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重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂.pdf

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文档编号：6661573

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1、(10)授权公告号 CN 101904968 B (45)授权公告日 2011.11.09 CN 101904968 B *CN101904968B* (21)申请号 201010238258.7 (22)申请日 2010.07.27 A61K 31/704(2006.01) A61K 36/896(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人天津大学地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号 (72)发明人高文远王洁银满淑丽杨柳 (74)专利代理机构天津才智专利商标代理有限公司 12108 代理人庞学欣 (54) 发明名称重楼薯蓣类皂苷。

2、的制备方法及其抗肿瘤药物制剂 (57) 摘要本发明公开了一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂。其中重楼薯蓣类皂苷的制备方法是利用醇提的方法从重楼中提取重楼薯蓣类皂苷，并利用树脂填料和硅胶色谱柱的结合来有效去除重楼中的糖、蛋白质及氨基酸等杂质，提取率高达 82 -88，所以有效成分的含量高，并且工艺简单，质量可控，因此适于工业化生产。另外，提取物重楼薯蓣类皂苷成分明确，抗肿瘤作用明显，并且能够直接制成或与常用辅料配合而制成抗肿瘤药物制剂，制剂中含有 40 -60的重楼薯蓣类皂苷和 60 -40的常用药用辅料。 (51)Int.Cl. 审查员胡。

3、嘉蕴 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 6 页附图 1 页 CN 101904968 B1/1 页 2 1. 一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法包括按顺序进行的下列步骤： 1)将重楼粉碎至颗粒状，然后加入60-90的乙醇溶液，重楼与60-90乙醇溶液的加入比为1g3-20ml，加热回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液并浓缩至每毫升浓缩液相当于 1g 生药； 2) 将上述浓缩液用水或 1 -40的乙醇溶液稀释 1-20 倍，然后将上述稀释液通过皂苷吸附型大孔吸附树脂柱进。

4、行吸附，之后用水或 1 -40的乙醇溶液洗脱，再依次用 40 -60、 70 -90的乙醇溶液洗脱，收集用 70 -90乙醇溶液洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液； 3) 在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入为其重量 1-3 倍的硅胶并混合均匀，减压干燥得拌样硅胶； 4) 将上述拌样硅胶装入为其重量 20-50 倍的硅胶柱中，然后用由乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种及水而制成的混合溶剂进行洗脱，混合溶剂中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种和水的体积比为 72 76 18 20 4，用硅胶 G 。

5、板对洗脱液在线进行检测，收集含重楼薯蓣类皂苷成分的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得粉末状重楼薯蓣类皂苷。 2. 根据权利要求 1 所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的皂苷吸附型大孔吸附树脂为 D101 型、 SP 型或 AB-8 型。 3. 根据权利要求 1 所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的重楼与皂苷吸附型大孔吸附树脂的重量比为 3 1-10 1，皂苷吸附型大孔吸附树脂柱的柱径与柱高之比为 1 4-1 8。 4. 根据权利要求 1 所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的粉末状重楼薯蓣类皂苷能够制备成临床上常用。

6、的固体口服制剂或液体口服制剂。 5. 一种以权利要求 1 所述的重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂是由 40 -60的重楼薯蓣类皂苷和 60 -40的常用药用辅料组成。 6. 根据权利要求 5 所述的抗肿瘤药物制剂，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂为临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂。权利要求书 CN 101904968 B1/6 页 3 重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂技术领域 0001 本发明涉及属于中草药活性成分的制备及应用技术领域，特别是涉及一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂。背。

7、景技术 0002 重楼 (Rhizoma paridis)，又称七叶一枝花，是一种百合科重楼属植物，以蚤休之名首载于神农本草经，在中药的应用中已有上千年的历史，并且在抗癌的中药配方中经常用到。重楼总皂苷是重楼多重药理作用的主要有效成分，具有抗菌消炎、止痛镇定和抗肿瘤之功效。其主要活性成分甾体皂苷中以薯蓣类皂苷的含量最高。薯蓣类皂苷即皂苷元为薯蓣皂苷元，与配糖基为葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖中的一种或几种以直链或支链形式组合而成。 0003 近年来重楼中活性成分的制备及其抗肿瘤活性已受到众多研究者的广泛关注：重楼中有效成分皂苷对动物移植性肿瘤 8180、 S。

