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1、(10)申请公布号 CN 103750077 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103750077 A (21)申请号 201410027967.9 (22)申请日 2014.01.21 A23K 3/03(2006.01) (71)申请人 四川省草原科学研究院 地址 611731 四川省成都市郫县犀浦镇国宁 西路 368 号 (72)发明人 白史且 李平 鄢家俊 游明鸿 李达旭 (74)专利代理机构 北京方圆嘉禾知识产权代理 有限公司 11385 代理人 董芙蓉 (54) 发明名称 不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质 影响的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种不同乳酸。
2、菌菌制剂添加比 例对虉草青贮品质影响的方法， 包括以下步骤 ： 选择青宝II号添加剂、 乳酸菌添加剂I、 乳酸菌添 加剂 II 三种乳酸菌， 另设一组 FM 生理盐水对照 ； 将虉草留茬 2cm 3cm 刈割， 就地自然萎蔫 2h 3h， 收获人工运回实验室， 用铡刀将虉草切成 2cm 3cm 后混合均匀并加入青宝 II 号添加剂、 乳酸菌添加剂 I、 乳酸菌添加剂 II 添加剂 ； 再次 混匀后装入 30cm25cm 的聚乙烯青贮袋中， 每袋 300g， 用真空封口机抽真空后密封， 置于室温储藏 60d 后， 开封取样分析青贮发酵品质和化学成分 ； 测定青贮原料和青贮饲料的常规成分、 青贮饲。
3、料 的 pH 值及有机酸和氨态氮 ； 数据采用 Excel2003 和SPSS17软件进行方差分析， 用Duncan法对平均 值进行多重比较。 本发明提高了虉草青贮的效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 10 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书10页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103750077 A CN 103750077 A 1/3 页 2 1. 一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特征在于， 该不同 乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法包括以下步骤 ： 步骤一，。
4、 选择青宝 II 号添加剂、 乳酸菌添加剂 I、 乳酸菌添加剂 II 三种乳酸菌， 每种乳 酸菌添加剂选择 3 个添加剂梯度， 另设一组 FM 生理盐水对照 ； 步骤二， 将虉草留茬 2cm 3cm 刈割， 就地自然萎蔫 2h 3h， 收获人工运回实验室， 用 铡刀将虉草切成2cm3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、 乳酸菌添加剂I、 乳酸菌添 加剂 II 添加剂 ； 步骤三， 再次混匀后装入 30cm25cm 的聚乙烯青贮袋中， 每袋 300g， 用真空封口机抽 真空后密封， 置于室温储藏 60d 后， 开封取样分析青贮发酵品质和化学成分 ； 步骤四， 测定青贮原料和青贮饲料的虉草干物质。
5、含量、 粗蛋白、 可溶性碳水化合物、 中 性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分、 青贮饲料的 pH 值及有机酸和氨态氮 ； 步骤五， 数据采用 Excel2003 和 SPSS17 软件进行方差分析， 用 Duncan 法对平均值进行 多重比较。 2. 如权利要求 1 所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特 征在于， 在步骤一中， FM 生理盐水的添加量为 5mlkg-1； 青宝 II 号添加剂的 3 个添加剂梯 度添加量分别为 ： 0.01mlkg-1； 0.03mlkg-1； 0.05mlkg-1； 乳酸菌添加剂 I 的 3 个添加剂 梯度添加量分别为 ： 0.073mlk。
6、g-1； 0.22mlkg-1； 0.37mlkg-1； 乳酸菌添加剂 II 的 3 个添 加剂梯度添加量分别为 ： 0.011mlkg-1； 0.033mlkg-1； 0.055mlkg-1。 3. 如权利要求 1 所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特 征在于， 在步骤四中， 青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、 粗蛋白、 可溶性碳水化合物、 中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为 ： 在 65条件下烘干 48h 测定干物 质， 使用微型植物样粉碎机粉碎原料， 过 1mm 筛， 采用凯式定氮法测定粗蛋白， 采用范氏方 法测定中性洗涤纤维、 酸性洗涤纤维， 采。
