RLZ8在治疗血小板减少症中的应用及其制剂.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101612385 B (45)授权公告日 2012.06.20 CN 101612385 B *CN101612385B* (21)申请号 200910143424.2 (22)申请日 2009.05.25 A61K 38/16(2006.01) A61P 7/00(2006.01) (73)专利权人 张喜田 地址 201418 上海市奉贤区金汇塘路 369 号 (72)发明人 孙非 梁重阳 张喜田 CN 101205553 A,2008.06.25, 全文 . 梁重阳等.灵芝免疫调节蛋白(Lz-8)在毕赤 酵母中的表达及其免疫活性鉴定 .生物工程学 报 .2009。

2、, 第 25 卷 ( 第 3 期 ), 摘要 . 朱建强等 . 重组灵芝免疫调节蛋白的纯化及 其性质 .高等学校化学学报 .2008, 第 29 卷 753. 林景卫等 . 真菌免疫调节蛋白的研究进 展 .真菌免疫调节蛋白的研究进展 .2005, 第 21 卷 ( 第 6 期 ),477-480. (54) 发明名称 rLZ-8 在治疗血小板减少症中的应用及其制 剂 (57) 摘要 本 发 明 提 供 了 重 组 灵 芝 免 疫 调 节 蛋 白 (rLZ-8) 用于治疗血小板减少症的一种新用途。 在环磷酰胺所致小鼠和犬血小板减少症的预防和 治疗实验中， 将生理盐水配制的 rLZ-8 对血小板 。

3、低下的实验动物模型进行给药， 用THPO和IL-6为 阳性药物， 连续给药， 检测血液中血小板数量， 对 比治疗前后血小板数变化， 分析药效。与模型组 比较， 在给药初期 ( 第 3-5 天 )rLZ-8 药物组已明 显刺激小鼠、 豚鼠和犬的血小板增生， 差异极其显 著， 在给药中期(第7-10天)时恢复到正常水平， 在治疗由注射抗血小板血清导致的血小板减少症 豚鼠实验动物模型也取得了很好的效果。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李娟娟 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 1/1 页 。

4、2 1. 重组灵芝免疫调节蛋白 rLZ-8 在制备治疗血小板减少症药物中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述的药物是由重组灵芝免疫调节蛋白 rLZ-8 和任何药学可接受的辅剂组成。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于所述的药物可以通过口服和非肠道给药， 口服药包括口服液、 片剂、 丸剂和胶囊 ； 非肠道给药的药物包括外用药、 吸入制剂、 栓剂和注 射剂。 权 利 要 求 书 CN 101612385 B 2 1/7 页 3 rLZ-8 在治疗血小板减少症中的应用及其制剂 技术领域 0001 本发明涉及一种重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 对血小板减少。

5、症的治疗用途。 0002 背景技术 0003 1989 年， 由日本 Kino 等人第一次从赤灵芝菌丝体提取物中分离得到了一种免疫 调节蛋白， 即灵芝免疫调节蛋白 (Immunoregulatory Protein from Ganoderma Lucidum， LZ-8)， 命名为 LZ-8， 并测定了其基因序列、 氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明 LZ-8 由 110 个氨基酸残基组成， 氨基端乙酰化。分子量为 12.4kD， 等电点为 4.4。 0004 发明人之一已在另一专利申请中公开了基因重组灵芝免疫调节蛋白的晶体空间 结构， 其结构的主要特征为 ： 包括一个 N- 端的形成。

6、二聚体所需的重要结构域和一个 C 端的 FNIII 结构域， N- 端结构域由一个 a-helix( 序列为 2-SDTA-LIFRLAWDVK-15， 14 个氨基酸组 成 ) 和 -strand( 序列为 16-KLSFD-20， 5 个氨基酸组成 )， 其中在 a-helix 上的 Ser 的残 基被乙酰化封闭。LZ-8 单体上的 N 端 a-helix 和 -strand 与另一单体上相同的结构域通 过空间交换形成了重要的二聚体结合结构域， 呈哑铃状。C- 端的 FNIII 结构域属于免疫球 蛋白三文治结构， 包含-sheet I and II两个结构， 二者分别由-strands A。