8、37、 EAC、 ARS、 L759等有明显的抑制作用；重楼总皂苷对 H22动物移植性肿瘤生长具有影响，重楼总皂苷 350mg/kg ig 及 10、 5mg/kg ig 均能明显抑制肿瘤细胞的生长；重楼中单体皂苷和对小鼠淋巴白血病 (L1210) 具有细胞毒作用等。但迄今为止尚未见到重楼薯蓣类皂苷的制备工艺以及抗肿瘤生物活性方面的研究见诸报道。发明内容 0004 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种方法简单且适于工业化生产的重楼薯蓣类皂苷的制备方法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种以上述重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂。 0006 。

9、为了达到上述目的，本发明提供的重楼薯蓣类皂苷的制备方法包括按顺序进行的下列步骤： 0007 1)将重楼粉碎至颗粒状，然后加入60-90的乙醇溶液，重楼与60-90乙醇溶液的加入比为1g3-20ml，加热回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液并浓缩至每毫升浓缩液相当于 1g 生药； 0008 2) 将上述浓缩液用水或 1 -40的乙醇溶液稀释 1-20 倍，然后将上述稀释液通过皂苷吸附型大孔吸附树脂柱进行吸附，之后用水或 1 -40的乙醇溶液洗脱，再依次用 40 -60、 70 -90的乙醇溶液洗脱，收集用 70 -90乙醇溶液洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密。

10、度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液； 0009 3) 在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入为其重量 1-3 倍的硅胶并混合均匀，减压干燥得拌样硅胶； 0010 4) 将上述拌样硅胶装入为其重量 20-50 倍的硅胶柱中，然后用由乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种及水而制成的混合溶剂进行洗脱，用硅胶 G 说明书 CN 101904968 B2/6 页 4 板对洗脱液在线进行检测，收集含重楼薯蓣类皂苷成分的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得粉末状重楼薯蓣类皂苷。 0011 所述的皂苷吸附型大孔吸附树脂为 D101 型、 SP 型或 AB-8 型。。

11、 0012 所述的重楼与皂苷吸附型大孔吸附树脂的重量比为 3 1-10 1，皂苷吸附型大孔吸附树脂柱的柱径与柱高之比为 1 4-1 8。 0013 所述的步骤 4) 的混合溶剂中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种和水的体积比为 72 76 18 20 4。 0014 所述的粉末状重楼薯蓣类皂苷能够制备成临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂。 0015 本发明提供的以上述重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂是由 40 -60的重楼薯蓣类皂苷和 60 -40的常用药用辅料组成。药用辅料为常规的药物赋形剂，如稀释剂、溶剂、崩解剂、矫味剂和防腐。

12、剂等。 0016 所述的抗肿瘤药物制剂为临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂，比如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸或口服液。 0017 本发明提供的重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂具有如下有益效果： 0018 1、本制备方法是利用醇提的方法从重楼中提取重楼薯蓣类皂苷，并利用树脂填料和硅胶色谱柱的结合来有效去除重楼中的糖、蛋白质及氨基酸等杂质，提取率高达 82 -88，所以有效成分的含量高，并且工艺简单，质量可控，因此适于工业化生产。 0019 2、提取物重楼薯蓣类皂苷成分明确，抗肿瘤作用明显，并且能够直接制成或与常用辅料配合而制成抗肿瘤药物。

13、制剂。附图说明 0020 图 1 为本发明实验中绘制的腹水瘤小鼠生存率曲线图。具体实施方式 0021 以下结合实施例详述本发明，实施例仅用于说明，但不能限制本发明的范围。 0022 实施例 1 ： 0023 将 1kg 重楼粉碎至颗粒状，然后加入 4 升 75的乙醇溶液，加热回流提取 3 次，每次 3 小时，合并提取液并浓缩至 1L ；将上述浓缩液用水稀释 10 倍，然后将上述稀释液通过 D101 型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为 5 1，大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为 1 8 ；然后依次用 10 升 30的乙醇溶液、 8 升 50的乙。

14、醇溶液和 12 升 80的乙醇溶液进行洗脱，收集用 80乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入 2 倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 30 倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、甲醇和水的体积比为 74 18 4 的混合溶剂进行洗脱，用硅胶 G 板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得 15g 棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中 Formosanin 。

15、不低于 26， Gracillin 不低于 14， Polyphyllin D 不低于 38，说明书 CN 101904968 B3/6 页 5 Dioscin 含量不低于 2，上述这些成分的总量不低于 80 0024 实施例 2 ： 0025 将 1kg 重楼粉碎至颗粒状，然后加入 4 升 80的乙醇溶液，加热回流提取 3 次，每次 2 小时，合并提取液并浓缩至 1L ；将上述浓缩液用 20的乙醇溶液稀释 8 倍，然后将上述稀释液通过 SP825 型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为 4 1 ；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为 1 7，之后。

