一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备与应用.pdf

《一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备与应用.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101829367 B (45)授权公告日 2013.05.08 CN 101829367 B *CN101829367B* (21)申请号 200910264113.1 (22)申请日 2009.12.30 A61L 31/10(2006.01) A61L 31/16(2006.01) A61K 48/00(2006.01) (73)专利权人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市丹徒路 301 号 (72)发明人 徐希明 曹霞 苏伟燕 余江南 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 黄嘉栋 US 2005/0025807 A1,2005.。

2、02.03,说明书第 0073-0093 段 . CN 1820790 A,2006.08.23,说明书具体实施 方式 . CN 101062430 A,2007.10.31,说明书具体实 施方式 . CN 101445806 A,2009.06.03,说明书具体实 施方式 . (54) 发明名称 一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备 与应用 (57) 摘要 一种基因传递系统的三维纳米支架， 它是 由胶原、 壳聚糖以及纤维粘结蛋白组成的三维 纳米支架， 其特征是 ： 它包含有载有基因的磷酸 钙复合纳米粒， 它是一种疏松多孔的三维纳米 支架， 所述的胶原、 壳聚糖、 纤维粘结蛋白和戊 二醛的质。

3、量比为 ： 1 1 0.0005 0.0124 1 100 0.08 0.24， 所述的纤维粘结蛋白为 含有天门冬氨酸 (Arg-Gly-Asp， RGD) 序列的纤 维粘结蛋白， 所述的载有质粒的磷酸钙复合纳米 粒是球形的、 粒径小于 50nm 的载有治疗基因的 磷酸钙纳米粒， 其含量为三维纳米支架总质量的 0.01 1。本发明的基因传递系统的三维纳 米支架在 3-15 天内， 蛋白表达水平维持在 10ng/ ml 左右， 说明嵌合有载有基因的磷酸钙复合纳米 粒的三维纳米支架具有明显的长效、 缓释特征。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 樊培伟 权利要求书 1 页 说明书 4。

4、 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)授权公告号 CN 101829367 B CN 101829367 B *CN101829367B* 1/1 页 2 1. 一种基因传递系统的三维纳米支架， 它是由胶原、 壳聚糖以及纤维粘结蛋白 (Fibronectin， FN) 组成的三维纳米支架， 其特征是 ： 它包含有载有基因的磷酸钙复合纳米 粒， 它是一种疏松多孔的三维纳米支架， 所述的胶原、 壳聚糖、 纤维粘结蛋白和戊二醛的质 量比为 ： 1: 1:0.0005: 0.01241:100:0.08:0.24， 所。

5、述的纤维粘结蛋白为含有天门冬氨酸 序列的纤维粘结蛋白， 所述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒是球形的、 粒径小于 50nm 的载 有治疗基因的磷酸钙纳米粒， 其含量为三维纳米支架总质量的 0.01%1%。 2. 一种制备权利要求 1 所述的基因传递系统的三维纳米支架的方法， 其特征是 ： 它是 将质量百分浓度为 1% 的胶原醋酸溶液加入壳聚糖， 使壳聚糖的质量百分浓度达到 1%， 冷冻 干燥， 加入 0.25%， 50L 戊二醛交联， 室温过夜后再冷冻干燥， 用缓冲液洗涤， 加入载有治 疗基因的磷酸钙纳米粒 0.6g60g 和纤维粘结蛋白 0.05g8g， 冷冻干燥得到基因 传递系统的三维纳米支架。

6、。 3. 根据权利要求 1 所述的基因传递系统的三维纳米支架在非病毒基因传递系统中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 101829367 B 1/4 页 3 一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备与应用 技术领域 0001 本发明涉及三维非病毒基因传递系统， 具体地说， 涉及三维纳米支架、 种子细胞的 培养及其基因转染。 背景技术 0002 基于组织工程三维支架的非病毒基因传递系统 (3 dimensional scaffolds genedelivery system， 3DS-GDS) 已经成为非病毒型 GDS 研究的又一重要方向。种子细胞， 三维支架及生长因子是组织工程研究的三大要素，。

7、 三维支架和生长因子构成细胞赖以生存 的微环境。细胞培养过程中， 生长因子往往直接加入培养液中， 由于生长因子半衰期短， 易 被稀释和降解， 这种 “外加法” 需要反复大剂量给药， 繁琐且价格非常昂贵。通过转基因技 术将生长因子基因导入种子细胞后， 可使细胞自身表达生长因子， 这种 “内加法” 无疑是有 利于组织的修复与再生。 传统的基因传递技术， 无论是病毒型还是非病毒型， 一般只是瞬时 转染， 难以实现生长因子持续高效的表达。为此， 人们尝试在三维支架中包嵌 DNA， 以便基 因随着支架的逐步降解缓慢释放， 持续转染细胞 ( 参见 ： StorrieH， Mooney DJ.Sustain。

