一种预防黄颡鱼红头病的疫苗.pdf

《一种预防黄颡鱼红头病的疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种预防黄颡鱼红头病的疫苗.pdf（15页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101829321 B (45)授权公告日 2012.12.12 CN 101829321 B *CN101829321B* (21)申请号 200910221991.5 (22)申请日 2009.11.17 CCTCC NO:M209176 2009.08.08 200910058575.8 2009.03.12 CN A61K 39/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (73)专利权人 通威股份有限公司 地址 610041 四川省成都市高新区创业路 2 号 (72)发明人 肖丹 罗远会 方芳 黄冠军 耿毅 邓龙君 康琦 刘衍鹏 (74)。

2、专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 CN 101319009 A,2008.12.10, CN 101342367 A,2009.01.14, 耿毅， 等 . 鮰爱德华氏菌与鮰爱德华氏菌 病 .水产科技情报 .2009, 第 36 卷 ( 第 5 期 ),236 240. (54) 发明名称 一种预防黄颡鱼红头病的疫苗 (57) 摘要 本发明提供鮰爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri) 在制备鱼用疫苗中的应用。本发明还 提供一种鱼用疫苗， 它含有致免疫有效量的灭活 的鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictalur。

3、i)， 及药 学上可接受的辅料或载体。本发明的疫苗或者联 合疫苗能够针对性的防治黄颡鱼红头病， 效果良 好， 是一种成本低廉， 健康环保的防治方法。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 温庭江 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 鮰爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri) 在制备鱼用疫苗中的应用 ； 所述鱼类为黄 颡鱼。 2. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 应 用。

4、，其 特 征 是 ：所 述 鮰 爱 德 华 氏 菌 (Edwardsiellaictaluri) 为保藏编号为 CCTCC NO ： M 209176 的菌株。 3. 一 种 鱼 用 疫 苗， 其 特 征 是 ： 含 有 致 免 疫 有 效 量 的 灭 活 的 鮰 爱 德 华 氏 菌 (Edwardsiella ictaluri)， 及药学上可接受的辅料或载体。 4. 根 据 权 利 要 求 3 所 述 的 疫 苗，其 特 征 是 ：所 述 鮰 爱 德 华 氏 菌 (Edwardsiellaictaluri) 为保藏编号为 CCTCC NO ： M 209176 的菌株。 5. 根据权利要求 。

5、3 或 4 所述的鱼用疫苗， 其特征是 ： 所述的致免疫有效量为 106-108CFU/ml。 6. 根据权利要求 3 所述的鱼用疫苗， 其特征是 ： 所述的辅料或载体为水或吸附剂。 7.根据权利要求6所述的鱼用疫苗， 其特征是 ： 所述的水为生理盐水或蒸馏水 ； 吸附剂 是沸石或硅藻土。 8. 一种疫苗组合物， 包含权利要求 3 所述的鱼用疫苗以及透皮吸收促进剂且任选一种 或多种药学上可接受的辅料或载体。 9. 根据权利要求 8 所述的疫苗组合物， 其特征是 ： 所述透皮吸收剂为氮酮。 10. 权利要求 3 所述的鱼用疫苗在制备预防黄颡鱼红头病的药物中的用途。 11. 权利要求 8 所述的疫。

6、苗组合物在制备预防黄颡鱼红头病的药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 101829321 B 2 1/12 页 3 一种预防黄颡鱼红头病的疫苗 技术领域 0001 本发明涉及一种鱼用疫苗， 特别是一种预防黄颡鱼红头病的疫苗。 背景技术 0002 黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)， 俗称黄腊丁， 属于鲶形目 (Siluriformes) 鲿科(Bagridae)黄颡鱼属(Pelteobagrus)。 其具有肉质细嫩， 味道鲜美， 无肌间刺， 营养丰 富， 低脂肪高蛋白特点， 深受消费者欢迎， 因此， 黄颡鱼养殖在全国范围内得到了迅速发展， 其养殖规模与养殖产量都逐年。

7、增加。 但近年来在各黄颡鱼养殖区发生了一种以头部皮肤充 血、 出血， 发红， 甚至破裂， 形成开放性溃疡为病变特征的 “红头病” ， 具有传染性强， 死亡率 高等特点。 目前对该病的病原学不清楚， 一些养殖户认为是寄生虫性疾病 ； 也有人认为是细 菌性疾病 ； 还有人认为是病毒性疾病。 由于对病原学的不清楚， 生产中一旦发生该病都是采 用下大包围的方式用药物， 这不仅导致治疗成本的增加， 同时由于药物的滥用也导致耐药 性的产生， 给该病的治疗带来很大困难， 同时， 由于过度用药， 也导致鱼体内抗生素残留超 标， 对水产品品质造成影响， 由此导致严重的经济损失， 严重阻碍了黄颡鱼养殖在我国的健 。

