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1、(10)授权公告号 CN 101780281 B (45)授权公告日 2011.12.07 CN 101780281 B *CN101780281B* (21)申请号 201010017213.7 (22)申请日 2010.01.04 A61K 47/36(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61K 9/06(2006.01) A61K 9/70(2006.01) (73)专利权人 中国药科大学 地址 210009 江苏省南京市鼓楼区童家巷 24 号 (72)发明人 吕慧侠 周建平 陈箐青 张振海 (54) 发明名称 N-精氨酸壳聚。
2、糖作为透皮吸收促进剂的应用 (57) 摘要 本发明属于生物医药领域， 确切的说是一种 壳聚糖衍生物 -N- 精氨酸壳聚糖作为透皮吸收促 进剂的应用。本发明的有益成果在于提供了一种 结构较为简单、 可生物降解， 具有良好促进大分子 药物以及难渗透性药物透皮吸收的壳聚糖衍生 物。 (51)Int.Cl. 审查员 田晓明 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 101780281 B1/1 页 2 1. 一种 N- 精氨酸壳聚糖用作药物透皮吸收促进剂的用途， 其特征在于 ： 所述 N- 精氨 酸壳聚糖是分子量为 10000D、 脱乙酰度为 9。
3、0的壳聚糖， 其侧链氨基为精氨酸取代， 取代 度为 6， 所述药物为胰岛素和阿德福韦酯， 其中胰岛素与所述 N- 精氨酸壳聚糖的质量比 为 1 2， 阿德福韦酯与所述 N- 精氨酸壳聚糖的质量比为 1 1。 权 利 要 求 书 CN 101780281 B1/5 页 3 N- 精氨酸壳聚糖作为透皮吸收促进剂的应用 技术领域 ： 0001 本发明属于生物医药领域， 确切地说它是关于一种 N- 精氨酸壳聚糖在促进药物 透皮吸收中的应用。 背景技术 ： 0002 药物透皮给药系统具有可以避免药物在胃肠道内的降解和肝脏首过作用以及随 时给药或随时撤销给药等独特优点， 因此自从其问世以来， 就得到了不断。
4、的完善和迅猛的 发展。 但由于许多药物的透皮速率以及透皮药量很低， 不能满足临床治疗要求， 因此提高药 物的透皮给药成为了开发透皮给药系统的关键。解决这个问题的常用方法有药剂学方法、 化学方法和物理学方法等， 而使用透皮吸收促进剂是应用最多的一种药剂学方法。 0003 透皮促进剂分为化学合成透皮促进剂和天然透皮促进剂。近年来， 天然透皮吸收 促进剂以起效快、 效果好、 副作用小等优点， 正日益引起人们的重视。 因此， 从天然产物中寻 找透皮吸收促进剂， 具有广阔的应用前景。 0004 壳聚糖由甲壳质经脱乙酰基而得， 具有良好的成膜性、 生物可降解性、 生物相容性 以及一定的抗菌、 抗肿瘤性能，。
5、 被广泛应用于医药、 食品、 化工、 环保等行业， 素有万能多糖 的美誉。壳聚糖由于其结构上的氨基和羟基而具有高化学反应活性， 且易于被一些化学试 剂修饰， 因此对壳聚糖进行化学改性而使其具有新功能的研究屡见报道。一些研究表明， N- 三甲基壳聚糖以及巯基化壳聚糖应用于微粒给药系统中具有一定的促进胰岛素等口服、 粘膜给药吸收的作用 ； Wen He 等还报道了 N- 三甲基壳聚糖具有促进睾酮透皮吸收的作用 (Wen He， Xianxi Guo， Mian Zhang.Transdermal permeation enhancement of N-trimethyl chitosan fort。
6、estosterone.International Journal of Pharmaceutics 2008， 356 ： 82-87)。 0005 近年来， 一些具有细胞膜穿透能力的多肽例如 TAT peptide、 MPG、 PEP-1、 penetratin、 octaarginine 等逐渐成为关注的焦点， 它们可高效穿过细胞膜而细胞膜却完 好无损。这些天然的或人工合成的多肽能够携带各种分子或纳米载体进入各种细胞膜， 被 称之为穿膜肽。其中有些细胞穿膜肽为带有正电荷的长短不一的多肽片段， 这些多肽片段 多为精氨酸等碱性氨基酸残基。 0006 由于精氨酸为碱性带正电的水溶性氨基酸， 在。