8、ed delivery of plasmid DNA from polymeric scaffolds fortissue engineering.Adc Drug Deliv Rev.， 2006， 58(4) ： 500-514 ； Tabata Y.Regenrative inductive therapy based on DDS technology of protein and gene.JDrug Target， 2006， 14(7) ： 483-495)。 目前可用于基因缓释的支架材料有 ( 参见 ： CaptioRM， Sepctor M.Collagen scaffold。

9、s for nonviral IGF-1 gene delivery in articularcartilage tissue engineeringJ. Gene Ther.2007， 14(9) ： 721-32 ； Yuanyuan W， Li L， Shengrong G.Characterization of biodegradable and cytocompatiblenano-hydroxyapatite/poly caprolactone porous scaffolds in degradation in vitroJ.Polymer Degradation and Sta。

10、bility， 2009， 1-7) ： 细胞外基质 (Extracellularmatrix， ECM)、 天然或合成的高分子及其共聚 物 等，其 中 ECM( 参 见 ： SepidehHeydarkhan-Hagvall， Katja Schenke-Layland， Andrew P.Dhanasopon， et al.Three-dimensional electrospun ECM-based hybrid scaffolds for cardiovasculartissue engineeringJ.Biomaterials， 2008， 29(19) ： 2907-2914) 。

11、是由邻近细胞分泌的蛋白纤维、 蛋白聚糖和非纤维蛋白等成分通过化学和物理交联组成的 具有三维结构的网状结构， 为组织和细胞的生长提供支撑和弹性， 与细胞特别亲合、 易于模 拟体内环境。Capito 等将胰岛素样生长因子的基因与脂质体转染试剂复合后， 与 ECM( 胶 原 - 氨基聚糖 ) 三维支架交联， 在两周培养期内仅释放出约 1， 连续表达的胰岛素样生 长因子可显著促进组织的再生 ( 参见 ： Captio RM， Sepctor M.Collagen scaffolds for nonviralIGF-1 gene delivery in articular cartilage tissu。

12、e engineeringJ.Gene Ther.2007， 14(9) ： 721-32)。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种基于组织工程三维支架的非病毒基因传递系统及 说 明 书 CN 101829367 B 2/4 页 4 其在非病毒基因传递系统中的应用。 0004 本发明的技术方案如下 ： 0005 一种基因传递系统的三维纳米支架， 它是由胶原、 壳聚糖以及纤维粘结蛋白 (Fibronectin， FN) 组成的三维纳米支架， 其特征是 ： 它包含有载有基因的磷酸钙复合纳米 粒， 它是一种疏松多孔的三维纳米支架， 所述的胶原、 壳聚糖、 纤维粘结蛋白和交联剂戊二 醛的质量。

13、比为 ： 1 1 0.0005 0.0124 1 100 0.08 0.24， 所述的纤维粘结蛋 白为含有天门冬氨酸 (Arg-Gly-Asp， RGD) 序列的纤维粘结蛋白， 所述的载有基因的磷酸钙 复合纳米粒是球形的、 粒径小于 50nm 的载有治疗基因的磷酸钙纳米粒， 其含量为三维纳米 支架总质量的 0.01 -1。 0006 一种制备上述的基因传递系统的三维纳米支架的方法， 它是在 1胶原醋酸溶 液 0.1 1ml 中加入 1壳聚糖醋酸溶液 0.1 1ml， 加入 0.25戊二醛 50L 1ml 交联， 室温过夜， 冷冻干燥， 缓冲液 (PBS) 洗涤三次， 细胞培养基 (Dulbec。

14、co s Modified EagleMedia， DMEM) 浸泡过夜后再冷冻干燥， 用 PBS 洗涤， 加入载有治疗基因的磷酸钙纳米 粒0.6g60g和纤维粘结蛋白(FN)0.05g8g， 冷冻干燥得到基因传递系统的三 维纳米支架。 0007 本发明的基因传递系统的三维纳米支架在非病毒基因传递系统中的应用。 0008 实验表明 ： 应用本发明的基因传递系统的三维纳米支架的非病毒基因传递系统具 有高效缓释的特性， 其所负载的基因的表达可达到外加因子的水平。 0009 本发明的有益之处是 ： 本发明是在三维支架中加入如含有 RGD 序列的 FN 及磷酸 钙 -TGF1 复合纳米粒， 形成新型三。