8、康发展。 发明内容 0003 为了避免盲目用药带来的损失， 明针对黄颡鱼红头病提供一种鱼用疫苗， 是由 爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri) 灭活制备而成的， 优选方案， 由保藏编号为 CCTCC NO ： M 209176 的菌株灭活制备而成。 0004 本发明的鱼用疫苗， 含有致免疫有效量的灭活的爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri)， 及药学上可接受的辅料或载体， 所述的致免疫有效量为 106-108CFU/ml。 0005 本发明的疫苗可以有多种剂型， 如辅料为水时可以制备成水剂， 辅料可以是生理 盐水或蒸馏水 ； 当辅料为吸附剂时， 可以制备。

9、成粉剂， 所述的吸附剂可以是沸石或硅藻土。 0006 本发明疫苗还可以由灭活爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri)， 加入透皮吸 收促进剂及且任选一种或多种药学上可接受的辅料或载体， 能够促进鱼体从皮肤吸收疫 苗， 从而达到更好的预防效果。 透皮吸收促进剂优选氮酮。 更优选的是， 由保藏编号为CCTCC NO ： M 209176 的菌株灭活制备而成。 0007 本发明的疫苗或者联合疫苗能够针对性的防治黄颡鱼红头病， 效果良好， 是一种 成本低廉， 健康环保的防治方法。 0008 以下通过具体实施方式更进一步说明本发明技术方案， 但是并非对本发明的限 制， 凡依据本发明上述。

10、内容所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0009 图 1 基于 16S rDNA 序列构建的 CHNYC01 与 CHNYC02 菌株与其他相关菌株的系统 发育树 说 明 书 CN 101829321 B 3 2/12 页 4 0010 图 2CHNGY01 与 CHNGY02 菌株 16S rDNA 序列与参比菌株 16S rDNA 序列的同源性 0011 图中 ： Flavbobacterium columnaris 柱状黄杆菌 (AB0156515、 AF095342) 0012 Edwardsiella hoshinae 保科爱德华氏菌 (AB050825) 0013 Edwa。

11、rdsiella ictaluri爱德华氏菌 (AB050826、 AB453281、 DQ985469) 0014 Yersinia ruckeri 红色耶尔森菌， 鳟鱼红嘴病耶杆菌 (AF366385、 EU401667) 0015 Psedomonas fluorescens 荧光假单胞菌 (AY472116) 0016 Aeromonas sobria 温和气单胞菌 (AY827494、 X60412) 0017 Aeromonas caviae 豚鼠气单胞菌 (AY987759、 EU082831) 0018 Vibrio anguillarum 鳗弧菌 (EF467287) 001。

12、9 Vibrio ordalii 病海弧菌 (EU107968) 0020 Edwardsiella tarda 迟钝爱德华氏菌 缓慢爱德华氏菌 (EU259317、 FJ009591) 具体实施方式 0021 免疫是动物机体识别和清除抗原异物， 保持体内、 外环境平衡的一种生理反应。 免 疫防治是利用动物自身具有的特异性与非特异性免疫功能， 通过疫苗， 免疫激活剂、 免疫增 强剂等使养殖动物获得或增加免疫机能， 从而增强动物机体的特异性与非特异性的抗病能 力。 在传统的水产动物疾病防治中， 主要是药物防治， 其中抗生素与化学药物的广泛应用已 导致病原菌的严重耐药性， 并对生态环境造成巨大压力。

13、， 同时由于药物的残留对消费者存 在潜在的威胁， 因此水产动物疾病的免疫防治将是未来我国水产养殖业健康可持续发展的 需要。 0022 我们的研究已证实其病原为爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri)， 尽管该病 原菌对对氟苯尼考、 丁胺卡那霉素与强力霉素高度敏感， 但这些药物的长期使用必然会导 致耐药性的产生， 与此同时， 药物的残留也会对人类健康造成潜在的威胁， 因此， 免疫防治 该病就显得非常的重要。 0023 本发明从自然发病鱼体内进行了病原菌的分离鉴定与系统发育分析， 旨在明确该 病的病原， 为养殖生产中防治该病提供科学依据， 也为黄颡鱼红头病的免疫治疗提供了性。 0。

