发明领域
本发明涉及用于皮肤增白的试剂，这些试剂用于抑制哺乳动物皮 肤中黑色素产生的用途和适于这种用途的组合物。
发明背景
一些具有天然较黑皮肤类型的人希望促使他们的全部肤色能增白 一定的程度。肤色主要由黑色素的数量和类型来决定，黑色素是通过 存在于表皮的黑素细胞在皮肤内产生的物质。黑色素存在两种形式， 即深黑色素(dark melanin)和浅黑色素(light melanin)。如果深黑 色素的产生减少和/或浅黑色素对深黑色素产生的比例提高，将使得皮 肤增白。
发明概述
我们现在发现类黄酮(flavanoid)，维生素C和维生素E的组合 物对抑制深黑色素产生同时实际提高浅黑色素的产生具有显著的效 果。通常将皮肤增白剂配制成局部使用。然而，我们已经发现如果将 三种组分局部给予，其组合是细胞毒性的。因此我们已经发现至少一 些组分应当全身给予。用分开的给予例如将类黄酮和维生素C全身给 予而将维生素E局部给予获得了特别好的效果。
因此，本发明提供了皮肤增白产品，包括组分(a)类黄酮、(b) 维生素C和(c)维生素E，其中至少组分(b)以适于全身给予的形 式来提供，其他组分以适于局部给予的形式来提供。
一优选实施方案中，(a)和(b)以适于全身给予的形式来提供， 而(c)以适于局部给予的形式来提供。
另一优选实施方案中，其中组分(a)、(b)和(c)以适于全身 给予的形式来提供。
优选适于全身给予的形式是口服剂型。
相关方面中，本发明提供了皮肤增白产品，包括用于口服给予的 第一组合物，其包括类黄酮和维生素C，和用于局部给予的第二组合 物，其包括维生素E，即第一组合物是口服剂型而第二组合物是局部 组合物。
进一步相关的方面中，本发明提供了用于增白皮肤的产品，该产 品包括组分(a)类黄酮、(b)维生素C和(c)维生素E，其中至少 组分(b)以适于全身给予的形式来提供，而其他组分以适于局部给予 的形式来提供。
本发明进一步提供了调控哺乳动物皮肤中黑色素产生的方法，该 方法包括将(a)类黄酮、(b)维生素C和(c)维生素E给予所述的 哺乳动物，其中将至少组分(b)全身给予，而将其他组分局部给予。
还提供了本发明的用于调控哺乳动物皮肤中黑色素产生的组合物 或产品以及本发明的组合物或产品在制造用于抑制哺乳动物皮肤中黑 色素产生的组合物或产品中的用途。
本发明进一步提供了提高哺乳动物皮肤中浅黑色素对深黑色素比 例的方法，该方法包括将有效量的(a)类黄酮、(b)维生素C和(c) 维生素E给予所述哺乳动物，其中将至少组分(b)全身给予，而将其 他组分局部给予。
一实施方案中，将组分(a)和(b)全身给予而将组分(c)局部 给予。
另一实施方案中，将组分(a)，(b)和(c)全身给予。
本发明还提供了本发明的用于提高哺乳动物皮肤中浅黑色素对深 黑色素比例的组合物或产品以及本发明的组合物或产品用于提高哺乳 动物皮肤中浅黑色素对深黑色素比例的用途。通常，这样的用途是用 于美容目的。
发明详述
除非另外限定，在此所用的所有技术和科学术语具有本领域技术 人员通常所理解的相同意思。
类黄酮
类黄酮是多酚化合物并在自然界中能广泛找到。存在几类类黄 酮：黄烷醇，黄酮醇，黄酮，异黄酮，黄烷酮，原花色素，花色素和 羟基均二苯代乙烯。这些化合物中的许多以糖基化的形式存在，尤其 是作为O-糖苷。通常，糖基化的形式优于配基(aglycone)。优选， 类黄酮不是黄烷醇。
黄酮醇包括栎精，莰非醇和杨梅黄酮。黄烷醇包括儿茶素，表儿 茶素，棓儿茶素，表棓儿茶素，及其与棓酸的酯，即儿茶素棓酸酯，表 儿茶素棓酸酯，棓儿茶素棓酸酯和表棓儿茶素棓酸酯(EGCg)。黄烷 酮包括柚苷配基，橙皮素和樱花亭。黄酮包括藤黄菌素和芹菜配基。 异黄酮包括黄豆苷原和染料木黄酮。羟基均二苯代乙烯包括白藜芦醇 和氧白藜芦醇(oxyresveratrol)。
所述化合物可以化学合成或从植物原料获得。