15、维非病毒纳米基因传递系统， 这种新型的传递系统具 有高效缓释的特性， 其所负载的基因的表达可达到外加因子的水平。为非病毒基因传递及 组织工程修复方面提供了新的思路。 附图说明 0010 图 1 自制载有治疗基因磷酸钙纳米粒的电镜图 0011 图 2 为胶原 - 壳聚糖 -FN 三维支架扫描电镜图 ( 不含载基因的磷酸钙纳米粒 )。 0012 图 3 为含有载基因磷酸钙纳米粒的三维支架扫描电镜图 ( 箭头所示为复合纳米 粒 )。 0013 图4为三维非病毒纳米基因传递系统接种细胞的扫描电镜图(箭头所示为细胞)。 0014 图 5 为 ELISA 法测定三维纳米支架与游离 DNA+ 支架在不同时间。

16、 (3-15 天 ) 细胞 蛋白表达浓度。(*P 0.05， *P 0.05， *P 0.01)。 0015 图 6 为 ELISA 法测定三维纳米支架与市售转染试剂脂质体 lipfectamineTM2000 3-15 天细胞表达的目的蛋白结果图 (*P 0.05， *P 0.05， *P 0.01)。 具体实施方式 0016 本发明通过实施例作进一步的说明。 0017 实施例 1 ： 载有治疗基因的磷酸钙纳米粒的制备 0018 (1) 制备 ： 将 0.1M Igepal CO-520 溶于 25ml 环己烷， 加入 1.36M 氯化钙， 搅拌混 匀形成微乳 1 ； 将 0.1M Igep。

17、al CO-520， 50lTis-HCL(pH 7.4) 溶于 25ml 环己烷， 加入磷 说 明 书 CN 101829367 B 3/4 页 5 酸氢二钠和 TGF-1 质粒， 加入磷酸氢二钠的质量为 3.4785g， 磷酸氢二钠与质粒的质量 比为 0.1 1 10 1， 搅拌形成微乳 2， 将微乳 2 缓慢滴加到微乳 1 中， 搅拌 10min， 形成 载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乳液。 0019 (2) 载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离 ： 0020 (a) 层析柱的预处理 ： 0021 取 90g 硅 球 加 入 含 有 0.336mL 氨 基 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 (a。

18、minopropyltriethoxysilane， APS)， 1.5mL 冰乙酸， 7.5L 双蒸水的 150mL 乙醇溶液中， 搅拌过夜， 70烘干备用 ； 0022 (b) 载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离 ： 0023 将上述制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒乳液过硅胶层析柱， 先用无水乙醇洗 脱环己烷及游离的质粒和盐， 然后用浓度为 510-4mol/L 的 NaCl 的 70乙醇溶液洗脱载 基因的磷酸钙复合纳米粒 ； 0024 (c) 载有基因的磷酸钙复合纳米粒乙醇液的浓缩 0025 将步骤 2 所得的含有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乙醇液在 37旋转减压蒸 发 6h 除去乙醇， 。

19、浓缩液置于 12KD 的透析袋中， 置于磷酸盐缓冲液中， 4透析过夜， 即得到 载有基因的磷酸钙复合纳米粒。得到的载有基因的磷酸钙复合纳米粒的电镜照片见图 1。 0026 实施例 2 ： 一种作为对比的三维支架的制备 0027 取 1胶原醋酸溶液 0.1ml 加入 1壳聚糖溶液 0.1ml， 冷冻干燥， 加入 0.25 戊二醛 50L 交联， 室温过夜， 冷冻干燥， PBS 洗涤三次， 冷冻干燥， 加入纤维粘结蛋白 (FN)1g， 得到不含载有治疗基因的磷酸钙纳米粒的三维支架， 其电镜照片见图 2。 0028 实施例 3 ： 本发明的三维纳米支架的制备 0029 取 1胶原醋酸溶液 0.1ml。

20、 加入 1壳聚糖溶液 0.1ml， 冷冻干燥， 加入 0.25 戊二醛 50L 交联， 室温过夜， 冷冻干燥， PBS 洗涤三次， 20min/ 每次， 细胞培养基 (Dulbecco sModified Eagle Media， DMEM) 浸泡过夜 ； PBS 洗涤三次， 20min/ 每次， 加入实 施例1制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒1g和FN1g， 冷冻干燥得到本发明的三维纳 米支架， 其电镜照片见图 3。 0030 实施例 4 ： 本发明的三维纳米支架的制备 0031 取 1胶原醋酸溶液 0.1ml 加入 1壳聚糖溶液 10ml， 冷冻干燥， 加入 0.25 戊 二 醛 1ml 。