14、024 实施例一病原菌爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri) 的分离鉴定 0025 1 材料与方法 0026 1.1 试验鱼 0027 自然发病黄颡鱼采自四川眉山黄颡鱼养殖场 ； 健康黄颡鱼由通威股份有限公司四 川公司提供， 体重 60.54.3g。 0028 1.2 主要试剂 0029 培养基 ： TSA、 TSB、 TIS 和 BHI 按常规方法自制。 0030 细菌生化微量鉴定管 ： 购自杭州天和生物试剂有限公司。 0031 Taq DNA 聚合酶 ： 购自大连宝生物公司。 0032 PCR 引物 ： 大连宝生物公司合成。 0033 药敏纸片 ： 购自杭州天和生物试剂。

15、有限公司。 0034 1.3 细菌分离鉴定 0035 1.3.1 病原菌分离 ： 无菌操作从自然感染病鱼脑和肾取样， 划线接种于 TSA 与 BHI 说 明 书 CN 101829321 B 4 3/12 页 5 平板置于 28培养 48h， 挑取单个优势菌落在 BHI 平板上再次划线， 获得纯培养的 CHNGY01 与 CHNGY02 两菌株， 转接到 TSA 斜面培养基于 4保存备用。 0036 1.3.2 人工感染试验 ： 将分离菌株 CHNGY01 与 CHNGY02 接种 TSA， 28培养 48 后， 用无菌生理盐水洗下， 参照麦氏比浊管调整细菌浓度为 1.8108CFU/mL。健。

16、康黄颡鱼 20 尾 随机平均分成 2 组， 其中 1 组每尾鱼腹腔接种 0.1mL 菌液 ； 另外 1 组作为对照组每尾鱼注射 0.1mL无菌生理盐水。 接种后观察鱼的发病死亡情况， 并对死亡鱼及时剖检和致病菌的再次 分离。 0037 1.3.3 病原菌培养与形态特性检测 ： 参照有关甘肃农业大学 . 兽医微生物学实验 指导方法进行菌株 CHNGY01 与 CHNGY02 的生长温度、 耐盐性试验， 以及在普通琼脂平板、 TSA、 BHI、 兔血 TSA 平板上 28培养 48 小时后观察细菌的生长状况和菌落的大小、 形态等， 并以革兰氏染色光学显微镜观察细菌形态特征。 0038 1.3.4 。

17、病原菌生理、 生化特性检测 ： 各项生理生化指标的测定参照 2004 年版伯杰 氏细菌鉴定手册有关文献进行。 0039 1.416S rDNA 序列测定与系统发育分析 0040 1.4.1PCR 模板 DNA 的制备 ： 采用大连宝生物公司细菌 DNA 提取试剂盒进行细菌 DNA 模板制备。 0041 1.4.216S rDNA 序列扩增与测序 ： 采用 1 对扩增细菌 16S rDNA 的通用引物， 其上、 下游引物的序列分别为 ： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 和 5 -TACGGCTACCTTGTTACGAC-3 。 PCR 反应条件为 ： 94变性 5min， 然。

18、后 94 1min， 54 1min， 72 2min， 30 个循环， 最后 72延伸 10min。PCR 产物经 DNA 纯化系统纯化后， 送大连宝生物公司进行序列测定。 0042 1.4.3 系统发育树的构建 ： 将菌 CHNGY01 与 CHNGY02 的 16S rDNA 序列与 GenBank 中的已知核酸序列进行 Blast 分析， 调出与该序列相关性较高的核酸序列， 再采用 DNAstar 软件的 Megalign 软件包进行多序列比对和系统发育树构建。 0043 1.5 药敏实验 0044 采用纸片扩散法， CHNGY01 与 CHNGY02 菌接种 TSB 肉汤， 28震荡。

19、培养 48h， 将菌液 均匀涂布 TSA 平板， 帖上药敏纸片， 28培养 48h， 测量抑菌圈大小并判定结果。 0045 2. 结果 0046 2.1 人工感染试验 0047 试验组黄颡鱼在接种感染后， 表现为阵发行痉挛和旋转状游动， 24h 后陆续有鱼开 始死亡， 48h 后实验鱼全部死亡， 而对照组未见任何异常。死亡的黄颡鱼症状与病变与自然 发病的黄颡鱼相似， 表现为头部充血、 出血发红， 部分鱼表现为头顶局灶性发白， 随病程的 发展表现为溃疡 ； 下颌明显充血、 出血， 背鳍基部出血， 肛门红肿外突。剖解变化表现为腹 腔内可见淡黄色腹水， 肝肿大呈土黄色， 并见出血点， 脾、 肾肿大、。