7、-B-E and-strands G-F-C-D 形成。研究结果表明基因重组灵芝免疫蛋白的本质作用可能是通 过 N 端 a 螺旋 A 形成同源二聚体 ( 研究表明， 其 N 端 13 个氨基酸残基对 FIP 形成有功能的 同源二聚体十分必要 )。 0005 血小板减少症可能源于造血干细胞损伤引起的血小板产生不足， 血小板减少症通 常伴随着贫血和白细胞减少症。血小板减少症也可能是由于使用一些特殊药物引起的， 如 奎宁、 奎尼丁、 肝素、 非甾类抗炎药物、 还有一些化学试剂等， 尤其是一些临床使用的化疗药 物会抑制巨核细胞的产生。 0006 目前， 临床上常用的药物以基因工程重组类药物为主， 主要。

8、为血小板生成素 (Thrombopoietin， THPO) 和白介素 -11(IL-11)。THPO 是作用于巨核细胞系分化发育的特 异性造血因子， 是最早阶段巨核细胞和血小板分化发育最重要的生理性调节因子。THPO 长 期或大剂量应用存在以下潜在的毒副作用， 如刺激肿瘤细胞生长、 与其他细胞因子产生竞 争性相互作用、 骨髓纤维化、 肝脾肿大等， 故 THPO 使用的安全性问题仍有待进一步研究， 所 出现的不良反应为注射部位疼痛、 红肿、 硬结、 结膜充血、 水肿、 心悸、 乏力等。IL-11 可用于 预防非血液系统恶性肿瘤化疗所致的重度血小板减少症， 降低化疗导致的重度血小板减少 的发生率。

9、， 减少血小板成分输血的次数。 0007 重组人 IL-11 最常见的副作用是轻度的可逆性贫血， 其发生与液体潴留产生的血 液稀释有关， 在治疗中水肿约占 20， 心律失常约占 15。中医中药在血小板减少症的治 疗中也有应用的报道， 其中单味中药和复方制剂主要有人参、 当归、 补骨脂、 地黄、 白术、 黄 芪、 阿胶、 剌五加等， 尽管中医药对放化疗所造成的造血及免疫功能抑制有较好的调节作 用， 但目前疗效评价只停留在有效、 无效的水平上， 且由于各地疗效标准不一， 不少报道未 设对照组， 疗程长短相差大， 影响疗效的说服力。 0008 本发明结果表明， 基因重组灵芝免疫调节蛋白具有明显的治疗。

10、及预防由多种原因 说 明 书 CN 101612385 B 3 2/7 页 4 导致的血小板减少症， 在临床应用剂量、 治疗效果及临床不适症等方面均优于现有的临床 应用药物。动物实验表明， 基因重组灵芝免疫调节蛋白的副作用远低于 IL-11 和 THPO。 0009 综上所述， 发明人利用毕赤酵母真核表达系统表达了灵芝免疫调节蛋白 ： 在国际 同类研究中， 发明人首次实现了工业级 30 克生产规模的 rLZ-8 生产， 并且建立了完整的生 产及纯化工艺方案 ； 完成了rLZ-8空间结构的测定工作。 本发明发现了rLZ-8可以提升实验 动物血小板低下模型的血小板数量， 且药效学作用明显强于 TH。

11、PO ； 安全性实验表明， rLZ-8 对大鼠血细胞无明显毒性 ； 对主动脉、 主静脉血管壁未见病理性破坏作用 ； 骨髓涂片结果 表明对造血机能也无病变作用。本发明首次公开了 LZ-8 对预防及治疗多种原因导致的血 小板减少症的新用途。 0010 发明内容 0011 本发明的内容为重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在治疗血小板减少症中的应用。 0012 本发明公开了 rLZ-8 具有预防和治疗血小板减少症的作用。在环磷酰胺所致小鼠 和犬血小板减少症的预防和治疗实验中， 将生理盐水配制的 rLZ-8 对实验动物血小板低下 模型进行给药， 用THPO和IL-6为阳性药物， 连续给药， 检测血液中血。

