技术领域
本发明具体涉及一种基于分子辅助选择的青胫显性白羽肉鸡品系的培育方法，属于分 子育种技术领域。
背景技术
我国地方鸡品种资源丰富，其肉质细嫩、肉味鲜美，但是在外观上多表现为黄羽、麻 羽等有色羽。对于冷鲜鸡市场来说，有色羽肉鸡常因屠宰后羽毛不容易脱干净而影响屠体 的美观。对于国外的快大型白羽肉鸡生长速度快，屠体性状好，但是肉质远不如我国的地 方鸡。因此，显性白羽优质肉鸡的培育中具有重要意义。
传统育种中常常采用测交的方法，依据杂交后代鸡的表型性状留种。即通过测交、繁 殖扩群来淘汰隐性白羽鸡群体里的显性白纯合子个体和显性白杂合子个体。而测交繁琐、 周期长，且会受到扩群的大小的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于分子辅助选择的青胫显性白羽肉鸡品系的培育方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于分子辅助选择的青胫显性白羽肉鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
（1）利用青胫肉鸡品种作为父本与快大型白羽肉鸡品种作为母本进行杂交，生产出 F1代，选留F1代青胫白羽公母鸡；
（2）F1代自交得到F2代，选留F2代青胫白羽公母鸡；
（3）利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定F2代青胫白羽公母鸡的基因型，选 留显性白羽位点为II基因型的个体，淘汰显性白羽位点为Ii和ii基因型的个体，得到显性 白羽位点为II基因型的公母鸡；
（4）对得到的II基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高 生产速度和鸡肉品质，同时提纯和固定青胫白羽的外观性状，经过3个世代以上的选育后， 得到显性白羽位点为II基因型的青胫显性白羽肉鸡品系。
所述步骤（1）中青胫肉鸡品种为固始鸡、狼山鸡、淮北麻鸡、淮南麻黄鸡、黄山黑 鸡、五华鸡、德化黑鸡、崇仁麻鸡、寿光鸡、卢氏鸡、景阳鸡、郧阳大鸡、东安鸡、桃源 鸡、瑶鸡、茶花鸡、和田黑鸡等。
所述步骤（1）中快大型白羽肉鸡品种为罗斯308、科宝、艾维茵、哈巴德、艾拔益加 （AA）、海波罗、迪高等。
所述步骤（3）中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步骤：以包含PMEL17 基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物PCR扩增PMEL17基因第十外显 子，得到扩增片段；对扩增片段进行Pvu Ⅱ酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据 琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡显性白羽位点的基因型；
所述的引物对P为：
上游引物P-F：5’-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’（如SEQ ID No.1 所示），
下游引物P-R：5’-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’（如SEQ ID No.2所示）。
所述的鸡全基因组DNA采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。
所述的PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 6.25μL，ddH2O 4.25μL，P-F 0.5 μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL。
所述的2×Taq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁和PCR反应缓冲 液，为市售商品，可购自上海生工、大连宝生物、北京百泰克、北京康为等公司。
所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃ 延伸20s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
所述的Pvu Ⅱ酶切反应体系为：扩增片段10μL，Buffer 1.5μL，Pvu Ⅱ 0.3μL，ddH2O 3.2μL。
所述的Pvu Ⅱ酶切反应条件为：37℃，酶切过夜。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2%。
所述的琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为60min。
所述的鉴定鸡显性白羽位点基因型的方法为：II基因型表现为160bp条带；Ii基因型 表现为124bp和160bp条带；ii基因型表现为124bp。