植物提取物不同于完整的植物原料，因为完整植物原料中存在的 各种组分将以不同的含量存在于提取物中，或基本上不存在。在提取 之前，可以将植物原料干燥和或机械加工，例如，碾碎。
通常通过溶剂提取来制得植物原料的提取物。溶剂包括包含极性 和非极性有机溶剂，水及其混合物的“溶剂”。优选的溶剂为水、乙 醇及其混合物。提取方法可以包括加热步骤。溶剂提取的组分可进行 进一步的纯化/分离步骤，如色谱或分馏。如在此所用的，“级分”意 思是含有上述一种或多种活性成分的溶剂的任何分级部分，例如，通 过色谱或通过分馏获得的。
上述各种多酚化合物的合适植物来源包括新鲜水果如葡萄(尤其 是皮和籽)，酸果蔓(cranberry)，黑醋栗，黑莓和柑桔类水果，以 及蔬菜如洋葱，羽衣甘蓝，花椰菜(broccoli)和菜豆(French bean)。
通过共同溶解一种或多种花色素可以提高黄酮醇在水溶剂中的溶 解度(参见，US专利No.6,569,446)。
优选的实施方案中，组合物包括原花色素和花色素的混合物。优 选以树皮提取物来提供原花色素和花色素的混合物，更优选是法国海 岸松(Pinus pinatus)的树皮提取物。一种这样的提取物以PycnogenolTM是可购得的。
另一优选实施方案中，组合物包括一种或多种黄酮醇。优选，组 合物包括杨梅黄酮和/或栎精，更优选栎精。
另一优选实施方案中，组合物包括一种或多种黄烷酮。优选，组 合物包括柚苷配基，橙皮素和/或樱花亭，更优选橙皮素。
可以使用例如实施例中所述的测试方法来测试含有相同物质的其 他化合物和/或植物提取物来证实它们具有合适的活性。
本发明的化合物和产品可以包括两种或多种类黄酮的混合物。一 实施方案中，以不同的植物提取物来提供不同的类黄酮。
维生素C
如在此所用的，“维生素C”意思是抗坏血酸或其有机或无机(例 如，钠)盐。还包括一种或多种该酸及其盐的混合物。
维生素E及其衍生物
如在此所用的，“维生素E”包括其任何异构形式的α-、β-、γ- 和δ-生育酚或其混合物(包括这些异构形式任意的混合物)。维生素E 的衍生物可以是油溶性的或水溶性的。油溶性维生素E衍生物的实 例，包括酯衍生的维生素E，生育酚醋酸酯，生育酚亚油酸酯，生育 酚亚油酸酯/油酸酯，生育酚烟酸酯和生育酚(维生素E醇)。水溶性 维生素E衍生物包括维生素E磷酸钠(VEP)，月桂基亚氨基二丙酸 生育酚磷酸盐，生育酚葡糖苷，生育酚琥珀酸盐，托可索仑 (tocophersolan)(生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐)，tocophereth-5， 10，12，18和50(聚乙二醇(PEG)生育酚醚)。对于PEG维生素E 衍生物，提高数目表示提高连接到维生素E的PEG分子的数目。因此， 随着数目的提高，水溶性也提高，tocophereth-5具有最低的水溶性， 而tocophereth-50具有最高的水溶性。在此涉及的维生素E衍生物具 有至少50％的α-生育酚生物活性，例如，至少50％的α-生育酚的抗氧 化活性。
组合物和产品形式
可以以用于局部和/或全身给予的形式来提供本发明的皮肤增白产 品。其中三种组分作为分开的系统来提供，即全身和局部剂型，至少 维生素C以全身剂型来提供：局部剂型优选不包括任何维生素C。优 选，分开的系统中，维生素E以局部形式来提供，类黄酮/维生素C以 全身剂型来提供。或者，所有三种组分都以全身剂型来提供。
因此，根据本发明产品范围中的如在此所用的术语“产品”指的 是含有所有必要成分的单一组合物的情况和其中整个产品的单个成分 在一起提供作为产品的两个不同组合物形式之间分开的情况。例如， 产品可包括一个用于全身传送其组分的组成形式和一个用于局部传送 其组分的组成形式。含有这样组成形式的组合的产品实例是护肤霜和 营养补充片剂。
局部组合物