20、 出血。 胃肠道粘膜充血、 出 血。从感染死亡鱼肾、 肝和脑内分离出与 CHNGY01、 CHNGY02 形态与生理生化一致的细菌， 表 明 CHNGY01 与 CHNGY02 是黄颡鱼红头的病原菌。 0048 2.2 形态与培养特性 0049 分离菌株 CHNGY01 与 CHNGY02 均为一种 G- 短杆菌。在 25 30的温度范围内具 有较弱的运动性， 而 37时则不具运动能力 ； 该菌在培养基上生长缓慢， 在 25 30条件 下培养 BHI 琼脂上需 28 36h， TSA 琼脂上需要 48h 才形成针尖大小的菌落， 而在 37时 说 明 书 CN 101829321 B 5 4/1。

21、2 页 6 生长不良 ； 不能忍受超过 1.5的盐浓度。 0050 2.3 生理生化特性 0051 生理、 生化特性测定发现CHNGY01与CHNGY02的特性是完全一致的， 对大多数糖都 不能利用产酸， 仅利用葡萄糖、 麦芽糖和 D- 甘露糖产酸， 对葡萄糖的氧化发酵在 20 30 才产气， 37时不产气。 其过氧化氢酶阳性， 细胞色素氧化酶阴性， 硝酸盐还原阳性， 吲哚与 甲基红实验阴性， 不能利用丙二酸盐与枸橼酸盐， H2S阴性， DNA酶与脂酶阴性。 详细的生理、 生化特性见表 1。 0052 表 1 菌株 CHNGY01 与 CHNGY02 的理化特征 0053 0054 注 ：“+。

22、” 为阳性，“-” 为阴性。 0055 2.416S rDNA 的 PCR 扩增结果与系统发育分析 0056 针对 CHNGY01 与 CHNGY02 菌株 PCR 扩增出的 16S rDNA 片段经琼脂糖电泳检测表 明其大小约 1500bp， 测序结果表明该片段有 1506bp 与 1513bp。将获得的序列与 GenBank 中已报道的16S rDNA序列进行Blast分析， 调出相关性最高的序列和水产常见致病菌如弧 菌 (Vibrio)、 温和气单胞菌 (Aeromonassobria)、 鲁氏耶尔森菌 (Yersinia ruckeri)、 迟钝 爱德华氏菌 (Edwardsiella。

23、tarda) 等相关菌株的 16S rDNA 序列用 DNAstar 软件进序列比 对分析和构建系统发育树 ( 图 1)， 结果表明 CHNGY01 与 CHNGY02 菌在系统发育数上与爱 德华菌 (Edwardsiella ictaluri) 聚为一簇， 其同源性在 99.4-99.6之间， 结合形态学和 说 明 书 CN 101829321 B 6 5/12 页 7 理化特征鉴定 CHNGY01 与 CHNGY02 菌为爱德华菌 (Edwardsiellaic taluri)( 图 2)。 0057 2.5 药敏实验 0058 由表 2 可知， CHNGY01 与 CHNGY02 菌株对。

24、氟苯尼考、 丁胺卡那霉素与强力霉素高度 敏感， 对庆大霉素、 卡那霉素、 妥布霉素、 左氟沙星、 环丙沙星、 恩诺沙星和丁胺卡那霉素等 中度敏感， 对氟哌酸、 四环素和头孢拉定等低度敏感， 对乙酰螺旋霉素、 阿莫西林和氨苄青 霉素等不敏感。 0059 表 2 菌株 CHNGY01 与 CHNGY02 药敏实验结果 0060 0061 注 ：“-” 表示不敏感，“+” 表示低度敏感，“+” 表示中度敏感，“+” 表示高度敏 感。 0062 3. 结论 0063 3.1 通过对自然感染 “红头病” 的黄颡鱼进行了病原菌的分离， 并采用形态、 生理生 化特性与16S rDNA序列进行分析， 发现黄颡。

25、鱼头病” 的病原菌为爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)。 0064 3.2 药 敏 实 验 检 测 结 果 发 现， 黄 颡 鱼 “红 头 病”的 病 原 菌爱 德 华 菌 (Edwardsiella ictaluri) 菌株对氟苯尼考、 丁胺卡那霉素与强力霉素高度敏感， 对庆大霉 素、 卡那霉素、 妥布霉素、 左氟沙星、 环丙沙星、 恩诺沙星和丁胺卡那霉素等中度敏感， 因此， 在养殖生产中， 发生该病可选用以上的药物进行治疗。 0065 发明人于 2009 年 8 月 8 日将分离到的 CHNGY01 菌株提交中国典型培养物保藏中 心保藏， 编号为 CCTCC NO ： 。