16、依次用 10 升 25的乙醇溶液、 7 升 55的乙醇溶液和 12 升 75的乙醇溶液进行洗脱，收集用 75乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入 3 倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 40 倍的硅胶柱中，用乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 76 20 4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶 G 板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得 15g 棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷。

17、包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中 Formosanin 不低于 26， Gracillin 不低于 14， Polyphyllin D 不低于 38， Dioscin 含量不低于 2，上述这些成分的总量不低于 80。 0026 实施例 3 ： 0027 将 1kg 重楼粉碎至颗粒状，然后加入 3 升 85的乙醇溶液，加热回流提取 3 次，每次 3 小时，合并提取液并浓缩至 1L ；将上述浓缩液用 25的乙醇溶液稀释 7 倍，然后将上述稀释液通过 AB-8 型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为 3 1 ；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为 1 6，。

18、之后依次用 10 升 30的乙醇溶液、 8 升 50的乙醇溶液和 12 升 80的乙醇溶液进行洗脱，收集用 80乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入 3 倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 30 倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、乙醇和水的体积比为 74 18 4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶 G 板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得 15g 棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂。

19、苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中 Formosanin 不低于 26， Gracillin 不低于 14， PolyphyllinD 不低于 38， Dioscin 含量不低于 2，上述这些成分的总量不低于 80。 0028 实施例 4 ： 0029 将 1kg 重楼粉碎至颗粒状，然后加入 6 升 70的乙醇溶液，加热回流提取 2 次，每次2小时，合并提取液并浓缩至1L ；将上述浓缩液用30的乙醇溶液稀释8倍，然后将上述稀释液通过 D101 型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为 6 1 ；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为18，之后依次用1。

20、0升35的乙醇溶液、 6升50 的乙醇溶液和 12 升 85的乙醇溶液进行洗脱，收集用 85乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入 2 倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 40 倍的硅胶柱中，用乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为 74 20 4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶 G 板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得 15g 棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全。

21、部薯蓣类皂苷， Formosanin 不低于 26， Gracillin 不低于 14， Polyphyllin 说明书 CN 101904968 B4/6 页 6 D 不低于 38， Dioscin 含量不低于 2，上述这些成分的总量不低于 80。 0030 实施例 5 ： 0031 将 1kg 重楼粉碎至颗粒状，然后加入 4 升 90的乙醇溶液，加热回流提取 3 次，每次 3 小时，合并提取液并浓缩至 1L ；将上述浓缩液用 10的乙醇溶液稀释 9 倍，然后将上述稀释液通过 SP825 型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为 7 1 ；大孔吸附树脂。

22、树脂柱的柱径与柱高之比为 1 9，之后依次用 10 升 40的乙醇溶液、 5 升 60的乙醇溶液和 12 升 85的乙醇溶液进行洗脱，收集用 85乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2 的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入 3 倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 30 倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、甲醇和水的体积比为 76 20 4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶 G 板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得 15g 棕黄色粉末状重楼薯蓣。

23、类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中 Formosanin 不低于 26， Gracillin 不低于 14， Polyphyllin D 不低于 38， Dioscin 含量不低于 2，上述这些成分的总量不低于 80。 0032 实施例 6 ： 0033 将上述实施例中制成的 16g 重楼薯蓣类皂苷与 24g 微晶纤维素混合均匀，然后加入交联聚维酮1.2g，用乙醇水溶液制成软材，过20目筛制颗粒， 60下干燥1小时，整粒，之后加入 1g 硬脂酸镁，混匀，压片，即可制得 100 片重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤片剂。 0034 实施例 7 ：。

24、 0035 将上述实施例中制成的 20g 重楼薯蓣类皂苷与 10g 乳糖和 10g 糊精混合均匀，然后加入 3交联聚维酮 1.5g，用 3聚维酮乙醇水溶液制成颗粒， 60下干燥 1 小时，整粒，之后加入 1g 滑石粉，混匀，填充胶囊，即可制得 150 粒重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤胶囊剂。 0036 实施例 8 ： 0037 将上述实施例中制成的 15g 重楼薯蓣类皂苷与 10g 聚乙二醇 -6000 混合均匀，加热使其熔融，然后移至滴丸滴罐中，将药液滴至 6 8的液体石蜡中，除油，即可制得 300 粒重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤滴丸。 0038 利用本发明提供的制备方法制成的重楼。