7、用蒽酮 - 硫酸法测定可溶性碳水化合物 ； 凯氏定氮法包括以下步骤 ： 称取 0.5g 的样品， 使用定性滤渣包裹好， 放入消化管中， 加入硫酸钾 - 硫酸铜 15 1 混合粉末 ； 加入 10ml 浓硫酸， 与 420下进行消煮 ； 消煮液至清亮蓝色为宜 ； 配制 40氢氧 化钠， 1的硼酸吸收液和 0.1M 盐酸溶液， 用全自动定氮仪进行测定 ； 范式法测定中、 酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤 ： 称取 30.0g 分析纯十六烷基硫酸钠 ； 18.61g 分析纯乙二胺四乙酸二钠 ； 6.8lg 分析纯 十水四硼酸钠 ； 4.56g 分析纯无水磷酸氢二钠， 10.0ml 分析纯三甘醇 ； 全。
8、部溶解于 1L 蒸馏 水中， 控制pH值在6.9-7.1之间 ； 酶活性在340000M.W.Uml的Alpha-淀粉酶 ； 分析纯无 水亚硫酸钠， 称取烘干至恒重、 过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中， 距离袋 口 4cm 封口 ； 称取一个空白袋作为对照 ； 滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘不用区分 样品编号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放入纤维分 析容器中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下 ； 遵循 ANKOM2000 全自动分析仪的操 作 ； NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋。
9、将水挤出， 把滤袋放入 250ml 烧 杯中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5min， 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干至 恒重， 冷却沉重后计算 NDF 的含量 ； 酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤 ： 权 利 要 求 书 CN 103750077 A 2 2/3 页 3 酸性洗涤剂 2十六烷基三甲基溴化铵的配制 ： 称取 20g 化学纯十六烷基溴化铵溶于 1000ml， 1.00mol 硫酸溶液中， 搅拌均匀， 必要时过滤 ； 1.00mol L 硫酸溶液的配制 ： 量取 55.74ml 浓硫酸， 化学纯， 90， 比重 1.84， 慢慢加 入已经装有 1000ml 蒸馏水的烧。
10、杯中， 冷却至室温， 定容至 1000ml 容量瓶中定容， 标定 ； 称取烘干至恒重、 过 2mm 筛的样品 0.45-0.55g 放入已经称重的滤袋中， 距离袋口 4cm 封口 ； 称取一个空白袋作为对照， 滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘不用区分样品编 号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器 中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下 ； 遵循 ANKOM2000 全自动分析仪的操作 ； NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋将水挤出， 把滤袋放入 250ml 烧杯中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5。
11、min， 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干至恒重， 冷却沉重后计算 NDF 的含量 ； 蒽酮 - 硫酸比色法测定可溶性碳水化合物方法为 ： 蔗糖标准溶液的配制 100ug ml ； 称取 100mg 分析纯无水蔗糖， 溶于蒸馏水中， 并定容 至 100ml 容量瓶中， 使用时再稀释 10 倍， 即浓度为 100ug ml ； 蒽酮试剂 ： 称取 1.0g 蒽酮溶于 1000ml 浓硫酸中， 冷却至室温后置于棕色瓶中， 冰箱中 4保存， 备用 蔗糖标准曲线的制作 ： 取标准容易分别稀释成0、 20、 40、 60、 80、 100ugml不同梯度的 标准溶液， 量取稀释后的标准溶液 。