26、M209176。 0066 爱德华菌属 (Edwardsiella) 中一共有 3 个种即迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)， 爱德华菌 (Edwardsiella ictaluri)、 保科爱德华菌 (Edwardsiella hoshinae) 经过实验证明， 保科爱德华菌 (Edwardsiellahoshinae) 无致病性。 0067 实施例二爱德华菌 (Edwardsiella ictaluri) 标准菌株与本发明分离到的 CHNGY01 菌株的比较研究 0068 1 材料与方法 0069 1.1 菌种来源 0070 CHNGY01 株由通威药物研究所从四川眉。

27、山黄颡鱼养殖场分离鉴定的爱德华氏 说 明 书 CN 101829321 B 7 6/12 页 8 菌， 保藏编号为 CCTCC NO ： M209176。 0071 爱德华氏菌标准株菌株号为 ATCC 33202。 0072 1.2 主要试剂 ： 0073 细菌生化微量鉴定管 ： 购自杭州天和微生物试剂有限公司。 0074 培养基 ： 脑心浸液 (BHI) 购至北京路桥技术有限责任公司。 0075 1.3 菌液准备 0076 试验前， 用接种环从保存菌种的甘油菌液取菌液， 接种在脑心浸液 (BHI) 肉汤培 养基中， 28培养 24h， 取出作为原液备用。 0077 1.4 细菌的理化特性测定。

28、 0078 用移液器将菌液接种到微量生化鉴定管中， 28培养 24h。 0079 2 结果 0080 对爱德华氏菌 CHNGY01 与 ATCC33202 生理、 生化特性测定发现， 两者的特性基 本一致， 对大多数糖都不能利用产酸， 仅利用葡萄糖、 麦芽糖和 D- 甘露糖产酸。其过氧化 氢酶、 脲酶与赖氨酸脱羧酶阳性， 细胞色素氧化酶、 蛋白酶、 DNA 酶、 苯丙氨酸转氨酶与鸟氨 酸脱羧酶等阴性， 硝酸盐还原阳性， 不能利用丙二酸盐， H2S 阴性。但两者在枸橼酸盐利用 与甲基红实验上却存在差异， CHNGY01 在枸橼酸盐利用与甲基红实验上均为阳性， 而 ATCC 33202 却均为阴性。

29、。详细的生理、 生化特性见表 1。 0081 表 1 菌株 CHNGY01 与 ATCC33202 的理化特征 0082 0083 注 ：“+” 为阳性，“-” 为阴性。 说 明 书 CN 101829321 B 8 7/12 页 9 0084 3 结论 0085 本发明分离到的爱德华氏菌 (CHNGY01 即 CCTCC NO ： M209176) 与爱德华氏菌 标准株 (ATCC33202) 在生理生、 化特性上基本一致， 但两者在在枸橼酸盐利用与甲基红实 验上却存在差异， CHNGY01 在枸橼酸盐利用与甲基红实验上均为阳性， 而 ATCC33202 却均为 阴性。 0086 实施例三 。

30、0087 本发明菌株CHNGY01与爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的灭活全菌苗比 较研究 0088 黄颡鱼的 “红头病” 是近年来发生的危害较为严重的一种传染性疾病， 前面的研究 已证实其病原为爱德华氏菌。本实验进行了分离爱德华氏菌与标准株 ATCC33202 制 备的灭活疫苗对黄颡鱼红头病免疫效果的比较研究， 为黄颡鱼红头病更好的开展免疫防治 提供可靠的依据。 0089 1. 材料与方法 0090 1.1 菌种 0091 黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01) 分离并鉴定的来自然感染发生红头病的黄颡鱼 0092 爱德华氏菌标准菌株 (ATCC33202)ATCC 公司 0093 。

31、1.2 实验鱼 0094 购自四川新某养殖场的健康黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)， 平均体重 37.42.1g， 实验前于水族箱内驯养 1 周。 0095 1.3 疫苗的制备 0096 将黄颡鱼爱德华氏菌(CHNGY01)和爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)分别接 种 TSA 平板， 再用 PBS 洗下接种一系列的 TSB 肉汤经逐级增菌培养， 采用平板计数法确定细 菌浓度后， 用浓度为 0.5 (V/V) 福尔马林， 28灭活 48h， 制成全菌灭活疫苗。 0097 1.4 疫苗安全性检查 0098 将制备的灭活全菌苗接种绵羊鲜血TSA琼脂平板， 28恒温培。