一实施方案中，本发明的组合物包括配制成局部给予的剂型，即， 组合物/产品包括局部组合物。因此，可以将本发明的局部组合物局部 给予患者，即，通过将组合物直接放置或涂抹于皮肤上。可以通过将 安全而有效量的活性物质或上述物质与药物学上可接受的局部载体或 稀释剂即皮肤学上可接受的载体或稀释剂混合来制得这样的组合物。
组合物通常含有全部约0.1％至约50％重量的活性物质，优选约 1wt％至约50wt％，如5或10wt％至约50wt％。
可以将本发明中有用的局部组合物制成多种产品类型。这些包 括，但不限于，洗剂，霜剂，凝胶，棒剂，喷雾剂，膏剂和糊剂。这 些产品类型可以包括几种类型的载体系统，包括，但不限于，溶液， 乳浊液，凝胶和固体。
可以将本发明中有用的局部组合物配制成通常包括药物学上可接 受的水溶剂或有机溶剂的溶液。术语“药物学上可接受的水溶剂”和 “药物学上可接受的有机溶剂”指的是在其中能够分散或溶解活性物 质的溶剂，并具有可接受的安全特性(例如，刺激和敏感特征)。合 适有机溶剂的实例包括：丙二醇，聚乙二醇(200-600)，聚丙二醇 (425-2025)，聚乙烯吡咯烷酮，丙二醇-14丁基醚，甘油，1，2，4-丁三 醇，山梨糖醇酯，1，2，6-己三醇，乙醇，异丙醇，丁二醇及其混合物。 这些溶液优选含有约0.1％至约20％，更优选约1％至约20％，更优选 至约1％至约10％的每种活性物质。
如果将本发明中有用的局部组合物配制成气溶胶并以喷射应用至 皮肤上，将推进剂加入溶液组合物中。
可以将局部组合物配制成包括润肤剂的溶液，润肤剂即用于防止 或缓解干燥以及用于保护皮肤的物质。多种合适的润肤剂是已知的并 可以在此使用(参见，Sagarin，Cosmetics，Science and Technology， 第2版，Vol.1，pp.32-43(1972))。这样的组合物优选含有约2％至 约50％的局部药物学上可接受的润肤剂。
如果将载体配制成乳浊液，优选约1％至约10％，更优选约2％至 约5％的载体系统由乳化剂组成。乳化剂可以是非离子的，阴离子的或 阳离子的。合适的乳化剂公开于，例如，McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers，North American Edition，第317-324页(1986)。
水包油型和油包水型的单相乳浊液护肤制剂，如洗液和霜剂，是 化妆品领域公知的。这样的乳浊液可以稳定和提高活性物质的渗透。 也可以使用多相乳浊液组合物，如水包油包水型。通常，这样的单相 或多相乳浊液含有水，润肤剂和乳化剂作为必要组分。
另一种可以使用的乳浊液载体系统是微乳浊液载体系统。这样的 系统包括约9％至约15％的角鲨烷；约25％至约40％的硅油；约8％至 约20％的脂肪醇；约15％至约30％的聚氧乙烯山梨聚糖单脂肪酸(在 商品名吐温下可购得)或其他非离子表面活性剂；和约7％至约20％的 水。
还可以使用脂质体制剂。这些制剂可以稳定活性物质，还可以提 高渗透不充分的活性物质的传送。可以首先将活性物质与磷脂，如二 棕榈酰磷脂酰胆碱，胆固醇和水，根据描述于Mezei & Gulasekharam， Joural of Pharmaceutics and Pharmacology，Vol.34(1982)，pp.473- 474中的方法，或其改进混合来制得这样的组合物。用于形成脂质体的 合适组成的表皮类脂可以替代磷脂。然后将脂质体制剂掺入一种上述 的局部载体系统中(例如，凝胶或水包油型乳浊液)来产生脂质体制 剂。局部应用脂质体的其他组成和化妆品/药物用途描述于Mezei，M.， “Liposome as a Skin Drug Devery System”，Topics in Pharmaceutical Sciences(D.D.Berimer and P.Speiser，eds.)，Elsevier Science Publishers B. V.，New York，N.Y.，1985，pp.345-358。