12、1.0ml， 加入蒽酮溶液 5ml， 迅速摇匀， 待冷却后 620nm 波 长下比色 ； 用线性回归方程制定标准曲线 ； 测定方法 ： 称取烘干至恒重的粉末样品 0.5g， 放入试管中， 加入 15ml 蒸馏水， 沸水浴 30min， 取出冷却过滤， 定容至 50ml， 得到待测样品提取液 ； 取待测样品提取液 1.0ml， 加入蒽酮试剂 5.0ml， 迅速摇匀， 冷却后在紫外分光光度计 620nm 波长下比色 ； 将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。 4. 如权利要求 1 所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特 征在于， 在步骤四中， 青贮饲料的 pH 值。
13、及有机酸的测定具体方法为 ： 准确称取 20g 样品， 加 入 180ml 蒸馏水， 搅拌均匀， 置于 4冰箱中浸提 24h， 四层粗纱布过滤， 用 pH 测定仪测滤液 pH ； 将滤液 3500rmin-1离心 15min， 取上清液 0.45um 滤膜过滤后用 HPLC 测定乳酸、 乙酸、 丙酸和丁酸含量。 5. 如权利要求 1 所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特 征在于， 在步骤四中， 氨态氮的测定使用苯酚 - 次氯酸钠比色法测定， 具体步骤以下步骤 ： 苯酚试剂 ： 称取 0.15g 亚硝基铁氰化氯 25g 溶解于 1.5L 蒸馏水中， 再加入 33ml90。
14、 w v 苯酚溶液， 定容至 3L 后， 储存在棕色瓶中， 备用 ； 次氯酸钠试剂 ： 将 15g 分析纯氢氧化钠溶解于 2L 蒸馏水中， 再次加入 113.6g 分析纯 七水磷酸氢二钠， 中火加热并不断搅拌至完全溶解 ； 冷却后加入 150m15.25次氯酸钠， 混 匀， 定容至 3L， 贮存于棕色瓶中备用 ； 标准铵溶液 ： 称取 0.6607g 烘干至恒重的分析纯硫酸铵溶于蒸馏水中， 定容至 100ml， 配制成 100mmol L 的铵储备液 ； 将储备液稀释成 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0mmol L 不同梯 度的标准液 ； 具体操作步骤 ： 向每只试管中加入50u。
15、l经稀释的样本液或标准液， 空白为50ul的蒸馏 权 利 要 求 书 CN 103750077 A 3 3/3 页 4 水， 各试管中加入 2.5ml 的苯酚试剂， 摇匀 ； 再次加入 2ml 的次氯酸钠试剂， 摇匀 ； 将混合液 于 95恒温水浴 5min ； 冷却后 630nm 波长下分光光度计下比色， 记录吸光值并计算。 6. 如权利要求 1 所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 其特 征在于， 该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法得出采用乳酸菌添加剂 I， 添加量为 0.37gkg-1FM 作为青贮添加剂。 权 利 要 求 书 CN 103750077。
16、 A 4 1/10 页 5 不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法 技术领域 0001 本发明属于川西北高寒牧区青贮添加剂技术领域， 尤其涉及一种不同乳酸菌菌制 剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法。 背景技术 0002 虉草属于禾本科虉草属， 广泛分布于北美、 北欧和亚洲等温带地区， 在我国各地都 有分布， 因其具有较强的抗逆性、 较高产量和营养价值而被广泛应用于饲草、 人工湿地、 生 物能源等领域。然而由于其具有较高的 N 带走量而一直被作为入侵草来研究， 因而如何有 效利用虉草成为当今的热点。四川省草原科学研究院选育的川草引 3 号虉草适宜于川西北 高原地区及周边省区的高寒牧区推。
17、广种植， 最适宜在海拔 2800 3600m 的寒温 - 亚寒草甸 地区种植。但是其收获时期恰值雨季， 干草调制困难， 不利于牧草的有效存储， 导致饲草营 养价值流失严重， 饲草利用率低下。 青贮调制能够很好地保藏虉草的营养成分， 为牲畜提供 优质的虉草青贮饲料。 附着在青贮原料表面上的乳酸菌能够在厌氧条件下通过乳酸发酵有 效将可溶性碳水化合物转化为乳酸， 致使青贮体 pH 下降， 抑制有害微生物的活动， 从而有 效保存青贮饲料。虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物数量， 不易 自然青贮成功。 乳酸菌添加剂能够加速乳酸发酵进程， 有效改善青贮饲料的发酵品质、 营养 价值和有氧稳。
