全文 . CN 2322221 Y,1999.06.02, 全文 . 彭云芳 . 海绵作发芽床衬垫物的研究探 讨 .种子 .1994,( 第 3 期 ), 第 46-47 页 . (54) 发明名称 利用马尾松种子获取无菌苗的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用马尾松种子获取无菌 苗的方法， 利用海绵良好的吸水和保水性能， 将消 毒后的马尾松种子放入其中培养 10-20 天即可获 得生长健壮的无菌苗。应用本发明培养马尾松无 菌苗， 出苗时间明显缩短， 苗木生长尤其是根。

3、系生 长优于琼脂培养 ； 同时简化了实验步骤， 提高了 培养效率 ； 此外， 由于海绵可重复利用且不产生 废弃物， 节约了育苗繁殖成本又保护了环境。 本发 明的无菌苗培育方法经济高效且操作简便， 适用 于马尾松的离体培养和转基因等生物技术的研究 和生产， 对马尾松的良种繁育和生物技术研究有 重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姜岚 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103210845 B CN 103210845 B 1/1 页 2 。

4、1. 一种利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 培养基准备 剪取长宽为 3-5cm 1-2cm 海绵， 将海绵充分吸水， 将吸足水的海绵放入组培瓶内， 扭紧瓶盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 种子消毒 采用 0.1升汞对种子进行消毒 8-10min， 无菌水冲洗 4-5 次 ； 接种 在无菌条件下将步骤 消毒好的种子接种到步骤 的海绵培养基中 ； 培养 将步骤 的组培瓶置于 23-25条件下暗培养 10-20 天。 2. 根据权利要求 1 所述的利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 其特征在于 ： 步骤 中海绵折成直角贴瓶壁垂直放在组培瓶底， 步骤 中种子接种到。

5、平行瓶底的海绵上表 面。 3. 根据权利要求 2 所述的利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 其特征在于 ： 所述海绵 贴壁高度 0.5-1.5cm。 4. 根据权利要求 3 所述的利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 其特征在于还包括以下 步骤 ： 诱导 将步骤中生长健壮， 高3-7cm的无菌苗取出用于叶、 茎和芽的增殖诱导或愈伤组织 诱导， 将其余不发芽的种子清理， 海绵洗净晒干。 权 利 要 求 书 CN 103210845 B 2 1/5 页 3 利用马尾松种子获取无菌苗的方法 技术领域 0001 本发明属于马尾松组织培养技术领域， 尤其涉及一种利用马尾松种子获取无菌苗 的方法。 背景技术 0。

6、002 马尾松 (Pinus massoniana) 是我国南方重要的脂材两用树种， 它用途广泛、 经济 价值高， 是我国林浆纸 ( 板 )、 松脂和建筑等行业的主要原料树种。除木材和松脂两个大宗 用途外， 马尾松全树均可利用， 花粉、 针叶和树皮富含抗氧化物质， 可用作优良的抗衰老和 抗氧化保健品 ； 松籽含油 30， 可制造油漆、 肥皂和润滑油 ； 球果可提炼原油 ； 松根可提取 松焦油， 还能培养珍贵的中药材茯苓。 0003 经过 30 多年的遗传改良研究， 广西建成了马尾松优良种源优良林分采种母 树林初级种子园改良代种子园等多层次的良种基地， 在推动马尾松良种化进程方面发 挥了重要作用。

7、。与其他用材树种相比， 马尾松的无性繁殖难度较大， 其中组织培养更加困 难。 但由于植物的组织培养具有繁殖系数大、 苗木生长整齐等优点， 攻克松树组织培养技术 一直是世界育种学者的目标。传统的无菌苗培养多采用琼脂粉 （条） 培养基， 需要经过琼脂 粉 （条） 加热溶解灭菌冷却凝结三个步骤， 操作较为繁琐 ； 另外， 无菌苗培养由于存在种 子发芽率和污染等多种问题， 无菌苗的成苗率一般只能达到520%， 使8095%的培养基 成为废弃物难以回收再利用而造成浪费 ； 同时， 琼脂的透气性较差， 苗木生长尤其是根系生 长不够好。 因此， 寻找一种简单、 经济和快捷的方法培养无菌苗是进行马尾松组织培养。

8、以及 基因工程等研究亟待解决的首要问题。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简易、 经济高效的利用马尾松种子获取 无菌苗的方法。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案 ： 利用马尾松种子获取无菌苗的 方法， 以吸水海绵作为培养基。 0006 上述利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 包括以下步骤 ： 0007 培养基准备 0008 剪取长宽为3-5cm1-2cm海绵， 将海绵充分吸水， 将吸足水的海绵放入组培瓶 内， 扭紧瓶盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 0009 种子消毒 0010 采用 0.1% 升汞对种子进行消毒 8-10min， 无菌水。

