高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性化妆品.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101690705 B (45)授权公告日 2011.07.27 CN 101690705 B *CN101690705B* (21)申请号 200910034310.4 (22)申请日 2009.08.21 A61K 8/97(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) (73)专利权人 珈侬生化科技 ( 中国 ) 有限公司 地址 215001 江苏省苏州市工业园区开源路 36 号 (72)发明人 陈婷婷 张婷婷 赵毅 姚志蕊 马立伟 肖韦 许至安 (74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102。

2、 代理人 陈忠辉 CN 1221604 A,1999.07.07, 全文 . CN 101084935 A,2007.12.12, 全文 . 杨天明、 夏德超、 朱景申 . 松针的研究 进展 .中国药师 .2002, 第 5 卷 ( 第 12 期 ),748-749. 徐凤翔 . 西藏高山松资源及松脂的开发 与利用 .植物资源与环境学报 .1992,( 第 4 期 ),34-38. 韩书昌、 赵慧正、 申世斌、 吴宪瑞 . 松针 浴液的研制 .中国林副特产 .1992,( 第 21 期 ),16-18. (54) 发明名称 高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰 老活性化妆品 (57) 摘要 。

3、本发明涉及高山松针活性提取物的制备方法 及美白抗衰老活性化妆品。高山松针经粉碎、 提 取、 过滤、 萃取分离、 浓缩等步骤， 获得美白和抗衰 老活性提取物， 然后将该提取物添加到化妆品中 配制成具有美白抗衰老功能的化妆品。该高山松 针提取物具有抑制酪氨酸酶、 抗自由基等特性， 具 有美白和抗衰老的特殊功效。本发明所用原料天 然， 为可再生资源 ； 制备工艺绿色安全、 步骤简单 独到， 所得提取物稳定性好、 使用方便、 功效持久， 可在化妆品制备过程中高、 低温阶段均可添加。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张祥瑞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要。

4、求书 1 页 说明书 5 页 CN 101690705 B1/1 页 2 1. 高山松针活性提取物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 、 将高山松针制成粉末 ； 、 按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中， 每 1g 高 山松针粉末使用 15ml 30ml 乙醇水溶液， 乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于 45 55， 然后在 60 85条件下浸泡提取 1.5h 2h， 得到提取液 ； 、 将步骤制得的提取液冷却后过滤， 并将滤液减压浓缩 ； 、 分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤制得的浓缩液， 再将乙酸乙酯萃取液经 减压浓缩、 真空干燥成浸膏。 2. 根据权利要求 。

5、1 所述的高山松针活性提取物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤中所 述浸泡提取的次数为两次， 且步骤中减压浓缩的原料为两次提取液合并后的过滤液。 3. 根据权利要求 1 所述的高山松针活性提取物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤中， 按 1g 高山松针粉末与 30ml 乙醇水溶液的用量加入提取器， 在 75 85条件下浸泡提取 1.5h 2h。 4. 根据权利要求 1 所述的高山松针活性提取物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤中， 按 1g 高山松针粉末与 15ml 乙醇水溶液的用量加入提取器， 在 60 75条件下浸泡提取 1.5h 2h。 5. 一种美白抗衰老活性化妆品， 其特征在于 ： 。

6、该化妆品包含采用权利要求 1 所述制备 方法获得的高山松针活性提取物， 具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。 6. 根据权利要求 5 所述的美白抗衰老活性化妆品， 其特征在于 ： 所述化妆品是水剂、 霜 剂、 油剂或乳状液。 权 利 要 求 书 CN 101690705 B1/5 页 3 高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性化妆品 技术领域 0001 本发明涉及高山松针活性提取物以及具有美白和抗衰老功能的活性化妆品， 尤其 涉及一种从高山松针中提取美白和抗衰老活性提取物的制备方法， 以及应用该提取物制备 而成的具有美白和抗衰老活性的化妆品。 背景技术 0002 青藏高原是藏医药学的。