18、定性， 为牲畜提供优质的青贮饲料。 发明内容 0003 本发明实施例的目的在于提供一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质 影响的方法， 旨在解决现有的虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物 数量， 不易自然青贮成功的问题。 0004 本发明实施例是这样实现的， 一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影 响的方法， 该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法包括以下步骤 ： 0005 步骤一， 选择青宝 II 号添加剂、 乳酸菌添加剂 I、 乳酸菌添加剂 II 三种乳酸菌， 每 种乳酸菌添加剂选择 3 个添加剂梯度， 另设一组 FM 生理盐水对照 ； 0006 步骤。
19、二， 将虉草留茬 2cm 3cm 刈割， 就地自然萎蔫 2h 3h， 收获人工运回实验 室， 用铡刀将虉草切成 2cm 3cm 后混合均匀并加入青宝 II 号添加剂、 乳酸菌添加剂 I、 乳 酸菌添加剂 II 添加剂 ； 0007 步骤三， 再次混匀后装入 30cm25cm 的聚乙烯青贮袋中， 每袋 300g， 用真空封口 机抽真空后密封， 置于室温储藏 60d 后， 开封取样分析青贮发酵品质和化学成分 ； 0008 步骤四， 测定青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、 粗蛋白、 可溶性碳水化合 物、 中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分、 青贮饲料的 pH 值及有机酸和氨态氮 ； 0009 步骤五，。
20、 数据采用 Excel2003 和 SPSS17 软件进行方差分析， 用 Duncan 法对平均值 进行多重比较。 0010 进一步， 在步骤一中， FM 生理盐水的添加量为 5mlkg-1； 青宝 II 号添加剂的 3 个 说 明 书 CN 103750077 A 5 2/10 页 6 添加剂梯度添加量分别为 ： 0.01mlkg-1； 0.03mlkg-1； 0.05mlkg-1； 乳酸菌添加剂 I 的 3 个添加剂梯度添加量分别为 ： 0.073mlkg-1； 0.22mlkg-1； 0.37mlkg-1； 乳酸菌添加剂 II 的 3 个添加剂梯度添加量分别为 ： 0.011mlkg-1。
21、； 0.033mlkg-1； 0.055mlkg-1。 0011 进一步， 在步骤四中， 青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、 粗蛋白、 可溶性碳 水化合物、 中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为 ： 在 65条件下烘干 48h 测定干物质， 使用微型植物样粉碎机粉碎原料， 过 1mm 筛， 采用凯式定氮法测定粗蛋白， 采 用范氏方法测定中性洗涤纤维、 酸性洗涤纤维， 采用蒽酮 - 硫酸法测定可溶性碳水化合物 ； 0012 凯氏定氮法包括以下步骤 ： 0013 称取 0.5g 的样品， 使用定性滤渣包裹好， 放入消化管中， 加入硫酸钾 - 硫酸铜 15 1 混合粉末 ； 加入 10m。
22、l 浓硫酸， 与 420下进行消煮 ； 消煮液至清亮蓝色为宜 ； 配制 40氢氧化钠， l的硼酸吸收液和 0.1M 盐酸溶液， 用全自动定氮仪进行测定 ； 0014 范式法测定中、 酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤 ： 0015 称取 30.0g 分析纯十六烷基硫酸钠 ； 18.6lg 分析纯乙二胺四乙酸二钠 ； 6.8lg 分 析纯十水四硼酸钠 ； 4.56g 分析纯无水磷酸氢二钠， 10.0ml 分析纯三甘醇 ； 全部溶解于 lL 蒸馏水中， 控制 pH 值在 6.9-7.1 之间 ； 酶活性在 340000M.W.U ml 的 Alpha- 淀粉酶 ； 分 析纯无水亚硫酸钠， 称取烘干至恒。
23、重、 过 2mm 筛的样品 0.45-0.55g 放入已经称重的滤袋 中， 距离袋口 4cm 封口 ； 称取一个空白袋作为对照 ； 滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘 不用区分样品编号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放 入纤维分析容器中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下 ； 遵循 ANKOM2000 全自动分 析仪的操作 ； NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋将水挤出， 把滤袋放 入 250ml 烧杯中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5min， 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干至恒重， 冷却沉重后。