9、冲洗 4-5 次 ； 0011 接种 0012 在无菌条件下将步骤 消毒好的种子接种到步骤 的海绵培养基中 ； 0013 培养 0014 将步骤 的组培瓶置于 23-25条件下暗培养 10-20 天。 说 明 书 CN 103210845 B 3 2/5 页 4 0015 步骤 中海绵平放在组培瓶底， 步骤 中种子接种到海绵上表面。 0016 步骤 中海绵折成直角贴瓶壁垂直放在组培瓶底 （海绵的含水率形成梯度变 化， 垂直贴壁的含水率低于水平放置） ， 步骤 中种子接种到平行瓶底的海绵上表面。 0017 海绵贴壁高度 0.5-1.5cm。 0018 上述利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 还包括。

10、以下步骤 ： 0019 诱导 0020 将步骤中生长健壮， 高3-7cm的无菌苗取出用于叶、 茎和芽的增殖诱导或愈伤 组织诱导， 将其余不发芽的种子清理， 海绵洗净晒干。 0021 针对目前无菌苗培养采用琼脂作为培养基存在的问题， 发明人采用具有良好吸水 和保水性能的海绵作为培养基建立了利用马尾松种子获取无菌苗的方法， 将消毒后的马尾 松种子放入吸水海绵中培养 10-20 天即可获得生长健壮的无菌苗。应用本发明培养马尾 松无菌苗， 出苗时间明显缩短， 苗木生长尤其是根系生长优于琼脂培养 ； 同时简化了实验步 骤， 提高了培养效率 ； 此外， 由于海绵可重复利用且不产生废弃物， 节约了育苗繁殖成。

11、本又 保护了环境。本发明的无菌苗培育方法经济高效且操作简便， 适用于马尾松的离体培养和 转基因等生物技术的研究和生产， 对马尾松的良种繁育和生物技术研究有重要意义。 附图说明 0022 图 1 是本发明利用马尾松种子获取无菌苗的方法实施例 1 至 3 的参考状态图 （海 绵垂直） 。 0023 图 2 是本发明利用马尾松种子获取无菌苗的方法实施例 4 至 5 的参考状态图 （海 绵平放） 。 0024 图中 ： 1 组培瓶， 2 海绵， 3 种子。 具体实施方式 0025 以下结合附图和实施例进一步说明本发明。 0026 实施例 1 0027 培养基准备 0028 剪取长宽约为3cm2cm海绵。

12、， 将海绵置于自来水中充分吸水， 用镊子将吸足水 的海绵放入组培瓶内， 如图 1 所示， 海绵折成直角贴瓶壁 （贴壁高度 1cm） 垂直放在组培瓶 底， 扭紧瓶盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 0029 种子消毒 0030 流水冲洗5h， 0.5%高锰酸钾溶液浸泡20min， 流水冲净， 于超净工作台中采用0.1% 升汞对种子进行消毒 8min， 无菌水冲洗 5 次 ； 0031 接种 0032 将步骤消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤的海绵培养基中平行瓶 底的海绵上表面 ； 0033 培养 0034 将步骤 的组培瓶置于 24条件下暗培养 15 天 ； 0035 诱导 说 明 。

13、书 CN 103210845 B 4 3/5 页 5 0036 将步骤中生长健壮， 高约5.5cm的无菌苗取出用于芽的增殖诱导， 将其余不发 芽或发霉的种子清理， 海绵洗净晒干可重复利用。 0037 实施例 2 0038 培养基准备 0039 剪取长宽约为4.5cm2cm海绵， 将海绵置于自来水中充分吸水， 用镊子将吸足 水的海绵放入组培瓶内， 海绵折成直角贴瓶壁 （贴壁高度 1.5cm） 垂直放在组培瓶底， 扭紧瓶 盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 0040 种子消毒 0041 流水冲洗6h， 0.3%高锰酸钾溶液浸泡30min， 流水冲净， 于超净工作台中采用0.1% 升汞对种。

14、子进行消毒 10min， 无菌水冲洗 4 次 ； 0042 接种 0043 将步骤消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤的海绵培养基中平行瓶 底的海绵上表面 ； 0044 培养 0045 将步骤 的组培瓶置于 25条件下暗培养 18 天 ； 0046 诱导 0047 将步骤中生长健壮， 高约7cm的无菌苗取出用于芽的增殖诱导， 将其余不发芽 或发霉的种子清理， 海绵洗净晒干可重复利用。 0048 实施例 3 0049 培养基准备 0050 剪取长宽约为2.8cm1.5cm海绵， 将海绵置于自来水中充分吸水， 用镊子将吸 足水的海绵放入组培瓶内， 海绵折成直角贴瓶壁 （贴壁高度 0.8cm） 垂直。

15、放在组培瓶底， 扭紧 瓶盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 0051 种子消毒 0052 流水冲洗5h， 0.5%高锰酸钾溶液浸泡15min， 流水冲净， 于超净工作台中采用0.1% 升汞对种子进行消毒 9min， 无菌水冲洗 5 次 ； 0053 接种 0054 将步骤消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤的海绵培养基中平行瓶 底的海绵上表面 ； 0055 培养 0056 将步骤 的组培瓶置于 23条件下暗培养 17 天 ； 0057 诱导 0058 将步骤中生长健壮， 高约6.8cm的无菌苗取出用于芽的增殖诱导， 将其余不发 芽或发霉的种子清理， 海绵洗净晒干可重复利用。 0059。