7、发源地 ； 是资源丰富的超高药源基地 ； 是回归自然还我绿 色药物的天然宝库 ； 在主产种和特有种的数量上是世界上任何民族药都不可比拟的 ； 活性 成分含量高且无污染是国内外罕见的。高山松针由于青藏高原特殊的自然环境， 而具备特 有的生理特征和生态特征 ： 抗紫外辐射能力强 ； 抗寒、 抗旱性能强 ； 光合作用有效物质积累 高等。 0003 松针属松属植物的叶， 其味苦， 性温， 归肝肾经。 本草纲目 中记载 ：“松为百木之 长， 久服， 固齿驻颜， 肌肤玉泽， 轻身不老” 。据史料载述， 神农黄帝时的雨师， 中国药王、 唐 朝道教真人孙思邈， 晋代浙江人皇初平兄弟等均因服食松叶、 松子、 松。

8、脂得以长寿至一百多 岁。 松针中含有丰富的营养成分、 多种具有生物生理活性的成分， 包括挥发油、 粗蛋白、 氨基 酸、 维生素、 脂肪酸、 可溶性糖和一些无机元素如钙、 钾、 铁、 锌、 磷、 硒等， 还含有黄酮、 苷类 ( 黄酮苷 ) 等。 0004 氧化是伴随着生命活动的自然现象， 人体在利用氧的过程中， 会因各种内因和外 因而产生各种活性氧和自由基， 现代科学认为氧化与衰老息息相关。 自 由基学说是现代衰 老学说中重要的一种。衰老或某些疾病与自由基损伤有关， 过多的自由基损伤会加速细胞 膜的脂质过氧化速度， 引起生物膜结构的改变和膜脂流动性降低， 进一步使 Na+-K+-ATPase 的。

9、构象改变， 而后者也是膜的组份， 最终导致该酶活性的降低， 使机体发生退行性变化。松 针能够显著增加老年大鼠抗氧化酶活性和总抗氧化能力， 降低自由基代谢产物含量， 提高 组织膜酶的活性， 改变膜脂流动性， 表明松针可通过提高体内抗自由基能力、 减少脂质过氧 化， 从而保护细胞膜的完整性和功能的正常发挥， 起到延缓衰老的作用。 0005 目前对松针的研究与应用不断深入， 但主要还是集中在食品、 药用、 保健方面， 对 于化妆品中的研究还很少， 尤其将其应用于美白化妆品中的研究尚未见报道。 发明内容 0006 本发明的目的旨在提供一种高山松针活性提取物的制备方法及美白抗衰老活性 化妆品， 利用绿色。

10、植物的天然保护机制， 从高山松针中提取具有美白、 抗衰老活性的稳定成 分， 并将其应用于美白抗衰老活性化妆品中， 开发高山松针的美白价值。 0007 本发明的技术解决方案是 ： 0008 高山松针活性提取物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0009 I、 将高山松针制成粉末 ； 0010 II、 按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中， 每 1g 说 明 书 CN 101690705 B2/5 页 4 高山松针粉末使用 15ml 30ml 乙醇水溶液， 乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于 45 55， 然后在 60 85条件下浸泡提取 1.5h 2h， 得到提取液 。

11、； 0011 、 将步骤制得的提取液冷却后过滤， 并将滤液减压浓缩 ； 0012 、 分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤制得的浓缩液， 再将乙酸乙酯萃取 液经减压浓缩、 真空干燥成浸膏。 0013 进一步地， 上述的高山松针活性提取物的制备方法， 其中 ： 0014 步骤中， 浸泡提取的次数可为两次， 且将两次提取液合并后得到的过滤液， 应用 于后续制备步骤中。该浸泡制程可以按 1g 高山松针粉末与 30ml 乙醇水溶液的用量加入提 取器， 在 75 85条件下浸泡浸提 1.5 2 小时 ； 也可以按 1g 高山松针粉末与 15ml 乙 醇水溶液的用量加入提取器， 在 60 75条件下浸泡浸提。