32、养24-48h后观察平 板上是否有细菌菌生长以判定菌体疫苗中是否含有未灭活的病原菌 ； 同时采用腹腔注射的 方法， 将制备的菌体疫苗按正常接种量的5倍与10倍剂量接种健康黄颡鱼进行人工感染实 验， 接种后观察 15d， 检查菌体疫苗是否对健康黄颡鱼致病。 0099 1.5 实验分组 0100 将 100 尾健康黄颡鱼随机平均分成 5 组， 每组 20 尾。黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01)和爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)制备的灭活全菌疫苗分别采用浸泡与注 射两种免疫途径对黄颡鱼进行免疫， 同时采用生理盐水设置对照组。 0101 1.6 保护性实验 0102 免疫后 3 周， 采用黄。

33、颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01) 对免疫组与对照组的实验鱼进 行人工攻毒感染， 每尾实验鱼腹腔注射黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01)2.5108CFU/ml 病 原菌 0.1mL， 观察各实验组的发病死亡情况， 得出保护率。 0103 2. 结果 0104 2.1 疫苗的安全性 说 明 书 CN 101829321 B 9 8/12 页 10 0105 通过平板计数法得出福尔马林灭活疫苗中的含菌量为 4.51010CUF/mL。将该疫 苗 0.1mL 接种于绵羊鲜血 TSA 琼脂平板， 在 28下培养 24-48h， 未发现细菌生长。制备灭 活全菌疫苗对健康黄颡鱼进行攻毒感染， 观察 15。

34、d 未发现接种实验鱼发现异常。实验结果 表明浓度为 0.5 (V/V) 的福尔马林在 28条件下对病原菌进行 48h 的灭活， 能将病原菌 彻底灭活， 制备的疫苗是安全的。 0106 2.2 疫苗的保护性 0107 将黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01) 和爱德华氏菌标准菌株 (ATCC33202) 制备 的全菌灭活苗， 采用注射与浸泡两种免疫途径对健康黄颡鱼进行免疫 3 周后， 用黄颡鱼 爱德华氏菌 (CHNGY01) 对免疫后的实验鱼进行人工感染实验。结果发现 ： 黄颡鱼爱德华 氏菌 (CHNGY01) 制备的全菌灭活疫苗免疫黄颡鱼后对 “红头病” 的保护率明显高于爱德 华氏菌标准菌株 (。

35、ATCC33202) 制备的全菌灭活苗对黄颡鱼 “红头病” 的保护率。另外， 从表 1 也可看出， 在两种免疫途径中注射的免疫方式的免疫效果好于浸泡免疫途径。 0108 表1爱德华氏菌(CHNGY01)与标准菌株(ATCC33202)制备的疫苗的保护性比较 0109 0110 3. 结论 0111 本实验发现， 从自然感染发生红头病的黄颡鱼分离到的爱德华氏菌 (CHNGY01) 制备的全菌灭活苗经浸泡与注射两种方式免疫黄颡鱼后都能产生针对 “红头病” 的免疫力， 其保护率高于爱德华氏菌标准菌株 (ATCC33202) 制备的疫苗的保护率。该结果表明， 爱德华氏菌 (CHNGY01) 在免疫预防。

36、黄颡鱼 “红头病” 的疫苗制备上较爱德华氏菌标准菌 株 (ATCC33202) 具有更强的针对性和更大的应用价值。 0112 实施例四本发明灭活疫苗的制备与免疫效果研究 0113 本实验对从自然发病黄颡鱼体内分离的爱德华氏菌进行了灭活全菌苗的制备 与免疫效果的研究， 旨在为黄颡鱼 “红头病” 的免疫防治提供理论依据。 0114 1. 材料与方法 0115 1.1 材料 0116 黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01) 分离并鉴定的来自然感染发生红头病的黄颡鱼 0117 健康黄颡鱼 购自四川新津某养殖场， 平均体重 37.42.1g， 实验前于水族箱内 驯养 1 周。 0118 1.2 方法 说 。

37、明 书 CN 101829321 B 10 9/12 页 11 0119 1.2.1 疫苗的制备 0120 1.2.1.1 菌种复苏 0121 在无菌条件下， 取 4条件下保存的爱德华氏菌种用接种环从菌种管中挑取少 量细菌接种到 10ml TSB 肉汤， 将接种后的肉汤放入水浴振荡器中， 28， 110r/min， 振荡培 养 24h。 0122 1.2.1.2 菌液增殖培养 0123 初级培养 0124 把复苏培养的菌液10ml接种再次接种500ml TSB肉汤， 将接种后的肉汤放入水浴 振荡器中， 28， 110r/min， 振荡培养 48h。 0125 菌液次级培养 0126 将次级培养。