12、小板数量， 对比治疗前 后血小板数变化， 分析药物疗效。与模型组比较， 在给药初期 ( 第 3-5 天 )rLZ-8 药物组已 明显剌激小鼠、 豚鼠和犬的血小板增生， 差异极其显著， 在给药中期 ( 第 7-10 天 ) 时恢复到 正常水平， 在治疗由注射抗血小板血清导致的血小板减少症豚鼠实验动物模型也取得了很 好的效果。 0013 具体实施方式 ： 0014 实施例 1.rLZ-8 预防环磷酰胺引起的犬血小板减少症的药效学试验 0015 1. 药物配制 ： 0016 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌生理盐水配制成 3.85gkg-1、 1.925gkg-1剂量组， 1。

13、ml/ 只。 0017 阳 性 对 照 药 ： 血 小 板 生 成 素 (THPO)， 沈 阳 三 生 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产， 20gkg-1/d， 1ml/ 只。 0018 化疗药物 ： 环磷酰胺 (Cy)， 江苏恒瑞制药有限公司生产， 生产批号 08112121 ； 200mg/ 支。用电子秤准确称取 7mgkg-1/ 只。 0019 血小板稀释液 ： 尿素 ： 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0020 2. 实验方法 ： 0021 实验动物分成 5 组， 分别为正常对照组、 模型组 (CP)、 。

14、阳性药物对照组和实验药物 组， 每组2只犬， 雌雄各半。 除正常对照组(给予等体积生理盐水)外， 每只犬均给予口服环 磷酰胺(7mg kg-1/只/d)， 连续5天。 rLZ-8和阳性药物对照组于第一次口服环磷酰胺的同 时给药， 连续皮下注射 11 天。按上述分组分别给予 rLZ-8(3.85gkg-1、 1.925gkg-1， 1ml/ 只 /d)、 阳性药 (THPO 20gkg-1、 1ml/ 只 /d)， 药后第一天开始隔日采集静脉血于显 微镜下进行血小板计数。 0022 3. 实验结果 ： 0023 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用 。

15、SPSS16.0。与模型组比较， 各药物剂量组每只犬在口服给药环磷酰胺第 7 天血小板明显 说 明 书 CN 101612385 B 4 3/7 页 5 下降， 第 11 天降至最低值 ； 与模型组比较， 各药物剂量组血小板数明显高于模型组， 具有显 著性差异 (p 0.05)。 0024 表 1.rLZ-8 预防犬白细胞减少症每只犬血小板结果 ( 单位 ： *109/L) 0025 0026 表 2.rLZ-8 预防犬血小板减少症血小板数试验结果 (xS， n 2)( 单位 ： *109/L) 0027 0028 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 0029 实施例 2.rLZ-8。

16、 治疗环磷酰胺引起的犬血小板减少症的药效学试验 0030 1. 药物配制 ： 0031 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌生理盐水配制成 3.85gkg-1、 1.925gkg-1剂量组， 1ml/ 只。 0032 阳 性 对 照 药 ： 血 小 板 生 成 素 (THPO)， 沈 阳 三 生 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产， 20gkg-1/d， 1ml/ 只。 0033 化疗药物 ： 环磷酰胺 (Cy)， 江苏恒瑞制药有限公司生产， 生产批号 08112121 ； 200mg/ 支。用电子秤准确称取 7mgkg-1/ 只。 0034 血小板稀释液 ： 尿素 ：。

17、 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0035 2. 实验方法 ： 0036 实验动物分成 5 组， 分别为正常对照组、 模型组 (CP)、 阳性药物对照组和实验组， 每组 2 只犬， 雌雄各半。除正常对照组 ( 给予等体积生理盐水 ) 外， 每只犬均给予口服环磷 酰胺 (7mg kg-1/ 只 /d)， 连续 5 天。于第 11 天， 血小板下降至最低值时， 按上述分组分别皮 下注射给予 rLZ-8(3.85gkg-1、 1.925gkg-1， 1ml/ 只 /d)、 阳性药 (THPO 20gkg-1、 1ml/只/d。

18、)治疗， 连续给药7天， 并于造模前、 造模后、 给药第3天、 7天、 14天采集静脉血于 显微镜下进行血小板计数。 说 明 书 CN 101612385 B 5 4/7 页 6 0037 3. 实验结果 ： 0038 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用SPSS16.0。 与模型组比较， 各药物剂量组每只犬给药第3天血小板数已明显升高， 在给药 第 7 天基本达到正常， 且有显著性差异 (p 0.05)。 0039 表 3.rLZ-8 治疗犬白细胞减少症每只犬血小板结果 ( 单位 ： *109/L) 0040 0041 表 4.rLZ-8 治疗犬。