24、计算 NDF 的含量 ； 0016 酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤 ： 0017 酸性洗涤剂 2十六烷基三甲基溴化铵的配制 ： 称取 20g 化学纯十六烷基溴化铵 溶于 1000ml， 1.00mol 硫酸溶液中， 搅拌均匀， 必要时过滤 ； 0018 1.00mol L 硫酸溶液的配制 ： 量取 55.74ml 浓硫酸， 化学纯， 90， 比重 1.84， 慢慢加入已经装有 1000ml 蒸馏水的烧杯中， 冷却至室温， 定容至 1000ml 容量瓶中定容， 标 定 ； 0019 称取烘干至恒重、 过 2mm 筛的样品 0.45-0.55g 放入已经称重的滤袋中， 距离袋口 4cm 封口 ； 。
25、称取一个空白袋作为对照， 滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘不用区分样 品编号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放入纤维分析 容器中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下 ； 遵循 ANKOM2000 全自动分析仪的操作 ； NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋将水挤出， 把滤袋放入 250ml 烧杯 中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5min， 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干至恒 重， 冷却沉重后计算 NDF 的含量 ； 0020 蒽酮 - 硫酸比色法测定可溶性碳水化合物方法为 ： 0021 蔗糖标准。
26、溶液的配制 100ug ml ； 称取 100mg 分析纯无水蔗糖， 溶于蒸馏水中， 并 定容至 100ml 容量瓶中， 使用时再稀释 10 倍， 即浓度为 100ug ml ； 0022 蒽酮试剂 ： 称取 1.0g 蒽酮溶于 1000ml 浓硫酸中， 冷却至室温后置于棕色瓶中， 冰 说 明 书 CN 103750077 A 6 3/10 页 7 箱中 4保存， 备用 0023 蔗糖标准曲线的制作 ： 取标准容易分别稀释成 0、 20、 40、 60、 80、 100ug ml 不同 梯度的标准溶液， 量取稀释后的标准溶液 1.0ml， 加入蒽酮溶液 5ml， 迅速摇匀， 待冷却后 620n。
27、m 波长下比色 ； 用线性回归方程制定标准曲线 ； 0024 测定方法 ： 称取烘干至恒重的粉末样品 0.5g， 放入试管中， 加入 15ml 蒸馏水， 沸水 浴 30min， 取出冷却过滤， 定容至 50ml， 得到待测样品提取液 ； 0025 取待测样品提取液 1.0ml， 加入蒽酮试剂 5.0ml， 迅速摇匀， 冷却后在紫外分光光 度计 620nm 波长下比色 ； 将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。 0026 进一步， 在步骤四中， 青贮饲料的 pH 值及有机酸的测定具体方法为 ： 准确称取 20g 样品， 加入 180ml 蒸馏水， 搅拌均匀， 置于 4冰箱中浸提 24h。
28、， 四层粗纱布过滤， 用 pH 测定 仪测滤液 pH ； 将滤液 3500r min-1离心 15min， 取上清液 0.45um 滤膜过滤后用 HPLC 测定乳 酸、 乙酸、 丙酸和丁酸含量。 0027 进一步， 在步骤四中， 氨态氮的测定使用苯酚 - 次氯酸钠比色法测定， 具体步骤以 下步骤 ： 0028 苯酚试剂 ： 称取 0.15g 亚硝基铁氰化氯 25g 溶解于 1.5L 蒸馏水中， 再加入 33ml90 w v 苯酚溶液， 定容至 3L 后， 储存在棕色瓶中， 备用 ； 0029 次氯酸钠试剂 ： 将15g分析纯氢氧化钠溶解于2L蒸馏水中， 再次加入113.6g分析 纯七水磷酸氢二。
29、钠， 中火加热并不断搅拌至完全溶解 ； 冷却后加入 150m15.25次氯酸钠， 混匀， 定容至 3L， 贮存于棕色瓶中备用 ； 0030 标准铵溶液 ： 称取 0.6607g 烘干至恒重的分析纯硫酸铵溶于蒸馏水中， 定容至 100ml， 配制成 100mmol L 的铵储备液 ； 将储备液稀释成 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0mmol L 不同梯度的标准液 ； 0031 具体操作步骤 ： 向每只试管中加入50ul经稀释的样本液或标准液， 空白为50ul的 蒸馏水， 各试管中加入 2.5ml 的苯酚试剂， 摇匀 ； 再次加入 2ml 的次氯酸钠试剂， 摇匀 ； 将混 合液于 9。