7、壳聚糖主链上引入精氨酸基团， 可 以明显改善壳聚糖的水溶性， 此外， 由于的壳聚糖的 2 位氨基带有正电荷， 能与荷负电的细 胞膜结合， 打开细胞间的紧密连接， 同时精氨酸的荷正点胍基基团的存在， 可以与荷负电的 亲水性小分子药物， 以及荷负电的大分子药物如胰岛素、 肝素等产生静电结合， 使其能有效 地穿透细胞膜。利用以上所述的壳聚糖和穿膜肽的这些特点， 合成而得的 N- 精氨酸壳聚糖 衍生物， 不仅可以明显改善壳聚糖的水溶性， 而且我们还发现其具有良好的促进透皮吸收 的作用。 0007 目前有关精氨酸壳聚糖衍生物作为药用的报导不多， LiuWG 等利用十六烷基修饰 的壳聚糖制备而成的纳米粒用。
8、于基因载体的研究 (LiuWG， Yao KD， Liu QG.Formation of a 说 明 书 CN 101780281 B2/5 页 4 DNA/N-Dodecy-lated chitosan complex and salt-induced gene deliveryJ.J Appl Polym Sci， 2001， 82(14) ： 3391-33951.) ； 刘文广有利用精氨酸能与血液中丝氨酸酶作用， 与壳聚糖形成缀合物后作为抗凝血材料使用的专利报导 ( 发明专利 ： ZL03144230.7) ； 朱敦 皖等利用精氨酸壳聚糖作为基因载体， 用于提高基因转染效率 ( 朱敦皖。
9、等， 精氨酸修饰壳 聚糖提高基因转染效率的研究 . 科学通报 J， 2007， 52(18) ： 2199-2205.)。但利用精氨酸 与壳聚糖的衍生物作为透皮促渗剂的研究国内外均未见文献与专利报导。 发明内容 ： 0008 本发明的目的旨在提供一种新型透皮吸收促进剂， 其以壳聚糖为骨架， 侧链氨基 上修饰精氨酸， 作为一种透皮促渗剂， 将其应用于透皮给药上， 具有极好的促进药物透皮吸 收的效果。 0009 一种新型的透皮吸收促进剂， 由下列通式表示 ： 0010 0011 所述的透皮吸收促进剂， 其主要特征为 ： 壳聚糖分子量为 3000 1000000D， 脱乙 酰度为 55-92， 精氨。
10、酸取代度为 0.5 90。 0012 所述的透皮吸收促进剂， 主要加入各种药物的透皮给药制剂中作为吸收促进剂使 用， 也可与药物形成组合物。 0013 所述的精氨酸及其盐为 L- 精氨酸、 D- 精氨酸、 DL- 精氨酸、 L- 精氨酸盐酸盐、 D- 精 氨酸盐酸盐、 DL- 精氨酸盐酸盐、 L- 精氨酸硫酸盐、 D- 精氨酸硫酸盐和 DL- 精氨酸硫酸盐之 中的一种。 0014 所述的药物首选蛋白多肽类大分子药物以及难以渗透皮肤或粘膜的药物。 蛋白多 肽类大分子药物优选胰岛素， 可以是生长激素、 脑啡肽、 干扰素、 催产素、 疫苗、 单克隆抗体、 DNA、 sRNA。 难渗透性药物优选阿德福。
11、韦、 盐酸苯环壬酯、 茶苯海明、 苯海拉明， 可以是盐酸二 甲双胍、 盐酸阿霉素、 硫酸长春新碱、 盐酸小檗碱、 盐酸柔红霉素， 盐酸拓扑替康、 阿昔洛韦、 更昔洛韦、 阿米洛利、 阿替洛尔、 阿莫西林、 头孢拉定、 环丙沙星、 甲氨蝶呤、 两性霉素 B、 丝裂 霉素、 新霉素、 粘菌素、 喜树碱类 ( 喜树碱、 10- 羟基喜树碱、 9- 硝基喜树碱、 SN-38 等 )、 紫杉 醇、 多西紫杉醇、 替尼泊苷、 依托泊甙、 环孢素 A、 柔红霉素、 冬凌草素、 藤黄酸、 三尖杉酯、 高 三尖杉酯、 灯盏花素、 银杏内酯、 水飞蓟素、 阿德福韦酯、 恩替卡韦。 0015 所述的透皮制剂， 可以。
12、是 O/W 型软膏剂、 W/O 型软膏剂、 水凝胶软膏剂、 膜控型、 基 质型、 骨架型透皮给药系统等。 0016 所述的透皮吸收促进剂， 在透皮制剂中的使用剂量以及与药物形成组合物的含量 为 0.5-90。 0017 以下通过非限定性实施例进一步详细说明本发明， 本发明的保护范围， 不局限于 此。 说 明 书 CN 101780281 B3/5 页 5 具体实施方式 ： 0018 实施实例 1 ： N- 精氨酸壳聚糖促进阿德福韦透皮吸收的实验研究 0019 1、 N- 精氨酸壳聚糖的合成 0020 ( 一 ) 精氨酸侧链氨基的 BOC 保护 ： 称取精氨酸 5 克溶于 200ml 去离子水中。