12、 1.5 2 小时。 0015 一种美白抗衰老活性化妆品， 其特征在于 ： 该化妆品包含采用前述制备方法获得 的高山松针活性提取物， 具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。该化妆品的剂型包 括但不限于 ： 水剂、 霜剂、 油剂或乳状液。 0016 与现有技术相比， 本发明具有如下优点 ： 0017 1、 高山松针美白抗衰老活性提取物的提取方法简便易行， 实验条件温和而且容易 控制 ； 0018 2、 高山松针资源丰富， 成本低廉 ； 美白抗衰老活性提取物制备过程中应用的有机 溶剂全部为回收再利用。 0019 3、 在上述制备工艺中经 80所提取出来的活性原料具有很好的高温稳定性， 在化 妆品。

13、配制的高、 低温阶段均可添加， 应用方便。 0020 具体实施方式 0021 本发明从高山松针中提取美白抗衰老活性成分， 具有抗自由基、 美白的功能， 从而 应用于具有美白抗衰老功效的化妆品。 0022 本发明从高山松针中提取美白抗衰老活性成分的方法包括以下步骤 ： 0023 I、 将高山松针制成粉末 ； 0024 II、 按以下质量体积比将高山松针粉末加入到盛有乙醇水溶液的提取器中， 每 1g 高山松针粉末使用 15ml 30ml 乙醇水溶液， 乙醇水溶液当中乙醇的质量浓度介于 45 55， 然后在 60 85条件下浸泡提取 1.5h 2h， 得到提取液 ； 0025 III、 将步骤 II。

14、 制得的提取液冷却后过滤， 并将滤液减压浓缩 ； 0026 IV、 分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取步骤 III 制得的浓缩液， 再将乙酸乙酯萃 取液经减压浓缩、 真空干燥成浸膏。 0027 具体来看， 步骤 II 中可以按 1g 高山松针粉末与 30ml 乙醇水溶液的用量加入提取 器， 控制 75 85条件下浸泡提取 1.5 2 小时 ； 或者可以按 1g 高山松针粉末与 15ml 乙醇水溶液的用量加入提取器， 控制 60 75条件下浸泡提提 1.5 2 小时， 将两次的 提取液合并， 以备后续制程之用。 经实验反复验证， 在上述步骤II的提取过程中， 选用50 乙醇水溶液作为提取试剂、 且在。

15、 80恒温条件下浸提制得的提取液效果最佳。 0028 采用上述方案获得的活性物具有良好的高温稳定性， 实验人员对最终制成的浸 膏， 进行抗自由基、 抑制酪氨酸酶活性检测， 黑色素细胞黑色素产生的抑制测试， 发现提取 物具有较高的活性。其功效检测方法如下 ： 说 明 书 CN 101690705 B3/5 页 5 0029 一、 活性物抗自由基能力的体外检测方法 0030 1、 准确称取 20mg DPPH(1， 1- 二甲基苄基苯肼， C18H12N5O6)， 用无水乙 醇定容于 250ml 容量瓶， 浓度 210-4mol/L ； 0031 2、 取若干试管编号， 参照表 1， 添加试剂。 。

16、0032 表 1 ： 试剂添加量 ( 单位 ： ml) 0033 组别 DPPH 样品 提取溶剂 空白 0 2.0 0 1.0 样品溶液 1 2.0 1.0 0 样品溶液 2 2.0 1.0 0 样品溶液 3 2.0 1.0 0 0034 3、 混合均匀， 室温下 (25或水浴 25 ) 反应 10min 后， 测定 517nm 波长下的吸光 度值。 0035 4、 根据下式计算清除率 ： 0036 清除率 ( ) (1-At/A空白)100 0037 A空白： 空白对照在 517nm 波长下的吸光度值 0038 At： 样品在 517nm 波长下的吸光度值 0039 5、 以清除DPPH自由。