21、交 联， 室 温 过 夜， 冷 冻 干 燥， PBS 洗 涤 三 次， 20min/ 每 次， 细 胞 培 养 基 (Dulbecco sModified Eagle Media， DMEM) 浸泡过夜 ； PBS 洗涤三次， 20min/ 每次， 加入实 施例 1 制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒 60g 和 FN8g， 冷冻干燥得到本发明的三维 纳米支架， 其形貌和性能同实施例 3 制得的三维纳米支架。 0032 实施例 5 ： 大鼠间质干细胞 (mesenchymal stem cells， MSC) 的培养 0033 将 SD 大鼠拉颈处死， 体积分数为 75乙醇浸泡 3 5min， 。

22、无菌条件下取出胫骨 和股骨 ； 将其两端干骺端切除， 显露骨髓腔， 用无菌注射器吸取适量 PBS 彻底冲洗骨髓腔 ； 反复吹打冲出的骨髓， 使骨髓细胞充分分散 ； 所获骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预加 的 Percoll 分离液 ( 相对体积质量 1.073) 的离心管中， 骨髓单细胞悬液与分离液的比例为 1 1 ； 2000rpm， 离心 20min， 吸取中间云雾状细胞层， 用 PBS 洗涤 3 次 ； 重新悬起细胞， 加入 完全培养基 ( 含体积分数为 10胎牛血清的 DMEM 培养基 )， 置于培养瓶中， 37体积分数 说 明 书 CN 101829367 B 4/4 页 6 为 5。

23、的 CO2培养箱中培养。 0034 实施例 6 ： 三维纳米支架的体外转染 0035 (1) 取适量实施例 3 制得的三维纳米支架置于 24 孔板中， 将 MSC 按 2104/mL 接 种于支架上， 加入完全培养基至 500L， 置 37、 5 CO2培养箱中培养 ； 分别在 3、 6、 9、 12、 15d 收集上清培养液于 -20保存， 细胞继续用完全培养基进行培养。接种有细胞的三维支 架电镜照片见图 4。 0036 (2)对照组一 ： 取适量的三维支架置于24孔板中， 将MSC按2104/mL接种于支架 上， 加入完全培养基至 500L， 置 37、 5 CO2培养箱中培养 ； 24h。

24、， 吸弃前一天铺板的培养 液， 加入游离质粒以及无血清的 DMEM 培养液至 500L， 置 37、 5 CO2培养箱中培养 ； 分 别在 3、 6、 9、 12、 15d 收集上清培养液于 -20保存， 细胞继续用完全培养基进行培养。 0037 (3)对照组二 ： 取适量的三维支架置于24孔板中， 将MSC按2104/mL接种于支架 上， 加入完全培养基至 500L， 置 37、 5 CO2培养箱中培养 ； 24h， 吸弃前一天铺板的培养 液， 用 PBS 洗涤后， 加入市售转染试剂脂质体 lipfectamineTM2000 以及无血清的 DMEM 培养 液至 500L， 继续培养 6h 。

25、； 换用完全培养基继续培养。分别在 3、 6、 9、 12、 15d 收集上清培养 液于 -20保存， 细胞继续用完全培养基进行培养。 0038 实施例 7 ： 体外转染细胞的转染效率测定 0039 收集细胞培养物上清， 离心， 加到酶标板中。分别设空白孔、 标准孔、 待测样品孔。 除空白孔外， 余孔分别加标准溶液或待测样品 100ul， 注意不要有气泡， 轻轻混匀， 酶标板加 上盖， 37反应 120 分钟。弃去液体， 甩干， 不用洗涤。每孔加检测溶液 A 工作液 100ul， 37， 60 分钟。洗板 3 次， 350ul/ 每孔， 甩干。每孔加检测溶液 B 工作液 100ul， 37， 。

26、60 分 钟， 洗板 5 次， 甩干。依序每孔加底物溶液 90ul， 37避光显色 30 分钟 ( 此时肉眼可见标准 品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色， 后 3-4 孔梯度不明显 )。依序每孔加终止溶液 50ul， 终止 反应 ( 此时兰色立转黄色 )。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长测量各孔的光密度 (OD 值 )， 测定目的蛋白表达量， 其结果见图 5 和图 6。 0040 三维纳米支架在 3-15 天内， 蛋白表达水平维持在 10ng/ml 左右， 显著高于对照 组一 ( 游离 DNA+ 三维支架 )(P 0.01)。从第 6 天开始， 对照组二 ( 市售转染试剂脂质 体 lipfectamineTM2000+ 三维支架 ) 的蛋白表达水平远低于三维纳米支架 (P 0.05 或 P 0.01)， 说明嵌合有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的三维纳米支架具有明显的长效、 缓释 特征。 说 明 书 CN 101829367 B 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101829367 B 2/2 页 8 图 6 说 明 书 附 图 CN 101829367 B 。