如果将局部组合物配制成凝胶或美容棒，可通过将合适量的增稠 剂加入霜剂或洗剂中来配制这样的组合物。
还可以将局部组合物配制成化妆品，如粉底。粉底是基于溶液或 洗液的，具有合适量的增稠剂，色素和香料。
组合物中还可以存在各种水溶性物质。这些包括润湿剂，蛋白质 和多肽以及防腐剂。此外，在此有用的局部组合物可以含有常规的化 妆品佐剂，如染料，遮光剂(例如，二氧化钛)，色素和香料。
本发明中有用的局部组合物还可以包括安全而有效量的渗透促进 剂。渗透促进剂的优选含量为组合物的约1％至约5％。有用的渗透增 强剂实例描述于US6,068,834中。组合物中还可包括其他常规的护肤产 品添加剂。例如，可以使用胶原，透明质酸，弹性蛋白，水解产物， 樱草油，霍霍巴油，表皮生长因子，大豆皂草苷，粘多糖，及其混合 物。
理想的是本发明的组合物中包括一种或多种防晒剂。多种常用的 防晒剂公开于，例如，Cosmetics，Science and Technology，第2版 (1972)，Vol.1，第VIII章，第189页及以下的。还参见US6,068,834。
防晒剂必须与活性物质相容。组合物优选包括约1％至约20％，更 优选约2％至约10％的防晒剂。提取物含量将根据所选的防晒剂和所需 的防晒指数(SPF)而改变。
还可以将试剂加入本发明的任一种组合物中来提高这些组合物的 皮肤直接性，尤其来提高它们对水洗或擦拭的抗性。提供该益处的优 选试剂是乙烯和丙烯酸的共聚物。含有这些共聚物的组合物公开于 U.S.4,663,157中。
本发明涉及抑制哺乳动物通常是人皮肤中黑色素产生的方法。一 实施方案中，这样的方法包括将安全而有效量的本发明产品或组合物 给予皮肤或其部位。活性物质的含量和应用的频率将根据皮肤的初始 状况和所需的最终结果而改变。通常，以足以明显增白皮肤的数量和 时间段来给予组合物。
可以使用低于毒性水平的任何剂量，因此考虑对于特定剂型，尤 其是局部剂型，“剂量”是提供所需效果的任何数量，并且由于应用 频率和所用的数量，所述数量可以非常大以至最大有效数量是无关紧 要的。
施加局部组合物中安全而有效量的活性物质，通常为每次应用约 1μg至约1mg每cm2皮肤，优选为每次应用约2μg至约800μg/cm2皮肤， 更优选约30μg至约700μg/cm2皮肤，最优选约75μg至约250μg/cm2皮 肤。应用的频率通常为约一天四次至约一周两次，更优选约一天三次 至约隔天一次，更优选至少每天两次。通常优选至少一次应用发生在 晚上。
全身组合物
活性剂可以结合药物学上可接受的载体或稀释剂来产生全身剂 型。适用于这样组合物的药物学上可接受的稀释剂或载体是药学领域 公知的。本发明的全身剂型通常含有1至90％重量的活性物质，如1 至50％重量的活性物质，更优选至少10或20wt％的活性物质。
全身剂型可以包括固体剂型如药物的片剂，硬明胶胶囊，软明胶 胶囊，散粉和微胶囊。或者，可以包括液体剂型，如水溶液或非水溶 液，乳浊液或悬浮液。
本发明的组合物优选是用于口服的固体剂型。优选以单位剂型制 得固体剂型，如片剂和胶囊的形式。可以通过已知的方法在崩解剂例 如玉米淀粉，和润滑剂例如硬脂酸镁的存在下，将活性物质组合与惰 性稀释剂如磷酸钙混合，并将混合物成片，来制得合适的片剂。如果 需要，可以通过已知方法给这样的片剂提供肠溶衣，例如通过使用醋 酸邻苯二甲酸纤维素。相似地，胶囊，例如，硬或软明胶胶囊，含有 活性物质组合(任选地为微珠形式)，含有或不含添加的赋形剂，可 以通过常规方法制得，且如果需要，以已知的方式提供肠溶衣。可以 以本领域技术人员已知的方法来配制片剂，使得获得本发明化合物的 受控释放。