17、基50的活性物浓度(IC50)来表征自由基清除剂的功效。 抗 DPPH 自由基活性检测结果见表 2。结果表明高山松针提取物有较强的 DPPH 自由基清除能 力， 其活性与 Vc 乙基醚、 熊果苷相当。 0040 表 2 ： 各样品抗 DPPH 自由基活性检测结果 0041 高山松针提取物 IC50 (g/mL) Vc 乙基醚 IC50 (g/mL) 熊果苷 IC50(g/mL) 46 15 200 0042 二、 抑制酪氨酸酶活性的检测方法 0043 1、 取四只试管分别标上 1#、 2#、 3#、 4#； 0044 2、 参照表 3， 在四只试管内分别加入相应各列所列的反应液 ； 0045 。

18、3、 振摇混匀， 37预热 10min ； 0046 4、 然后在各管分别加入酪氨酸酶溶液， 37准确反应 5min， 迅速转移至比色皿中， 于 475nm 处测吸光度值 (A) ； 0047 5、 酪氨酸酶抑制率的计算 ： 按下式计算对酪氨酸酶抑制率。 0048 抑制率 1-(A3-A4)/(A1-A2)100 0049 式中 ： A1、 A2、 A3、 A4 分别代表表 3 中 1#、 2#、 3#、 4#四个反应体系在步骤 4 中所测得 的吸光度 A475nm。 0050 表 3 ： 待测液的组成 ( 单位 ： ml) 0051 反应液 1# 2# 3# 4# 酪氨酸溶液 0.7 0 0。

19、.7 0 美白剂溶液 0 0 0.5 0.5 美白剂的空白溶剂 0.5 0.5 0 0 PH6.8 磷酸盐缓冲液 0.8 1.5 0.8 1.5 0052 6、 以导致酪氨酸酶活力下降 50的抑制剂浓度 (IC50) 来表征抑制剂的功效。抑 说 明 书 CN 101690705 B4/5 页 6 制酪氨酸酶活性检测结果见表 4。结果表明高山松针提取物有较强的酪氨酸酶活性抑制能 力， 其活性亦与 Vc 乙基醚、 熊果苷相当。 0053 表 4 ： 各样品抑制酪氨酸酶活性检测结果 0054 高山松针提取物 IC50 (mg/mL) Vc 乙基醚 IC50 (mg/mL) 熊果苷 IC50(mg/m。

20、L) 0.103 1.35 0.17 0055 三、 黑色素细胞测试 0056 1、 小鼠 B16 黑色素细胞培养 0057 用含质量分数为 10小牛血清的 1640 培养液在 37、 5 CO2的条件下培 养 B16 黑色素细胞， 细胞接种量为 3106个 /L， 每 3d 传一次代。 0058 2、 细胞增殖率的测定 0059 选择对数生长期的 B16 黑色素细胞， 用 0.25胰酶消化， 调整细胞浓度为 2104 个/mL， 接种于96孔培养板， 每孔180L， 置于37、 5CO2的培养箱内培养24h。 镜下观察 生长状态良好， 分别加入受试物 20L/ 孔， 继续培养 48h。于结束。

21、前 4h 加入 MTT30L/ 孔， 4h后弃上清液， 再加入DMSO 150L/孔， 振荡10min左右， 用酶联免疫检测仪测定475nm波 长处的吸光度。 0060 测试结果为三种活性物对黑色素细胞的增殖几乎均无抑制作用， 对细胞增殖的抑 制率均低于 10， 即三种活性物基本无细胞毒性。 0061 3、 细胞内酪氨酸酶活力测定 0062 取 B16 黑色素细胞接种于 25cm2的培养瓶， 接种量为 2105个 / 瓶， 培养 48h 后更 换成加有受试物的培养基， 继续培养 48h， 以不加活性物作为对照。0.25胰酶消化后， 用 pH6.8 的 PBS( 磷酸缓冲液 ) 吹打成细胞悬液，。