19、血小板减少症血小板数试验结果 (xS， n 2)( 单位 ： *109/L) 0042 0043 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 0044 实施例 3.rLZ-8 预防环磷酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验 0045 1. 药物配制 ： 0046 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌注射用水配制成 19.25gkg-1、 9.625gkg-1剂量组， 0.2ml/ 只。 0047 阳 性 对 照 药 ： 血 小 板 生 成 素 (THPO)， 沈 阳 三 生 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产， 770gkg-1/d， 0.2ml/ 只。 0048 化。

20、疗药物 ： 环磷酰胺 (Cy)， 江苏恒瑞制药有限公司生产， 生产批号 08112121 ； 200mg/ 支。无菌注射用水配制成 100mgkg-1， 0.2ml/ 只。 0049 血小板稀释液 ： 尿素 ： 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0050 2. 实验方法 ： 0051 实验动物分成 5 组， 每组 10 只小鼠， 雌雄各半。除正常对照组 ( 给予等体积生理 盐水 ) 外， 每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺， 100mgkg-1， 0.2ml/ 只 /d， 连续 3 天。rLZ-8 和 阳性药物对照组于第一次注射。

21、环磷酰胺的同时给药， 连续 11 天。按上述分组分别皮下给予 rLZ-8(19.25gkg-1、 9.625gkg-1 0.2ml/ 只 /d)、 阳性药 (THPO 770gkg-1、 0.2ml/ 说 明 书 CN 101612385 B 6 5/7 页 7 只 /d)， 药后第一天开始隔日采集静脉血于显微镜下进行血小板计数。 0052 3. 实验结果 ： 0053 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用SPSS16.0。 与模型组比较， 各药物剂量组每组鼠在给药环磷酰胺第7天血小板明显下降， 第 11 天降至最低值 ； 与模型组比较， 各药物剂。

22、量组血小板数明显高于模型组， 具有显著性 差异 (p 0.05)。 0054 表5.rLZ-8预防小鼠血小板减少症血小板数试验结果(xS， n10)(单位 ： *109/ L) 0055 0056 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 0057 实施例 4.rLZ-8 治疗环磷酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验 0058 1. 药物配制 ： 0059 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌注射用水配制成 19.25gkg-1、 9.625gkg-1剂量组， 0.2ml/ 只。 0060 阳 性 对 照 药 ： 血 小 板 生 成 素 (THPO)， 沈 阳 三 生。

23、 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产， 770gkg-1/d， 0.2ml/ 只。 0061 化疗药物 ： 环磷酰胺 (Cy)， 江苏恒瑞制药有限公司生产， 生产批号 08112121 ； 200mg/ 支。无菌注射用水配制成 100mgkg-1， 0.2ml/ 只。 0062 血小板稀释液 ： 尿素 ： 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0063 2. 实验方法 ： 0064 实验动物分成 5 组， 每组 10 只小鼠， 雌雄各半。除正常对照组 ( 给予等体积生 理盐水 ) 外， 每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺， 10。

24、0mgkg-1， 0.2ml/ 只 /d， 连续 3 天。血小 板数降到 300109/L 以下时， 按上述分组分别皮下给予相应剂量 rLZ-8(19.25gkg-1、 9.625g kg-1 0.2ml/ 只 /d) 及阳性药 (THPO 770g kg-1、 0.2ml/ 只 /d) 治疗， 正常对照 组和模型组 (CP) 组给予等体积生理盐水， 于治疗第 3d 和第 7d、 14d 分别小鼠尾静脉取血， 高倍镜下血小板计数。 0065 3. 实验结果 ： 0066 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用SPSS16.0。 与模型组比较， 各药物。

25、剂量组每只小鼠给药第3天血小板数已明显升高， 在给 药第 7 天基本达到正常， 且有显著性差异 (p 0.05)。 0067 表6.rLZ-8治疗小鼠血小板减少症血小板数试验结果(xS， n10)(单位 ： *109/ L) 说 明 书 CN 101612385 B 7 6/7 页 8 0068 0069 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 0070 实施例 5.rLZ-8 治疗豚鼠血小板减少症的药效学试验 0071 1. 药物配制 ： 0072 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌注射用水配制成 40gkg-1、 20gkg-1剂量组， 0.2ml/ 只。 00。