25、薯蓣类皂苷具有治疗恶性实体瘤的作用，其药理作用可通过以下药效学实验得以验证。 0039 一、重楼薯蓣类皂苷对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用 0040 (1) 实验材料 0041 细胞株 0042 小鼠肺腺癌细胞株 LA795，人肺腺癌细胞株 A549，人结肠癌细胞株 CaCo-2，人肝癌细胞株BEL7402，人肝癌细胞株HepG2，人宫颈癌细胞Hela，人表皮癌A431，人急性髓性白血病细胞 HL-60，人肾腺癌细胞株 A498，皆由中国协和医科大学基础医学研究所提供。 0043 试剂 0044 重楼皂苷标准品皆由本发明申请人提取分离得到 ( 纯度 95 )。顺铂注射用粉。

26、针剂由齐鲁制药有限公司生产，分子量为 300。 0045 仪器 0046 细胞培养箱、酶标仪说明书 CN 101904968 B5/6 页 7 0047 (2) 实验方法 0048 将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成一定浓度的细胞悬液 ( 其中， LA795 细胞为 3104个 /mL， A549 细胞为 2104个 /mL， CaCo-2 细胞为 5104个 /mL， BEL7402 细胞为 2103个 /mL， HepG2 细胞为 1105个 /mL， Hela 细胞为 5104个 /mL， A431 细胞为 1105 个 /mL， HL-60 细胞为 2105个 /mL，。

27、A498 细胞为 1104个 /mL)，接种于 96 孔酶标板，每孔 200L。24h 后换不含血清的培养液使细胞同步化生长，每孔 200L。24h 后 ( 第三天 ) 加入含不同浓度皂苷 ( 二甲基亚砜作为溶剂，终浓度 0.1 ) 及二甲基亚砜对照的新鲜培养液，每孔 200L，受试药设 4 个剂量组，每组设 8 个平行孔，并设空白孔调零。在上述条件下培养 24h 后，在每孔中再加入 100L 无血清培养液新鲜配制的 0.5mg/mL MTT，继续培养 4h，然后在每孔中再加入 100L 二甲基亚砜以溶解 MTT 甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上。

28、测定光密度值 (OD)，重复实验 3 次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由 OD 值计算抑制率，细胞生长抑制率 ( ) (1- 样品组 OD 值 / 对照组 OD 值 )100 。 0049 (3) 实验结果 ( 见表 1) 0050 表 1 不同浓度的重楼薯蓣类皂苷对各种肿瘤细胞生长抑制率的影响 0051 0052 由上表可以看出，重楼总皂苷对各肿瘤细胞株的抑制强弱依次为LA795A549 Hela CaCo-2 HL-60 A498 A431 HepG2 BEL7402。结果表明重楼薯蓣类皂苷在体外对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。 0053 二、重楼薯蓣类皂。

29、苷对小鼠 LA795 肺腺癌移植性肿瘤抑制率的影响 0054 将肺腺癌 LA795 瘤组织于无菌条件下接种于 50 只裸小鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸小鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至 100-300mm3时，将上述小鼠随机分为 5 组，每组 10 只： (1) 重楼薯蓣类皂苷高剂量组： 100mg/kgbw(bw 代表 body weight) 灌胃； (2) 重楼薯蓣类皂苷中剂量组， 60mg/kg bw 灌胃； (3) 重楼薯蓣类皂苷低剂量组， 30mg/kg bw 灌胃； (4) 环磷酰胺组， 20mg/kg bw 腹腔注射； (5) 生理盐水组，灌胃。每只 0.。

30、2ml，使用测量瘤径的方法动态观察被试物抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每周 2 次，给药前及每次测量前分别称鼠重。肿瘤体积 (TV) 的计算公式为： TV 1/2ab2(a、 b 分别表示长宽 )。根说明书 CN 101904968 B6/6 页 8 据测量结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，计算公式为RTVVt/V0(V0即分笼给药时测量所得肿瘤体积， Vt为给药后每一次测量时的肿瘤体积 )。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C()，计算公式如下： T/C()TRTVCRTV100(其中TRTV：治疗组RTV ； CRTV：阴性对照组 RTV)，重楼薯。