16、 实施例 4 0060 培养基准备 0061 剪取长宽约为2.3cm1.5cm海绵， 将海绵置于自来水中充分吸水， 用镊子将吸 足水的海绵放入组培瓶内， 如图 2 所示， 海绵平放在组培瓶底， 扭紧瓶盖， 于 121灭菌锅下 灭菌 20min ； 说 明 书 CN 103210845 B 5 4/5 页 6 0062 种子消毒 0063 流水冲洗 5.5h， 0.4% 高锰酸钾溶液浸泡 18min， 流水冲净， 于超净工作台中采用 0.1% 升汞对种子进行消毒 11min， 无菌水冲洗 5 次 ； 0064 接种 0065 将步骤 消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤 的海绵上表面 ； 006。

17、6 培养 0067 将步骤 的组培瓶置于 23条件下暗培养 20 天 ； 0068 诱导 0069 将步骤中生长健壮， 高约6.0cm的无菌苗取出用于芽的增殖诱导， 将其余不发 芽或发霉的种子清理， 海绵洗净晒干可重复利用。 0070 实施例 5 0071 培养基准备 0072 剪取长宽约为3.0cm1.7cm海绵， 将海绵置于自来水中充分吸水， 用镊子将吸 足水的海绵放入组培瓶内， 海绵平放在组培瓶底， 扭紧瓶盖， 于 121灭菌锅下灭菌 20min ； 种子消毒 0073 流水冲洗4h， 0.4%高锰酸钾溶液浸泡20min， 流水冲净， 于超净工作台中采用0.1% 升汞对种子进行消毒 9m。

18、in， 无菌水冲洗 4 次 ； 0074 接种 0075 将步骤 消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤 的海绵上表面 ； 0076 培养 0077 将步骤 的组培瓶置于 25条件下暗培养 20 天 ； 0078 诱导 0079 将步骤中生长健壮， 高约5.8cm的无菌苗取出用于芽的增殖诱导， 将其余不发 芽或发霉的种子清理， 海绵洗净晒干可重复利用。 0080 对照例 0081 培养基准备 0082 称取 7g/ 升琼脂条， 将琼脂条剪碎或用粉碎机打碎， 加适量水边搅拌边加热溶解， 溶解完成用烧杯定容至 1 升， 充分拌匀， 趁热倒入培养瓶中， 每瓶 30-40mL， 扭紧瓶盖， 于 121灭。

19、菌锅下灭菌 20min， 自然冷却至凝结 ； 0083 种子消毒 0084 流水冲洗4.5h， 0.2%高锰酸钾溶液浸泡25min， 流水冲净， 于超净工作台中用0.1% 升汞对种子进行消毒 9min， 无菌水冲洗 5 次 ； 0085 接种 0086 将步骤 消毒好的种子在超净工作台上接种到步骤 的琼脂培养基中 ； 0087 培养 0088 将步骤 的组培瓶放置于 25条件下暗培养 45 天 ； 0089 诱导 0090 将步骤中生长健壮， 高约5.6cm的无菌苗取出进行芽增殖诱导， 将其余不发芽 或发霉种子的培养瓶放入灭菌锅中加热使琼脂溶解， 将琼脂倒入废液盆中集中丢弃。 说 明 书 CN。

20、 103210845 B 6 5/5 页 7 0091 表 1 无菌苗培养效果比较表 0092 0093 结论 ： 从表 1 可见， 应用本方法处理的实施例 1 至 5， 萌发率为 20 25%， 苗高为 5.5 7.0cm， 培养时间为 15 20 天， 生长健壮 ； 对照例中， 萌发率只有 15%， 苗高为 5.6cm， 培养时间为 45 天， 生长较弱， 实施例与对照的萌发率和苗高大体相近， 实施例略高 ； 在培养 时间和生长状况上本发明实施例均优于对照例。 0094 其中实施例 1 3 和实施例 4 5 的萌发率、 苗芽高和生长状况 3 个方面没有显 著的差异， 但在培养时间上实施例 。

21、1 3 优于实施例 4 5。所以实施例 1 3 中的海绵折 成直角贴瓶壁的方法具有一定的优势。 0095 实施例15的培养时间平均为18天， 明显优于对照例的45天， 培养时间缩短30 天左右， 具有明显优势。实施例 1 5 的生长状况优于对照例， 原因在于海绵的透气性好于 琼脂， 导致在海绵培养基上生长的无菌苗根系发达， 苗木生长健壮。 由于植物组织培养需在 24h控温23-25， 8h人工光照条件下进行， 培养时间缩短30天不仅能有效节约生产成本还 能加快组培苗的生产周期， 同时， 实施例中的海绵可以重复利用且不产生废弃物， 从而保护 了环境。 说 明 书 CN 103210845 B 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103210845 B 8 。