本发明剂型的受控释放形式包括快速释放制剂如可溶性颗粒或融 化物填充的快速释放胶囊，延迟释放制剂如提供肠溶衣例如醋酸邻苯 二甲酸纤维素肠溶衣的片剂，尤其是持续释放制剂。多种持续释放的 制剂是本领域技术人员已知的。通常，可以将活性物质组合包胶于释 放延迟的包衣内，例如，纤维素醚和丙烯酸酯的共聚物，或可以结合 到小颗粒如，例如，离子交换树脂珠子上。或者，将活性物质组合掺 入含有释放延迟剂的基质中，所述释放延迟剂如亲水性胶例如黄原 胶，纤维素衍生物，例如，羟丙基甲基纤维素，或多糖，蜡或塑料材 料。
可以将活性物质组合配制成其中两种活性成分保持分开的固体剂 型。例如，剂型可以是双层片剂，其中活性成分包含于不同的层中。 可以配制不同的层使得提供每种活性物质的最佳释放特征。
液体填充组合物例如粘性液体填充物，液体糊状填充物或触变液 体填充物也适于口服给予。可以通过将活性物质组合与特定的天然植 物油脂肪酸的酯，例如GelucireTM，从Gattefosse获得，混合来获得 融化物填充的组合物以提供各种释放速率。合适的融化物填充的胶囊 包括10至80％的活性物质和20％至90％的脂肪酸酯赋形剂，所述脂 肪酸酯包括一种或多种天然植物油脂肪酸的多元醇酯和甘油三酯。
优选的口服液体组合物包括1至10wt％的活性物质和1至50wt％ 的稀释剂，剩余部分由无菌水构成。任意地，组合物可以含有悬浮剂， 增稠剂，助溶剂如乙醇和/或防腐剂。合适的稀释剂包括甜味剂例如山 梨糖醇，木糖醇或蔗糖。合适的悬浮剂或增稠剂包括纤维素胶，琼脂 或天然胶，例如黄原胶。可以加入本领域技术人员已知的调味剂或其 他口味遮掩剂，例如糖精，糖精钠，acesulpham K或阿斯巴甜。
通过将活性物质与已知的用于这样给予的药物形式混合来制得适 于非肠道给予的剂型，例如活性物质在合适溶剂如盐水中的无菌悬浮 液或无菌溶液。
优选的给予方式是口服。
通常，以明显增白皮肤的足够量和足够的时间段来给予所述剂 型。
给予的活性物质的量取决于组合物中化合物的生物利用率，尤其 是使用口服给予时。然而，通常，本发明化合物的剂量为约0.01mg/kg 体重至约100mg/kg，优选约0.1至约30mg/kg体重。组合物的量取决 于该制剂中化合物的百分比，其是每剂所需化合物量、化合物稳定性、 释放特征和其他药物参数的函数。通常给予的剂量为每周一次或两次 至每日一次或两次。
认为所述的给予途径和剂量只是指导，因为有经验的医师能够容 易地决定任一特定个体的最佳给予途径和剂量。
全身给予的另一种方式包括在食品中给予任一种上述组合物，因 此不必使用药物学上可接受的载体。
如在此所用的，术语“食品”包括如所指的食品和饮料。如所指 的食品包括涂抹料，乳制品(包括牛奶和酸奶)，甜点，方便食品/快 餐，早餐谷类食品和谷物棒，熟肉，面包和冷冻甜食如冰淇淋，冰糕 和清凉果汁饮料以及酸奶冰淇淋。食品还包括膳食/营养补充剂。合适 的饮料包括茶，茶风味的饮料，咖啡，软饮(例如，充了碳酸气的柠 檬水等)和果汁。
通常用本发明的活性成分补充食品，使得它们含有的活性物质数 量比通常它们所含的高。
使用分开给予时，可以在大概相同的时间或不同的时间给予不同 的剂型。例如，全身剂型可以和食品一起给予或作为食品给予，而局 部剂型可以在睡前例如作为晚霜给予。
用途
本发明的产品和组合物可用于调控哺乳动物尤其是人皮肤中的黑 色素产生。更具体地，它们可以用于提高皮肤中浅黑色素：深黑色素 的比例，例如，通过抑制皮肤中深黑色素(真黑素)的产生和/或提高 皮肤中浅黑色素的产生。因此，本发明的组合物可用于诱导哺乳动物 如人的皮肤增白。提高皮肤中浅黑色素：深黑色素比例而不是简单抑 制两种黑色素产生的优势，在于产生了更好的肤色。通常，本发明的 方法用于美容目的。
此外，老年斑和高度色素沉积的部位，影响了肤色并呈现不均匀 的外观。通过提高浅黑色素部分，可以通过提高老年斑中浅黑色素对 深黑色素的比例而获得更均匀的肤色。这随后使皮肤呈现整体更浅的 外观。
优选将浅黑色素：深黑色素的比例相对于对照提高至少两倍(以 相对于对照的浅黑色素的百分比除以相对于对照的深黑色素的百分比 来测量，例如，浅黑色素提高至对照的150％，而深黑色素降低至对照 的50％，则相对于对照比例为3∶1)。