31、蓣类皂苷对人肺腺癌裸小鼠移植瘤 LA795 的实验性治疗影响结果见表 2。 0055 表 2 重楼薯蓣类皂苷对人肺腺癌裸小鼠移植瘤 LA795 的实验性治疗影响 0056 0057 与生理盐水对照组比较 *p 0.05。 0058 三、重楼薯蓣类皂苷对腹水瘤小鼠生存率的影响 0059 在无菌条件下取 S180 腹水瘤细胞悬液，用生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为 1107/mL 的细胞悬液，在冰浴条件下将上述细胞悬液接种于 30 只健康小鼠的腹腔内，每只 0.2mL，接种浓度为 2106/mL。接种 3 天后将上述 30 只小鼠随机分为 3 组，每组 10 只，开始给药，每日 1 次：模型组，灌服生理盐水，每只 0.2ml ；顺铂组，按 2mg/kg bw 腹腔注射；重楼薯蓣皂苷组，经口给药，剂量 30mg/kgbw，观察小鼠的状态及死亡情况，计数小鼠的剩余只数。将上述实验数据利用统计学方法进行分析 ( 见图 1)，结果表明重楼薯蓣类皂苷能够明显提高腹水瘤小鼠的生存率。说明书 CN 101904968 B1/1 页 9 图 1 说明书附图。

摘要
申请专利号：	CN201010238258.7	申请日：	20100727
公开号：	CN101904968B	公开日：	20111109
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K31/704,A61K36/896,A61P35/00	主分类号：	A61K31/704,A61K36/896,A61P35/00
申请人：	天津大学
发明人：	高文远,王洁银,满淑丽,杨柳
地址：	300072 天津市南开区卫津路92号
优先权：	CN201010238258A
专利代理机构：	天津才智专利商标代理有限公司	代理人：	庞学欣
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内容摘要

本发明公开了一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂。其中重楼薯蓣类皂苷的制备方法是利用醇提的方法从重楼中提取重楼薯蓣类皂苷，并利用树脂填料和硅胶色谱柱的结合来有效去除重楼中的糖、蛋白质及氨基酸等杂质，提取率高达82％-88％，所以有效成分的含量高，并且工艺简单，质量可控，因此适于工业化生产。另外，提取物重楼薯蓣类皂苷成分明确，抗肿瘤作用明显，并且能够直接制成或与常用辅料配合而制成抗肿瘤药物制剂，制剂中含有40％-60％的重楼薯蓣类皂苷和60％-40％的常用药用辅料。

权利要求书

1.一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法包括按顺序进行的下列步骤：1)将重楼粉碎至颗粒状，然后加入60％-90％的乙醇溶液，重楼与60％-90％乙醇溶液的加入比为1g∶3-20ml，加热回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液并浓缩至每毫升浓缩液相当于1g生药；2)将上述浓缩液用水或1％-40％的乙醇溶液稀释1-20倍，然后将上述稀释液通过皂苷吸附型大孔吸附树脂柱进行吸附，之后用水或1％-40％的乙醇溶液洗脱，再依次用40％-60％、70％-90％的乙醇溶液洗脱，收集用70％-90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；3)在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入为其重量1-3倍的硅胶并混合均匀，减压干燥得拌样硅胶；4)将上述拌样硅胶装入为其重量20-50倍的硅胶柱中，然后用由乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种及水而制成的混合溶剂进行洗脱，混合溶剂中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种和水的体积比为72～76∶18～20∶4，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含重楼薯蓣类皂苷成分的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得粉末状重楼薯蓣类皂苷。 2.根据权利要求1所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的皂苷吸附型大孔吸附树脂为D101型、SP型或AB-8型。 3.根据权利要求1所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的重楼与皂苷吸附型大孔吸附树脂的重量比为3∶1-10∶1，皂苷吸附型大孔吸附树脂柱的柱径与柱高之比为1∶4-1∶8。 4.根据权利要求1所述的重楼薯蓣类皂苷的制备方法，其特征在于：所述的粉末状重楼薯蓣类皂苷能够制备成临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂。 5.一种以权利要求1所述的重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂是由40％-60％的重楼薯蓣类皂苷和60％-40％的常用药用辅料组成。 6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物制剂，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂为临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及属于中草药活性成分的制备及应用技术领域，特别是涉及一种重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂。

背景技术

重楼(Rhizoma paridis)，又称七叶一枝花，是一种百合科重楼属植物，以蚤休之名首载于《神农本草经》，在中药的应用中已有上千年的历史，并且在抗癌的中药配方中经常用到。重楼总皂苷是重楼多重药理作用的主要有效成分，具有抗菌消炎、止痛镇定和抗肿瘤之功效。其主要活性成分甾体皂苷中以薯蓣类皂苷的含量最高。薯蓣类皂苷即皂苷元为薯蓣皂苷元，与配糖基为葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖中的一种或几种以直链或支链形式组合而成。