优选的，将步骤（4）得到的显性白羽位点为II基因型的青胫显性白羽肉鸡品系作为 父本与高产蛋鸡品种或快大肉鸡品种杂交配套，生产出高产型或快大型青胫显性白羽肉 鸡。
本发明的有益效果：
本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡显性白羽位点的基因型，可以快速判定出该位 点的基因型，生产基因型为II的青胫显性白羽优质肉鸡品系，能避免测交选育的繁琐，缩 短世代间隔，加快育种进程，从而降低培育成本。
本发明针对显性白羽野生纯合子个体在PMEL17基因第10外显子存在的一个9bp插 入这一特征，设计上游引物引入Pvu Ⅱ酶切位点，是否存在插入序列与是否存在酶切位点 之间是相互对应的关系。其中，引物对P是针对不含9bp插入的PMEL17基因的核苷酸序 列进行设计的，引入Pvu Ⅱ酶切位点后，PCR扩增产物能够被Pvu Ⅱ切为124bp和27bp（27bp 太短电泳时不显示）的片段（如SEQ ID No.3所示）；含9bp插入的基因序列在扩增后不存 在Pvu Ⅱ这一酶切位点，因此其PCR产物酶切后片段为160bp（如SEQ ID No.4所示）。
采用本发明方法培育的青胫显性白羽肉鸡品系其肉质细嫩，肉味鲜美，生产性能高， 屠体上不存在有色羽残迹，使屠体更加美观。此外，蛋鸡品种或肉鸡品种杂交配套，可分 别生产出高产型或快大型青胫显性白羽肉鸡。
附图说明
图1为本发明实施例1中各样本在鸡显性白羽位点的酶切电泳图；
注：编号说明如下：5、8、9为II基因型，3、6、7为Ii基因型；1、2、4为ii基因 型，M为DNA marker。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中基于分子辅助选择的青胫显性白羽肉鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
（1）利用固始鸡纯系公鸡作为父本与艾维茵母鸡作为母本进行杂交，生产出F1代鸡， 淘汰杂交出现的少量的有色羽个体，在F1白羽群体中选留F1代青胫白羽公母鸡；
（2）F1代自交得到F2代，选留F2代青胫白羽公母鸡；
（3）利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法测定F2代青胫白羽公母鸡的基因型，具 体包括以下步骤：
①样品的采集
对F2代选留的青胫白羽鸡翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋白酶K法提取血液DNA， 将DNA样品保存于4℃冰箱保存备用；
②引物设计
以PMEL17基因序列（GenBank Accession No.AY636129）为模板设计引物对P，如下 所示：
上游引物P-F：5’-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’，
下游引物P-R：5’-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’；
③PCR扩增
以引物对P为引物，建立12.5μL扩增体系：2×Taq PCR MasterMix（购自北京百泰克 公司）6.25μL，ddH2O 4.25μL，P-F 0.5μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL；
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30个循 环；72℃延伸10min；4℃保存；
④PCR扩增产物的酶切
15μL的Pvu Ⅱ酶切体系：扩增片段10μL，Buffer 1.5μL，Pvu Ⅱ 0.3μL，ddH2O 3.2μL； 酶切反应条件：37℃，酶切过夜；
⑤PCR扩增产物酶切后的检测与结果判定
取8μL PCR扩增后的酶切产物，2%的琼脂糖凝胶电泳（电泳电压：120V；电泳时间： 60min）点样，电泳结束后采用凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图1；
根据电泳图谱中出现的条带的大小判定：当出现160bp的片段，则为显性白羽纯合子 （II基因型，表型为白羽）；当出现124bp的片段，则为野生型纯合子（ii基因型，表型为 有色羽或隐性白羽）；当出现160bp、124bp的片段，则为显性白羽杂合子（Ii基因型，表 型为白羽）；
（4）根据基因型判定结果，选留显性白羽位点为II基因型的个体，淘汰显性白羽位 点为Ii和ii基因型的个体，得到显性白羽位点为II基因型的公母鸡；
（5）对得到的II基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高 生产速度和鸡肉品质，同时提纯和固定青胫白羽的外观性状，经过3个世代以上的选育后， 得到显性白羽位点为II基因型的青胫显性白羽肉鸡品系；
（6）对步骤（5）得到的显性白羽位点为II基因型的青胫显性白羽肉鸡品系作为父本 与白来航、固始鸡杂交配套，得到高产型或快大型青胫显性白羽肉鸡商品代。