现在参照以下的实施例来进一步描述本发明，这些实施例只是说 明性的且是非限制性的。
实施例
这些实施例中，使用可购得的MelanodermTM系统，测试评价各种 试剂影响深黑色素和浅黑色素水平的能力。
MelanodermsTM的处理方案
MelanodermTM MatTeks系统包括正常的，源自人的表皮角质化细 胞(NHEK)和黑素细胞(NHM)，已经将其培养形成多层的，高度 分化的人表皮模型。共培养物中的NHM经历自发的黑素形成导致具有 不同色素水平的组织。使用无血清培养基来生产该组织，没有使用黑 素形成的人工刺激物如TPA和IBMX。培养物在空气-液体交界面的细 胞培养嵌入物上生长，使得可进行待测试试剂的模拟局部应用。将试 剂引入培养基中来模拟全身应用。因此，该模型提供了有用的体外方 式来评价为调控皮肤色素沉积而设计的试剂。其还使得我们可以比较 全身给予对局部给予的效果。
传送时，按照MatTek’s的实验方案使用无菌技术，将melanoderms (MatTek MEL-300-B)放置于在含有5ml预热维持培养基(EPI- 100-MM-PRF)的6孔平板中的金属环支持物上。在37℃和4％CO2培养过夜使得melanoderms完全复原并平衡。一旦置于这些条件下， MEL-300组织将经受黑素形成和分化。
在第二天早晨开始处理。将待测试的试剂溶解于合适的溶剂中并 以预先确定的对黑素细胞毒性的最终浓度加入温热的培养基中。每次 改变培养基，从melanoderms吸出用过的培养基并保存用来测试毒性 (Lactate Dehydrogenase(Promega)和白细胞介素-1释放(R&D系 统)并用加上测试试剂的新鲜剂量培养基替换，不管是否在melanoderm 的培养基内。将melanoderms返回培养箱中。每48小时重复该处理方 案，直至观察到对照和测试试剂之间相对的变黑差异。
表1 处理 浓度 供应商 维生素C 30μg/ml Sigma 维生素E 1μM Sigma Pycnogenol 10μg/ml Solgar(Pycnogenol 30mg) 橙皮素 20μg/ml Sigma 栎精 10μg/ml Sigma
在观察变黑的差异时，用摄影来记录微观和宏观变黑。melanoderm 组织的收集包括从塑料支持物上切除组织，接着相对于未处理的组 织，进行对存在的黑色素的定量后处理。
Melanoderm组织的黑色素的选择性增溶
(1)定量碱可溶性的黑色素(浅黑色素)
从塑料支持物上切下Melanoderm样品并测量组织的湿重。将 200μl的1M NaOH/8M脲加入melanoderm样品中，将组织在微离心管 中均质。将样品在RT断断续续地涡旋混合30分钟来释放可溶性黑色 素。将样品在13,000rpm离心10分钟，并将含有可溶性黑色素的上清 液转移至新管中。
通过加入200μl氯仿，然后剧烈混合1分钟从上清液中提取蛋白 质。通过在13,000rpm离心10分钟来将各相分离。将150μl上清液加 入微量滴定板(双份)中并确定340nm的OD。
(2)碱不溶性黑色素(深黑色素)的定量
将1M NaOH加入剩余的含有不溶性黑色素的沉淀中，并将样品涡 旋一分钟。然后将样品在37℃水浴中培养96小时，每日进行混合来释 放不溶性黑色素。将样品与200μl氯仿在13,000rpm离心10分钟，并 将190μl上清液转移至新管中。将上清液再次离心并将150μl转移至微 量滴定板来用于分析340nm处的吸收。
绝对黑色素浓度的计算
从之前测定的浅黑色素标准曲线作为实际黑色素量来计算绝对黑 色素：
x＝(y-0.003)/4.76423(其中x＝黑色素的浓度，且y＝340nm处的 光密度)。
对于深黑色素，曲线是x＝(y-0.00553)/3.70312。