近年来重楼中活性成分的制备及其抗肿瘤活性已受到众多研究者的广泛关注：重楼中有效成分皂苷对动物移植性肿瘤8180、S37、EAC、ARS、L759等有明显的抑制作用；重楼总皂苷对H22动物移植性肿瘤生长具有影响，重楼总皂苷350mg/kg ig及10、5mg/kg ig均能明显抑制肿瘤细胞的生长；重楼中单体皂苷Ⅰ和Ⅳ对小鼠淋巴白血病(L1210)具有细胞毒作用等。但迄今为止尚未见到重楼薯蓣类皂苷的制备工艺以及抗肿瘤生物活性方面的研究见诸报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种方法简单且适于工业化生产的重楼薯蓣类皂苷的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种以上述重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂。

为了达到上述目的，本发明提供的重楼薯蓣类皂苷的制备方法包括按顺序进行的下列步骤：

1)将重楼粉碎至颗粒状，然后加入60％-90％的乙醇溶液，重楼与60％-90％乙醇溶液的加入比为1g∶3-20ml，加热回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液并浓缩至每毫升浓缩液相当于1g生药；

2)将上述浓缩液用水或1％-40％的乙醇溶液稀释1-20倍，然后将上述稀释液通过皂苷吸附型大孔吸附树脂柱进行吸附，之后用水或1％-40％的乙醇溶液洗脱，再依次用40％-60％、70％-90％的乙醇溶液洗脱，收集用70％-90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；

3)在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入为其重量1-3倍的硅胶并混合均匀，减压干燥得拌样硅胶；

4)将上述拌样硅胶装入为其重量20-50倍的硅胶柱中，然后用由乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种及水而制成的混合溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含重楼薯蓣类皂苷成分的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得粉末状重楼薯蓣类皂苷。

所述的皂苷吸附型大孔吸附树脂为D101型、SP型或AB-8型。

所述的重楼与皂苷吸附型大孔吸附树脂的重量比为3∶1-10∶1，皂苷吸附型大孔吸附树脂柱的柱径与柱高之比为1∶4-1∶8。

所述的步骤4)的混合溶剂中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种、甲醇和乙醇中的任意一种和水的体积比为72～76∶18～20∶4。

所述的粉末状重楼薯蓣类皂苷能够制备成临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂。

本发明提供的以上述重楼薯蓣类皂苷作为活性成分而制成的抗肿瘤药物制剂是由40％-60％的重楼薯蓣类皂苷和60％-40％的常用药用辅料组成。药用辅料为常规的药物赋形剂，如稀释剂、溶剂、崩解剂、矫味剂和防腐剂等。

所述的抗肿瘤药物制剂为临床上常用的固体口服制剂或液体口服制剂，比如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸或口服液。

本发明提供的重楼薯蓣类皂苷的制备方法及其抗肿瘤药物制剂具有如下有益效果：

1、本制备方法是利用醇提的方法从重楼中提取重楼薯蓣类皂苷，并利用树脂填料和硅胶色谱柱的结合来有效去除重楼中的糖、蛋白质及氨基酸等杂质，提取率高达82％-88％，所以有效成分的含量高，并且工艺简单，质量可控，因此适于工业化生产。

2、提取物重楼薯蓣类皂苷成分明确，抗肿瘤作用明显，并且能够直接制成或与常用辅料配合而制成抗肿瘤药物制剂。

附图说明

图1为本发明实验中绘制的腹水瘤小鼠生存率曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例详述本发明，实施例仅用于说明，但不能限制本发明的范围。

实施例1：

将1kg重楼粉碎至颗粒状，然后加入4升75％的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液并浓缩至1L；将上述浓缩液用水稀释10 倍，然后将上述稀释液通过D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为5∶1，大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为1∶8；然后依次用10升30％的乙醇溶液、8升50％的乙醇溶液和12升80％的乙醇溶液进行洗脱，收集用80％乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为 1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入2倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量 30倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、甲醇和水的体积比为74∶18∶4的混合溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得15g棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中 Formosanin不低于26％，Gracillin不低于14％，Polyphyllin D不低于38％， Dioscin含量不低于2％，上述这些成分的总量不低于80％