30、5恒温水浴 5min ； 冷却后 630nm 波长下分光光度计下比色， 记录吸光值并计算。 0032 进一步， 该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法得出采用乳酸 菌添加剂 I， 添加量为 0.37gkg-1FM 作为青贮添加剂。 0033 本发明提供的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法， 通过以抽 穗期虉草为研究对象， 探讨青宝II号、 乳酸菌添加剂I、 乳酸菌添加剂II三种乳酸菌添加剂 的不同添加比例对川西北虉草青贮品质的影响， 表明虉草自然青贮不易成功 ； 各乳酸菌添 加剂均能够显著降低虉草青贮饲料的 pH、 氨态氮与总氮比值 (P0.05)， 显著增加乳酸和乙。
31、 酸含量 (P0.05)， 改善虉草青贮饲料的发酵品质 ； 乳酸菌添加剂能够有效改善虉草青贮饲 料的营养成分 ； 各乳酸菌添加剂的不同添加比例对虉草青贮饲料的发酵品质和营养成分影 响不同， 采用乳酸菌添加剂 I(0.37g kg-1FM) 作为川西北高寒牧区青贮添加剂， 致使青贮体 pH下降， 抑制有害微生物的活动， 从而有效保存青贮饲料。 本发明的飞风机的， 操作方便， 较 好的解决了现有的虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物数量， 不易 自然青贮成功的问题。 附图说明 说 明 书 CN 103750077 A 7 4/10 页 8 0034 图 1 是本发明实施例提供的不同。
32、乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的 方法流程图。 具体实施方式 0035 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0036 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 0037 如图 1 所示， 本发明实施例的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的 方法包括以下步骤 ： 0038 S101 ： 选择青宝 II 号添加剂、 乳酸菌添加剂 I、 乳酸菌添加剂 II 三种乳酸菌， 每种 乳酸菌添加剂选择 3 个添加剂梯度， 另设一组 。
33、FM 生理盐水对照 ； 0039 S102 ： 将虉草留茬 2cm 3cm 刈割， 就地自然萎蔫 2h 3h， 收获人工运回实验室， 用铡刀将虉草切成2cm3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、 乳酸菌添加剂I、 乳酸菌 添加剂 II 添加剂 ； 0040 S103 ： 再次混匀后装入 30cm25cm 的聚乙烯青贮袋中， 每袋约 300g， 用真空封口 机抽真空后密封， 置于室温储藏 60d 后， 开封取样分析青贮发酵品质和化学成分 ； 0041 S104 ： 测定青贮原料和青贮饲料的常规成分、 青贮饲料的 pH 值及有机酸和氨态 氮 ； 0042 S105 ： 数据采用Excel2003。
34、和SPSS17软件进行方差分析， 用Duncan法对平均值进 行多重比较。 0043 在步骤 S101 中 ： FM 生理盐水的添加量为 5mlkg-1； 青宝 II 号添加剂的 3 个添加 剂梯度添加量分别为 ： 0.01m1kg-l； 0.03mlkg-1； 0.05mlkg-1； 0044 乳酸菌添加剂 I 的 3 个添加剂梯度添加量分别为 ： 0.073mlkg-1； 0.22mlkg-1； 0.37mlkg-1； 0045 乳酸菌添加剂 II 的 3 个添加剂梯度添加量分别为 ： 0.011ml kg-1； 0.033ml kg-1； 0.055mlkg-1； 0046 在步骤 S1。
35、04 中， 青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、 粗蛋白、 可溶性碳水化 合物、 中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为 ： 在 65条件下烘干 48h 测定 干物质， 使用微型植物样粉碎机粉碎原料， 过 1mm 筛， 采用凯式定氮法测定粗蛋白， 采用范 氏方法测定中性洗涤纤维、 酸性洗涤纤维， 采用蒽酮 - 硫酸法测定可溶性碳水化合物 ； 0047 (1) 凯氏定氮法 ： 0048 准确称取0.5g的样品， 使用定性滤渣包裹好， 放入消化管中， 加入加入硫酸钾-硫 酸铜 (15 1) 混合粉末 ； 加入 10ml 浓硫酸， 与 420下进行消煮。消煮液至清亮蓝色为 宜。 配制40氢氧。
36、化钠， 1的硼酸吸收液和0.1M盐酸溶液， 用全自动定氮仪进行测定(由 FOSS 公司生产 ) ； 0049 (2) 范式法测定中、 酸性洗涤纤维 NDF 的测定 ： 0050 称取 30.0g 十六烷基硫酸钠 ( 分析纯 ) ； 18.6lg 乙二胺四乙酸二钠 ( 分析纯 ) ； 6.8l g 十水四硼酸钠 ( 分析纯 ) ； 4.56g 无水磷酸氢二钠 ( 分析纯 )， 10.0ml 三甘醇 ( 分析 说 明 书 CN 103750077 A 8 5/10 页 9 纯 ) ； 全部溶解于 1L 蒸馏水中， 控制 pH 值在 6.9-7.1 之间 ； 酶活性在 340000M.W.U ml 。