26、73 阳性对照药 ： 重组白介素 6(rhIL-6)， 40gkg-1/d， 0.2ml/ 只。 0074 造模药物 ： 豚鼠血小板抗血清， 1mlkg-1。 0075 血小板稀释液 ： 尿素 ： 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0076 2. 实验方法 ： 0077 实验动物分成5组， 每组10只豚鼠， 雌雄各半。 除正常对照组(给予等体积生理盐 水 ) 外， 每组豚鼠均注射血小板抗血清 (1mlkg-1)， 24h 后， 各组血小板均降至最低值。于 给药 4h 后， 按上述分组分别肌注给予相应剂量 rLZ-8(40。

27、gkg-1、 20gkg-1 0.2ml/ 只 /d) 及阳性药 (rhIL-6 40gkg-1、 0.2ml/ 只 /d) 治疗， 正常对照组和模型组给予等体积 生理盐水， 于治疗第 3d 和第 7d、 14d 分别豚鼠足垫采血， 高倍镜下血小板计数。 0078 3. 实验结果 ： 0079 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用SPSS16.0。 与模型组比较， 各药物剂量组豚鼠在给药第3天血小板数已明显升高， 在给药 第 7 天基本达到正常， 且有显著性差异 (p 0.05)。 0080 表7.rLZ-8治疗豚鼠血小板减少症血小板数试验结果(x。

28、S， n10)(单位 ： *109/ L) 0081 0082 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 0083 实施例6.rLZ-8治疗环磷酰胺引起的小鼠血小板减少症的药效学试验(鼻腔给药 途径 ) 0084 1. 药物配制 ： 0085 试验用药 ： 重组灵芝免疫调节蛋白 (rLZ-8) 无菌注射用水配制成 9.625gkg-1、 4.81gkg-1、 2.40gkg-1剂量组， 10ul/ 只。 说 明 书 CN 101612385 B 8 7/7 页 9 0086 阳 性 对 照 药 ： 血 小 板 生 成 素 (THPO)， 沈 阳 三 生 制 药 股 份 有 限 公 司 生 。

29、产， 770gkg-1/d， 10ul/ 只。 0087 化疗药物 ： 环磷酰胺 (Cy)， 江苏恒瑞制药有限公司生产， 生产批号 08112121 ； 200mg/ 支。无菌注射用水配制成 100mgkg-1， 0.2ml/ 只。 0088 血小板稀释液 ： 尿素 ： 1.3g、 枸橼酸钠 ： 0.5g、 甲醛 ： 0.1ml， 加蒸馏水至 100ml 混 合， 过滤备用。 0089 2. 实验方法 ： 0090 实验动物分成 6 组， 每组 10 只小鼠， 雌雄各半。除正常对照组 ( 给予等体积生理 盐水 ) 外， 每组小鼠均腹腔注射环磷酰胺， 100mgkg-1， 0.2ml/ 只 /d。

30、， 连续 3 天。血小板数 降到 300109/L 以下时， 按上述分组分别鼻腔途径给予相应剂量 rLZ-8(9.625gkg-1、 4.81g kg-1、 2.40g kg-1、 10ul/ 只 /d) 及阳性药 (THPO 770g kg-1/d， 10ul/ 只 / 天 ) 治疗， 正常对照组和模型组 (CP) 组给予等体积生理盐水， 于治疗第 3d 和第 7d、 14d 分别小 鼠尾静脉取血， 高倍镜下血小板计数。 0091 3. 实验结果 ： 0092 所有实验数据先进行检验方差齐性， 再进行独立样本的组间 t 检验， 统计软件采 用 SPSS16.0。进行比较与模型组比较， 各药物剂量每组小鼠给药第 3 天血小板数已明显升 高， 在给药第 7 天基本达到正常， 且有显著性差异 (p 0.05)。 0093 表8.rLZ-8治疗小鼠血小板减少症血小板数试验结果(xS， n10)(单位 ： *109/ L) 0094 0095 与模型组比较存在显著性差异， *p 0.05 说 明 书 CN 101612385 B 9 。