实施例2：

将1kg重楼粉碎至颗粒状，然后加入4升80％的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液并浓缩至1L；将上述浓缩液用20％的乙醇溶液稀释8倍，然后将上述稀释液通过SP825型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为4∶1；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为1∶7，之后依次用10升25％的乙醇溶液、7升55％的乙醇溶液和12升 75％的乙醇溶液进行洗脱，收集用75％乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入3倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量40倍的硅胶柱中，用乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为76∶20∶4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得15g棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中Formosanin不低于26％，Gracillin不低于14％，Polyphyllin D不低于38％，Dioscin含量不低于2％，上述这些成分的总量不低于80％。

实施例3：

将1kg重楼粉碎至颗粒状，然后加入3升85％的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液并浓缩至1L；将上述浓缩液用25％的乙醇溶液稀释7倍，然后将上述稀释液通过AB-8型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为3∶1；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为1∶6，之后依次用10升30％的乙醇溶液、8升50％的乙醇溶液和12升 80％的乙醇溶液进行洗脱，收集用80％乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入3倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量30倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、乙醇和水的体积比为74∶18∶4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得15g棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中Formosanin不低于26％，Gracillin不低于14％，Polyphyllin D不低于38％，Dioscin含量不低于2％，上述这些成分的总量不低于80％。

实施例4：

将1kg重楼粉碎至颗粒状，然后加入6升70％的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩至1L；将上述浓缩液用30％的乙醇溶液稀释8倍，然后将上述稀释液通过D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为6∶1；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为1∶8，之后依次用10升35％的乙醇溶液、6升50％的乙醇溶液和12升 85％的乙醇溶液进行洗脱，收集用85％乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入2倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量40倍的硅胶柱中，用乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为74∶20∶4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得15g棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，Formosanin不低于26％，Gracillin不低于14％，Polyphyllin D 不低于38％，Dioscin含量不低于2％，上述这些成分的总量不低于80％。

实施例5：

将1kg重楼粉碎至颗粒状，然后加入4升90％的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液并浓缩至1L；将上述浓缩液用10％的乙醇溶液稀释9倍，然后将上述稀释液通过SP825型大孔吸附树脂柱进行吸附，重楼与大孔吸附树脂的重量比为7∶1；大孔吸附树脂树脂柱的柱径与柱高之比为1∶9，之后依次用10升40％的乙醇溶液、5升60％的乙醇溶液和12升 85％的乙醇溶液进行洗脱，收集用85％乙醇溶液进行洗脱后的洗脱液并浓缩至相对密度为1.2的重楼薯蓣类皂苷粗品溶液；在上述薯蓣类皂苷粗品溶液中加入3倍量重的硅胶并混合均匀，减压干燥，得拌样硅胶；将上述拌样硅胶装入为其重量30倍的硅胶柱中，用二氯甲烷、甲醇和水的体积比为76∶20∶4 的混合溶剂中的下层溶剂进行洗脱，用硅胶G板对洗脱液在线进行检测，收集含有重楼薯蓣类皂苷的洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得15g棕黄色粉末状重楼薯蓣类皂苷，经实验测定上述重楼薯蓣类皂苷包含了重楼中的全部薯蓣类皂苷，其中Formosanin不低于26％，Gracillin不低于14％，Polyphyllin D不低于38％，Dioscin含量不低于2％，上述这些成分的总量不低于80％。

实施例6：

将上述实施例中制成的16g重楼薯蓣类皂苷与24g微晶纤维素混合均匀，然后加入交联聚维酮1.2g，用乙醇水溶液制成软材，过20目筛制颗粒，60 ℃下干燥1小时，整粒，之后加入1g硬脂酸镁，混匀，压片，即可制得100 片重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤片剂。

实施例7：

将上述实施例中制成的20g重楼薯蓣类皂苷与10g乳糖和10g糊精混合均匀，然后加入3％交联聚维酮1.5g，用3％聚维酮乙醇水溶液制成颗粒，60 ℃下干燥1小时，整粒，之后加入1g滑石粉，混匀，填充胶囊，即可制得 150粒重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤胶囊剂。

实施例8：

将上述实施例中制成的15g重楼薯蓣类皂苷与10g聚乙二醇-6000混合均匀，加热使其熔融，然后移至滴丸滴罐中，将药液滴至6～8℃的液体石蜡中，除油，即可制得300粒重楼薯蓣类皂苷抗肿瘤滴丸。