37、的 Alpha- 淀粉酶。无水亚硫酸钠 ( 分析纯 ) ； 0051 称取烘干至恒重、 过 2mm 筛的样品 0.45-0.55g 放入已经称重的滤袋中， 距离袋口 4cm 封口。准确称取一个空白袋作为对照。滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘不用区 分样品编号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放入纤维 分析容器中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下。遵循 ANKOM2000 全自动分析仪的 操作。NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋将水挤出， 把滤袋放入 250ml 烧杯中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5min，。
38、 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干 至恒重， 冷却沉重后计算 NDF 的含量 ； 0052 ADF 的测定 ： 0053 酸性洗涤剂 (2十六烷基三甲基溴化铵 ) 的配制 ： 称取 20g 十六烷基溴化铵 (CTAB， 化学纯， 364.47) 溶于 1000ml， 1.00mol 硫酸溶液中， 搅拌均匀， 必要时过滤 ； 0054 1.00mol L 硫酸溶液的配制 ： 量取约 55.74ml 浓硫酸 ( 化学纯， 90， 比重 1.84) 慢慢加入已经装有 1000ml 蒸馏水的烧杯中， 冷却至室温， 定容至 1000ml 容量瓶中定容， 标 定。 0055 称取烘干至恒重、 。
39、过 2mm 筛的样品 0.45-0.55g 放入已经称重的滤袋中， 距离袋口 4cm 封口。准确称取一个空白袋作为对照。滤袋架上最多放 24 个样品包， 九个托盘不用区 分样品编号， 每个托盘放置 3 个滤袋， 托盘间呈 120 度放置， 将放置好滤袋的支架放入纤维 分析容器中， 放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下。遵循 ANKOM2000 全自动分析仪的 操作。NDF 分析及洗涤过程结束， 打开盖子取出样品， 轻压滤袋将水挤出， 把滤袋放入 250ml 烧杯中， 加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡 3-5min， 从丙酮中取出滤袋风干， 在烘箱中 102烘干 至恒重， 冷却沉重后计算 NDF 的含量。
40、。 0056 (3) 蒽酮 - 硫酸比色法测定可溶性碳水化合物 (WSC) ： 0057 蔗糖标准溶液的配制 (100ug/ml) ； 准确称取 100mg 分析纯无水蔗糖， 溶于蒸馏水 中， 并定容至 100ml 容量瓶中， 使用时再稀释 10 倍， 即浓度为 100ug/ml。 0058 蒽酮试剂 ： 称取 1.0g 蒽酮溶于 1000ml 浓硫酸中， 冷却至室温后置于棕色瓶中， 冰 箱中 4保存， 备用。 0059 蔗糖标准曲线的制作 ： 取标准容易分别稀释成 0、 20、 40、 60、 80、 100ug ml 不同 梯度的标准溶液， 量取稀释后的标准溶液 1.0ml， 加入蒽酮溶液。
41、 5ml， 迅速摇匀， 待冷却后 620nm 波长下比色。用线性回归方程制定标准曲线。 0060 测定方法 ： 称取烘干至恒重的粉末样品 0.5g， 放入试管中， 加入 15ml 蒸馏水， 沸水 浴 30min， 取出冷却过滤， 定容至 50ml， 得到待测样品提取液。 0061 取待测样品提取液 1.0ml， 加入蒽酮试剂 5.0ml， 迅速摇匀， 冷却后在紫外分光光 度计 620nm 波长下比色。将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。 0062 青贮饲料的 pH 值及有机酸的测定具体方法为 ： 准确称取 20g 样品， 加入 180ml 蒸馏水， 搅拌均匀， 置于 4冰箱中浸提 。
42、24h， 四层粗纱布过滤， 用 pH 测定仪测滤液 pH( 奥立龙 pH 计 )。将滤液 3500rmin-1离心 15min， 取上清液 0.45um 滤膜过滤后用 HPLC(KC-811column， Shodex ； Shimadzu， 日本 ； 柱温 35； 流速 0.7mLmin-1； 210nm， SPD 检 测器 ) 测定乳酸、 乙酸、 丙酸和丁酸含量。 说 明 书 CN 103750077 A 9 6/10 页 10 0063 氨态氮的测定使用苯酚 - 次氯酸钠比色法测定 ： 0064 苯酚试剂 ： 准确称取 0.15g 亚硝基铁氰化氯 (K2Fe(CN)5(NO)2H20， 。