13、， 另称 取 4 克 Boc 酸酐溶于 200ml 四氢呋喃， 将溶有 Boc 酸酐的四氢呋喃溶液加入精氨酸的水溶 液中， 搅拌均匀， 滴加1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9-10， 室温搅拌反应24小时， 将反应 液置旋转蒸发仪上除去四氢呋喃 - 水混合液， 得 N- 叔丁氧羰基精氨酸， 取 200ml 去离子水 将其溶解。 0021 ( 二 )N- 精氨酸壳聚糖的合成 ： 称取脱乙酰化度 90、 分子量 10000 的壳聚糖 10 克， 加入到 1的冰醋酸水溶液中， 室温搅拌 12 小时， 使壳聚糖完全溶解， 加入 1.4 克 N- 羟 基 - 丁二酰亚胺和 6 克 1- 乙基 -3。
14、-(3- 二甲胺丙基 ) 碳二亚胺以及 N- 叔丁氧羰基精氨酸 水溶液， 室温下搅拌反应48小时后， 去离子水透析48小时， 冷冻干燥得最终产物， 元素分析 计算取代度为 6。 0022 FTIR ： 1615.97cm-1( 精氨酸胍基 )， 1526.23cm-1( 精氨酸与壳聚糖反应生成的酰胺 键的吸收峰 )， 1149cm-1( 精氨酸 C-C-N 键的非对称伸缩振动峰 )， 1072.54cm-1( 壳聚糖吡喃 环上的 C-O 伸缩振动 )。 0023 元素分析法结合核磁共振法测得其精氨酸取代度为 6。 0024 ( 三 ) 不同取代度壳聚糖衍生物的合成 ： 将精氨酸的用量按比例增加。
15、， 其它合成步 骤同 ( 一 ) 和 ( 二 )， 可得到不同取代度的 N- 精氨酸壳聚糖。 0025 2、 透皮实验 0026 样品溶液的配制 ： 称取180mg阿德福韦溶于52ml 0.1mol/L的HCl溶液中， 将此药 物溶液平均分为 6 份 ； 分别取精氨酸、 壳聚糖、 精氨酸与壳聚糖的衍生物以及精制纯化后的 N- 精氨酸壳聚糖 180mg 四份分别溶于阿德福韦水溶液中， 以 1mol/L 的 NaOH 调节溶液 9pH 值至7， 加蒸馏水至全量， 配置得到含阿德福韦浓度为0.3， N-精氨酸壳聚糖浓度为2的 溶液。 0027 透皮实验 ： 取体重为1822g雄性小鼠， 断颈处死， 。
16、剃净腹部体毛， 取无损伤皮肤。 在表面皿上除去皮下脂肪， 用生理盐水冲洗皮肤内表面。 -4冷藏保存， 48小时内使用。 将 皮肤固定在 Franz 扩散池的上、 下两室之间， 角质层朝上， 接受液为 0.9的生理盐水溶液， 释放液为样品溶液 3ml， 将装置置于 (320.5)恒温水浴中， 开动搅拌 (200rmin-1)， 分别于 0.5， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12h 取样 1mL， 同时补加相同温度等体积新鲜接受液。样品用 0.22um 微孔滤膜过滤， 取样品续滤液 1ml 用流动相稀释后进行 HPLC 分析， 并计算药物的累 积渗透量 (Qn)， 平行操作三份取平均值。。
17、 0028 3、 实验结果与数据 0029 采用不同分子量壳聚糖、 壳聚糖与精氨酸混合物以及 N- 精氨酸壳聚糖作为促渗 剂， 12小时阿德福韦累积透皮渗透量数据结果如表1所示。 结果表明与单独精氨酸、 壳聚糖 以及精氨酸与壳聚糖的物理混合物作为促渗剂相比， 不同分子量， 不同取代度的 N- 精氨酸 壳聚糖均可大幅度的提高阿德福韦的透皮吸收。 0030 表 1 不同促渗剂对阿德福韦透皮吸收的影响 说 明 书 CN 101780281 B4/5 页 6 0031 0032 实施实例 2 胰岛素 0033 1、 N- 精氨酸壳聚糖的合成 ： 同实施例 1。 0034 2、 透皮实验 0035 样品。
18、溶液的配制 ： 称取30mg胰岛素溶于18ml(0.1mol/L)的HCl溶液中， 将此药物 溶液平均分为6份， 以1mol/L的NaOH调节溶液9pH值至7， 加蒸馏水至全量， 分别取精氨酸、 聚糖、 精氨酸与壳聚糖的衍生物以及精制纯化后的 N- 精氨酸壳聚糖 60mg 四份溶于以上溶 液中， 配置得到含精氨酸、 聚糖、 精氨酸与壳聚糖的衍生物以及 N- 精氨酸壳聚糖浓度为 2 的胰岛素溶液。 0036 透皮实验 ： 取以上配制好的溶液进行透皮实验， 实验方法同实施例 1。 0037 3、 实验结果与数据 0038 采用不同分子量壳聚糖、 壳聚糖与精氨酸混合物以及 N- 精氨酸壳聚糖作为促吸 收剂， 12小时胰岛素累积透皮渗透量数据结果如表2所示。 结果表明与单独精氨酸、 壳聚糖 以及精氨酸与壳聚糖的物理混合物作为促渗剂相比， 不同分子量的 N- 精氨酸壳聚糖可大 幅度的提高胰岛素的透皮吸收。 0039 表 2 不同促渗剂对胰岛素透皮吸收的影响 0040 说 明 书 CN 101780281 B5/5 页 7 说 明 书 。