22、 低温离心后弃上清液， 收获细胞团块。加入 1mL0.5的脱氧胆酸钠， 冰浴 15min， 裂解细胞制备含酪氨酸酶提取液。取该提取液 0.5mL， 于 37预温后加入 0.3多巴溶液 0.5mL， 37水浴反应 5min， 用紫外分光光度计在 475nm 处测定吸光度。 0063 测试结果为高山松针提取物的对酪氨酸酶的抑制率与 Vc 乙基醚、 熊果苷相当。通 过以上体外活性检测， 发现 ： 本发明提取的高山松针提取物的美白、 抗衰老活性， 与 Vc 乙基 醚、 熊果苷相当， 并且该活性物具有良好的热稳定性和光稳定性。 0064 四、 人体美白实验 0065 按照本发明技术方案制得的高山松针提取。

23、物， 可以作为美白和抗衰老化妆品的功 效性原料， 其使用形式没有特殊要求， 它可以用于水剂、 霜剂、 油剂、 洗液、 乳状液等各种不 同剂型的化妆品中。 0066 作为本发明应用的典型基质， 涉及的已知物质有 ： 动植物油、 矿物油、 蜡、 高级醇、 脂肪醇、 硅油、 表面活性剂、 磷脂、 醇类、 多元醇类、 水溶性聚合物、 油溶性聚合物类、 矿物质、 去离子水等， 另外， 根据需要可适当加入 PH 调节剂、 抗氧化剂、 螯合剂、 颜料、 防腐剂和香精 等。 此外， 也可以与具有美白作用、 抗衰老作用或者护肤功效性作用的其它活性成分结合使 用， 如防晒剂、 血液循环促进剂、 消毒剂、 消炎剂、。

24、 细胞活化剂、 维生素类、 氨基酸类、 润湿剂、 角质层分离剂。 0067 表 5 是应用本发明获得的高山松针提取物配制 “膏霜” 化妆品的具体配料组成。配 说 明 书 CN 101690705 B5/5 页 7 制时， 将表中组分 A 加热至 83， 溶化搅拌均匀， 作为油相， 将组分 B 放入容器加热至 83， 搅拌溶解成水相原料， 油相原料加入水相原料中搅拌， 乳化均质 1min 后， 继续搅拌冷却至 45时， 加入香精、 防腐剂等， 搅拌均匀， 陈化 24 小时后即可灌装、 包装、 检验， 制得本发明 之实例产品。 0068 表 5 ：“膏霜” 配料 0069 0070 0071 采用。

25、 “双盲法” 测试评价本发明的美白效果 ： 按照上述实例制备含有高山松针提取 物的美白抗衰老产品、 含熊果苷的产品以及不含高山松针提取物的基质， 添加高山松针提 取物的作为待测样品、 添加熊果苷的作为对比样品、 不添加活性物的作为空白样品， 随机选 择皮肤健康的成人前臂内侧 3cm3cm 区域作为受试部位， 共 10 人， 检测空白膏体、 添加不 同浓度高山松针提取物的膏体、 添加熊果苷的膏体的美白功效， 受试者每天涂抹各样品早 晚各一次， 连续涂抹 28 天， 每周用皮肤测试仪测定皮肤亮度变化、 皮肤黑色素含量变化。结 果表明 ： 随着松针提取物添加量的增加， 皮肤美白效果先增强后减弱， 这可能是因为松针提 取物本身具有颜色， 随着添加量的增加， 化妆品膏体颜色逐渐加深， 所以添加量与皮肤美白 效果并不呈正相关。总体而言， 添加量 0.5的松针提取物美白活性最强， 完全可与 2熊 果苷的美白活性相抗衡。 0072 本发明的有益效果是通过对自由基清除作用、 酪氨酸酶抑制作用、 黑色素细胞黑 色素产生的抑制作用达成的， 测试数据以及人体实验验证结果表明， 采用本发明制备方法 获得的高山松针活性提取物具有皮肤美白抗衰老功效。 说 明 书 。