43、297.95， 化学 纯， 25g) 溶解于 1.5L 蒸馏水中， 再加入 33ml(90 w v) 苯酚溶液， 定容至 3L 后， 储存在 棕色瓶中， 备用。 0065 次氯酸钠试剂 ： 将 15g 氢氧化钠 ( 分析纯 ) 溶解于 2L 蒸馏水中， 再次加入 113.6g 七水磷酸氢二钠 ( 分析纯 )， 中火加热并不断搅拌至完全溶解。冷却后加入 150m15.25次 氯酸钠， 混匀， 定容至 3L。贮存于棕色瓶中备用。 0066 标准铵溶液 ： 称取 0.6607g 烘干至恒重的硫酸铵 ( 化学纯 ) 溶于蒸馏水中， 定 容至 100ml， 配制成 100mmol L 的铵储备液。将上诉。
44、储备液稀释成 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0mmol L 不同梯度的标准液。 0067 具体操作步骤 ： 向每只试管中加入 50ul 经适当稀释的样本液或标准液， 空白为 50ul 的蒸馏水， 各试管中加入 2.5ml 的苯酚试剂， 摇匀。再次加入 2ml 的次氯酸钠试剂， 摇 匀 ； 将混合液于 95恒温水浴 5min ； 冷却后 630nm 波长下分光光度计下比色， 记录吸光值 并计算。 0068 通过以下具体实施例和分析对本发明做进一步的说明 ： 0069 1 材料与方法 ： 0070 1.1 试验材料与添加剂 0071 2011 年 7 月 选 择 红 原 县 二 农 。
45、场 处 于 抽 穗 期 的 “川 草 引 3 号”虉 草 (Phalarisarundinacea L.) 作为青贮原料， 添加剂为青宝 II 号 (FS) 由北京塔山科技有限 公司提供， 乳酸菌添加剂 I(LAB I， 以异型乳酸菌为主 ) 和乳酸菌添加剂 II(LABII， 以同型 乳酸菌为主 ) 由 Medipharm USA 公司提供。 0072 1.2 试验设计 0073 试验采用完全随机区组设计， 每种乳酸菌添加剂添加剂选择 3 个添加剂梯度， 另 设一组对照 (CK， 5m1kg-1FM 生理盐水 )， 各种乳酸菌添加剂的添加比列如表 1 所示 ： 0074 表 1 虉草青贮试验。
46、设计方案 0075 0076 1.3 试验方法 ： 0077 1.3.1 青贮饲料的调制 ： 0078 将虉草留茬2cm3cm刈割， 就地自然萎蔫2h3h， 收获人工运回实验室， 用铡刀 将虉草切成 2cm 3cm 后混合均匀并加入添加剂， 再次混匀后装入 30cm25cm 的聚乙烯青 贮袋中， 每袋约 300g， 用真空封口机抽真空后密封， 置于室温储藏 60d 后， 开封取样分析青 贮发酵品质和化学成分 ； 说 明 书 CN 103750077 A 10 7/10 页 11 0079 1.3.2 分析项目及方法 ： 0080 依据农业部 青贮饲料质量评定标准 ， 从色泽、 气味、 质地和霉。
47、变等方面对青贮饲 料进行感官评定。 0081 青贮原料和青贮饲料的常规成分的测定 ： 在 65条件下烘干 48h 测定干物质 (DM)， 使用微型植物样粉碎机粉碎原料， 过 1mm 筛， 采用凯式定氮法测定粗蛋白 (CP)， 采用 范氏方法测定中性洗涤纤维 (NDF)、 酸性洗涤纤维 (ADF)， 采用蒽酮 - 硫酸法测定可溶性碳 水化合物 (WSC)。 0082 青贮饲料的pH值及有机酸的测定 ： 准确称取20g样品， 加入180ml蒸馏水， 搅拌均 匀， 置于 4冰箱中浸提 24h， 四层粗纱布过滤， 用 pH 测定仪测滤液 pH( 奥立龙 pH 计 )。将 滤液3500r min-1离心。
48、15min， 取上清液0.45um滤膜过滤后用HPLC(KC-811column， Shodex ； Shimadzu， 日本 ； 柱温 35 ； 流速 0.7mLmin-1； 2l0nm， SPD 检测器 ) 测定乳酸、 乙酸、 丙酸 和丁酸含量。 0083 氨态氮的测定 ： 使用苯酚 - 次氯酸钠比色法测定。 0084 1.4 数据处理 ： 0085 数据采用 Excel2003 和 SPSS17 软件进行方差分析， 用 Duncan 法对平均值进行多 重比较。 0086 2 结果与分析 ： 0087 2.1 虉草青贮原料的化学成分 ： 0088 虉草青贮原料的化学成分如表 2 所示。虉草干物质含量 (DM)、 粗蛋白 (CP)、 可 溶性碳水化合物 (WSC)、 中性洗涤纤维 (NDF) 和酸性洗涤纤维 (ADF) 分别为 374.76、 106.9l、 171.63、 655.7l、 318.70。 0089 表 2 虉草的化学成分 0090 0091 2.2 虉草青贮饲料的感官评定 ： 0092 所有虉草青贮饲料为黄色， 具有酸香味， 质地柔软不黏手， 无霉变和腐臭味道。 0093 2.3 虉草青贮饲料的发酵品质 ： 0094 虉草青贮饲料的发酵品质如表。