38、的 TSB 肉汤均匀的涂布在制备好的 TSA 平板上， 将涂布好的 TSA 平板 放入 28恒温培养箱中， 培养 48h( 注意培养时间以细菌苔长满整个平板为度 ) ； 在无菌工 作室， 用灭菌的生理盐水 (0.85 NaCl) 冲洗平板上生长的菌苔， 将洗下的菌悬液置于灭菌 的输液瓶中。 0127 洗脱菌液扩大培养 0128 将从平板上洗脱的菌液按每 10ml 接种 200mlTSB 肉汤， 进行菌液的扩大培养， 28， 110r/min， 振荡培养 48h。得到高浓度细菌悬液。 0129 1.2.1.3 菌液的计数 0130 对增殖培养后的菌液采用平板稀释细菌计数方法进行计数 0131 选。

39、取大小一致的平板清洗高压灭菌后， 制备 TSA 平板备用 ； 0132 无菌操作将在菌苗制备过程中取的菌液进行倍比 (10n) 稀释备用 ； 0133 将稀释的菌液取 0.1mL 涂布 TSA 平板， 28， 恒温箱中培养 36 小时， 计数菌落个 数 ； 0134 选择平均菌落数在 30-300 个之间稀释度的平板， 以该稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数， 则为该菌样的细菌总数。 0135 菌落数 稀释度 10 细菌总数 0136 1.2.1.4 菌液的灭活 0137 对扩大培养的菌液， 按体积比例添加 5-6的甲醛， 放入水浴振荡器中， 28， 110r/min， 振荡 48h 灭活。 0。

40、138 1.2.1.5 菌苗的分装 0139 灭活完全的疫苗， 无菌操作进行分装于 500ml 灭菌高温瓶中， 并对橡胶塞有孔隙 的应采用石蜡封闭。分装好的灭活疫苗应置于 4保存， 备用。 0140 1.2.2 疫苗安全性检查 0141 将制备的灭活全菌苗接种绵羊鲜血TSA琼脂平板， 28恒温培养24-48h后观察平 板上是否有细菌菌生长以判定菌体疫苗中是否含有未灭活的病原菌 ； 同时采用腹腔注射的 方法， 将制备的菌体疫苗按正常接种量的5倍与10倍剂量接种健康黄颡鱼进行人工感染实 验， 接种后观察 15d， 检查菌体疫苗是否对健康黄颡鱼致病。 0142 1.2.3 实验分组 0143 将 2。

41、40 尾健康黄颡鱼随机平均分成 12 组， 每组 20 尾。将制备的灭活全菌疫苗 10 说 明 书 CN 101829321 B 11 10/12 页 12 倍逐级稀释， 分别采用浸泡与注射两种免疫途径对黄颡鱼进行免疫， 同时采用生理盐水设 置对照组 ( 表 1)。 0144 1.3 保护性实验 0145 免疫后 3 周， 采用黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01) 对免疫组与对照组的实验鱼进 行人工攻毒感染， 每尾实验鱼腹腔注射黄颡鱼爱德华氏菌 (CHNGY01)2.5108CFU/ml 病 原菌 0.1mL， 观察各实验组的发病死亡情况， 得出保护率， 评定疫苗的免疫效果。 0146 2. 。

42、结果 0147 2.1 疫苗的安全性 0148 经平板计数法得出福尔马林灭活疫苗中的含菌量为 4.51010CUF/mL。将该疫苗 0.1mL接种于绵羊鲜血TSA琼脂平板， 在28下培养24-48h， 未发现细菌生长。 制备灭活全 菌疫苗对健康黄颡鱼进行攻毒感染， 观察 15d 未发现接种实验鱼发现异常。实验结果表明 浓度为 0.5 (V/V) 的福尔马林在 28条件下对病原菌进行 48h 的灭活， 能将病原菌彻底 灭活， 制备的疫苗是安全的。 0149 2.2 疫苗的保护性 0150 黄颡鱼注射与浸泡免疫 3 周后， 用爱德华氏菌 (CHNGY01) 对免疫后的实验鱼进 行人工感染实验。结果。

43、发现 ： 制备的爱德华氏菌 (CHNGY01) 全菌灭活疫苗经浸泡与注 射免疫黄颡鱼后能产生抵抗 “红头病” 的能力， 但不同的免疫方式中适宜的抗原浓度上存 在差异， 在浸泡免疫中灭活疫苗的菌体浓度在 107-108CFU/ml 较为适宜， 而注射时其浓度在 106-107CFU/ml 则较为适宜。另外， 从表 1 也可看出， 在两种免疫途径中注射的免疫方式的 免疫效果好于浸泡免疫途径。 0151 表 1爱德华氏菌 (CHNGY01) 灭活疫苗免疫后的保护情况 0152 0153 3. 结论 0154 从自然感染发生红头病的黄颡鱼分离到的爱德华氏菌 (CHNGY01) 制备的全菌 灭活苗具有较。