利用本发明提供的制备方法制成的重楼薯蓣类皂苷具有治疗恶性实体瘤的作用，其药理作用可通过以下药效学实验得以验证。

一、重楼薯蓣类皂苷对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用

(1)实验材料

细胞株

小鼠肺腺癌细胞株LA795，人肺腺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株 CaCo-2，人肝癌细胞株BEL7402，人肝癌细胞株HepG2，人宫颈癌细胞Hela，人表皮癌A431，人急性髓性白血病细胞HL-60，人肾腺癌细胞株A498，皆由中国协和医科大学基础医学研究所提供。

试剂

重楼皂苷标准品皆由本发明申请人提取分离得到(纯度＞95％)。顺铂注射用粉针剂由齐鲁制药有限公司生产，分子量为300。

仪器

细胞培养箱、酶标仪

(2)实验方法

将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成一定浓度的细胞悬液(其中， LA795细胞为3×104个/mL，A549细胞为2×104个/mL，CaCo-2细胞为5 ×104个/mL，BEL7402细胞为2×103个/mL，HepG2细胞为1×105个/mL， Hela细胞为5×104个/mL，A431细胞为1×105个/mL，HL-60细胞为2×105个/mL，A498细胞为1×104个/mL)，接种于96孔酶标板，每孔200μL。 24h后换不含血清的培养液使细胞同步化生长，每孔200μL。24h后(第三天)加入含不同浓度皂苷(二甲基亚砜作为溶剂，终浓度＜0.1％)及二甲基亚砜对照的新鲜培养液，每孔200μL，受试药设4个剂量组，每组设8个平行孔，并设空白孔调零。在上述条件下培养24h后，在每孔中再加入100μ L无血清培养液新鲜配制的0.5mg/mL MTT，继续培养4h，然后在每孔中再加入100μL二甲基亚砜以溶解MTT甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD)，重复实验3次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，细胞生长抑制率(％)＝[(1- 样品组OD值/对照组OD值)×100％]。

(3)实验结果(见表1)

表1 不同浓度的重楼薯蓣类皂苷对各种肿瘤细胞生长抑制率的影响

由上表可以看出，重楼总皂苷对各肿瘤细胞株的抑制强弱依次为LA795 ＞A549＞Hela＞CaCo-2＞HL-60＞A498＞A431＞HepG2＞BEL7402。结果表明重楼薯蓣类皂苷在体外对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。

二、重楼薯蓣类皂苷对小鼠LA795肺腺癌移植性肿瘤抑制率的影响

将肺腺癌LA795瘤组织于无菌条件下接种于50只裸小鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸小鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-300mm3时，将上述小鼠随机分为5组，每组10只：(1)重楼薯蓣类皂苷高剂量组：100mg/kg·bw (bw代表body weight)灌胃；(2)重楼薯蓣类皂苷中剂量组，60mg/kg·bw 灌胃；(3)重楼薯蓣类皂苷低剂量组，30mg/kg·bw灌胃；(4)环磷酰胺组，20mg/kg·bw腹腔注射；(5)生理盐水组，灌胃。每只0.2ml，使用测量瘤径的方法动态观察被试物抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每周2次，给药前及每次测量前分别称鼠重。肿瘤体积(TV)的计算公式为：TV＝1/2×a× b2(a、b分别表示长宽)。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0(V0即分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为给药后每一次测量时的肿瘤体积)。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝TRTV÷CRTV×100％(其中TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)，重楼薯蓣类皂苷对人肺腺癌裸小鼠移植瘤LA795的实验性治疗影响结果见表2。

表2 重楼薯蓣类皂苷对人肺腺癌裸小鼠移植瘤LA795的实验性治疗影响

与生理盐水对照组比较*p＜0.05。

三、重楼薯蓣类皂苷对腹水瘤小鼠生存率的影响

在无菌条件下取S180腹水瘤细胞悬液，用生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1×107/mL的细胞悬液，在冰浴条件下将上述细胞悬液接种于 30只健康小鼠的腹腔内，每只0.2mL，接种浓度为2×106/mL。接种3天后将上述30只小鼠随机分为3组，每组10只，开始给药，每日1次：模型组，灌服生理盐水，每只0.2ml；顺铂组，按2mg/kg·bw腹腔注射；重楼薯蓣皂苷组，经口给药，剂量30mg/kg·bw，观察小鼠的状态及死亡情况，计数小鼠的剩余只数。将上述实验数据利用统计学方法进行分析(见图1)，结果表明重楼薯蓣类皂苷能够明显提高腹水瘤小鼠的生存率。