结果
表2 总黑色素 μg/g 浅黑色素 μg/g 深黑色素 μg/g 浅黑色素 (μg/g)：深 黑色素 (μg/g)的 比例 对照 2.55 1.22 1.34 0.92 Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+ 维生素E(1μM) 全部全身给予 2.03 1.32 +8.1％ 0.71 -47％ 1.89 Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+ 维生素E(1μM) 全部局部给予 对细胞 具有毒性 Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+ 维生素E(1μM) 维生素E-局部， 其他全部全身 1.89 1.39 +13.9％ 0.50 -62.6％ 2.78 Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+ 维生素E(1μM) 维生素C-局部， 所有其他全身 对细胞 具有毒性 Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+ 维生素E(1μM) 维生素E-全身， 所有其他局部 对细胞 具有毒性
我们已经表明用Pycnogenol(10μg/ml)+维生素C(30μg/ml)+维生 素E(1μM)处理melanoderms能够抑制深黑色素产生并提高浅黑色素对 深黑色素的比例，因此能够降低或对抗色素沉着过度和/或诱导皮肤增 白。
然而，我们已经发现给予方式是重要的。当Pycnogenol(10μg/ml) +维生素C(30μg/ml)+维生素E(1μM)全部局部给予时，处理看来似乎 对细胞是毒性的。这可能是由于组分局部给予且是促氧化剂 (prooxidant)。当维生素C或维生素C和Pycnogenol的组合局部给 予而剩余的治疗剂全身给予时，也观察到显著的毒性。
然而，当Pycnogenol(10μg/ml)+维生素C(30μg/ml)+维生素 E(1μM)全部全身给予时(即，在培养基中)，存在显著降低的深黑色 素产生和提高的浅黑色素产生(获得了浅黑色素对深黑色素比例的提 高)。一种可替换的给予方式尤其有效：当Pycnogenol(10μg/ml)+维 生素C(30μg/ml)全身给予而维生素E(1μM)局部给予时，浅黑色素对深 黑色素的比例显著提高。
用其他类黄酮替代Pycnogenol来进行测试，所述其它类黄酮即橙 皮素，一种黄烷酮和栎精，一种黄酮醇，获得了相似的结果 总黑色素 μg/g 浅黑色素 μg/g 深黑色素 μg/g 浅黑色素 (μg/g)：深黑 色素(μg/g) 的比例 对照 2.55 1.22 1.34 0.92 栎精(10μg/ml)+维生素 C(30μg/ml)+维生素 E(1μM)维生素E-局 部，所有其他全身 1.87 1.37 +12.3％ 0.52 -61.2％ 2.63 橙皮素(20μg/ml)+维生 素C(30μg/ml)+维生素 E(1μM)维生素E-局 部，所有其他全身 2.32 1.40 +14.8 0.92 -31.3％ 1.52
涉及以上单个部分的本发明的各种特征和实施方案可以加以必要 的变更适当地应用至其他部分。因此，一个部分中的特定特征可以适 当地结合另一部分中的特定特征。
上述说明书中提及的所有出版物在此引入作为参考。所述的本发 明的方法和产品的各种改进和改变是本领域技术人员显而易见的，并 没有脱离本发明的范围。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本 发明，应当理解所要求的本发明不应当不适当地受限于这样的特定实 施方案。实际上，相关领域技术人员显而易见的所述本发明实施方式 的各种改进在以下权利要求的范围内。