44、好的免疫原性， 经浸泡与注射两种方式免疫黄颡鱼后都能产生针对 “红头病” 说 明 书 CN 101829321 B 12 11/12 页 13 的免疫力， 其保护率在 70-95之间， 浸泡免疫中灭活疫苗的菌体浓度在 107-108CFU/ml 较 为适宜， 而注射时其浓度在 106-107CFU/ml 则较为适宜。 0155 实施例五灭活疫苗水剂的制备 0156 1爱德华氏菌灭活疫苗的制备 0157 (1) 菌种复苏 0158 在无菌条件下， 取 4条件下保存的爱德华氏菌种用接种环从菌种管中挑取少 量细菌接种到 10ml TSB 肉汤， 将接种后的肉汤放入水浴振荡器中， 28， 110r/m。

45、in， 振荡培 养 24h。 0159 (2) 菌液增殖培养 0160 初级培养 0161 把复苏培养的菌液10ml接种再次接种500ml TSB肉汤， 将接种后的肉汤放入水浴 振荡器中， 28， 110r/min， 振荡培养 48h。 0162 菌液次级培养 0163 将次级培养的 TSB 肉汤均匀的涂布在制备好的 TSA 平板上， 将涂布好的 TSA 平板 放入 28恒温培养箱中， 培养 48h( 注意培养时间以细菌苔长满整个平板为度 ) ； 在无菌工 作室， 用灭菌的生理盐水 (0.85 NaCl) 冲洗平板上生长的菌苔， 将洗下的菌悬液置于灭菌 的输液瓶中。 0164 洗脱菌液扩大培养。

46、 0165 将从平板上洗脱的菌液按每 10ml 接种 200mlTSB 肉汤， 进行菌液的扩大培养， 28， 110r/min， 振荡培养 48h。得到高浓度细菌悬液。 0166 (3) 菌液的计数 0167 对增殖培养后的菌液采用平板稀释细菌计数方法进行计数 0168 选取大小一致的平板清洗高压灭菌后， 制备 TSA 平板备用 ； 0169 无菌操作将在菌苗制备过程中取的菌液进行倍比 (10n) 稀释备用 ； 0170 将稀释的菌液取 0.1mL 涂布 TSA 平板， 28， 恒温箱中培养 36 小时， 计数菌落个 数 ； 0171 选择平均菌落数在 30-300 个之间稀释度的平板， 以该。

47、稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数， 则为该菌样的细菌总数。 0172 菌落数 稀释度 10 细菌总数 0173 疫苗中含有的细菌数合适的浓度为 108-1010CFU/ml。 0174 (4) 菌液的灭活 0175 对扩大培养的菌液， 按体积比例添加 5-6的甲醛， 放入水浴振荡器中， 28， 110r/min， 振荡 48h 灭活。 0176 (5) 灭活效果检查 0177 灭活后的菌悬液每次需进行灭活效果的检查， 在无菌操作下用接种环挑取少量灭 活的菌苗在 TSA 平板上划线， 将划线后的血平置于入 28恒温培养箱中， 培养 48h， 检查有 无细菌生长， 若有细菌生长需再进行灭活处理， 。

48、若无细菌生长则进行下面的操作程序。 0178 (6) 菌苗的分装 0179 灭活完全的疫苗， 无菌操作进行分装于 500ml 灭菌高温瓶中， 并对橡胶塞有孔隙 说 明 书 CN 101829321 B 13 12/12 页 14 的应采用石蜡封闭。分装好的灭活疫苗应置于 4保存， 备用。 0180 制备成水剂时， 使用时可以与 10mg/l 的氮酮促渗剂联合应用， 可同时混合使用， 也可分别施用。 0181 实施例六灭活疫苗粉剂的制备 0182 (1) 冷冻干燥法 0183 将无菌操作条件下分装好的福尔马林灭活联合全菌疫苗水溶液， 放入真空冷冻干 燥机进行预冻， 待预冻达到一定温度时抽真空干燥。 冻干结束后， 充入干燥无菌的空气进入 干燥箱， 然后尽快地进行加塞封口， 以防重新吸收空气中水分。 0184 (2) 低温烘干法 0185 将无菌条件下分装好的福尔马林灭活全菌联合疫苗水溶液在低温条件下进行水 分蒸发烘干， 加入吸附剂沸石或硅藻土低。